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Bioengineering

Développement de dispositifs microfluidiques pour étudier la capacité d’élongation de la pointe de croissance des cellules végétales dans des espaces très réduits

Published: May 22, 2018 doi: 10.3791/57262
Automatic Translation
1, 2, 1,2, 2
1Division of Biological Science, Graduate School of Science, Nagoya University, 2Institute of Transformative Bio-Molecules (ITbM), Nagoya University

Summary

Les auteurs décrivent une méthode pour étudier la capacité de pointe de plus en plus des cellules végétales, y compris les tubes polliniques, les poils et de la mousse protonéma, à s’allonger à travers des ouvertures très étroites (~ 1 µm) dans un dispositif microfluidique.

Abstract

In vivo, astuce-culture de cellules végétales doivent surmonter une série d’obstacles physiques ; Toutefois, les chercheurs n’ont pas la méthodologie afin de visualiser le comportement cellulaire dans de telles conditions restrictives. Pour résoudre ce problème, nous avons développé des chambres de croissance pour pointe-croissance des cellules végétales qui contiennent une série de lacunes étroits, fabriqués en micro (~ 1 µm) dans un substrat de poly-diméthylsiloxane (PDMS). Ce matériau transparent permet à l’utilisateur de surveiller les processus d’élongation Astuce dans des cellules individuelles lors de la faible pénétration par imagerie de Time-lapse. En utilisant cette plate-forme expérimentale, nous avons observé des changements morphologiques dans les tubes polliniques comme ils ont violé le faible. Nous avons capturé les changements dynamiques sous la forme d’un noyau végétatif fluorescent étiqueté et les spermatozoïdes dans un tube de pollen au cours de ce processus. En outre, nous avons démontré la capacité des poils absorbants et mousse protonéma de pénétrer l’écart de 1 µm. Cette plate-forme in vitro peut être utilisée pour étudier comment les cellules répondent aux espaces physiquement contraints et peut apporter un éclairage sur les mécanismes de croissance apicale.

Introduction

Après que les grains de pollen germent sur un stigmate, chaque grain produit un seul tube pollinique qui transporte les spermatozoïdes à l’oosphère et la cellule centrale de l’ovule pour la double fécondation. Les tubes polliniques s’allongent à travers le style et finissent par atteindre l’ovule en détectant des repères d’orientation multiples le long de leurs voies1. Au cours de l’élongation, tubes polliniques rencontrent une série d’obstacles physiques ; la voie de transmission est remplie de cellules, et les tubes polliniques doit entrer la minute ouverture micropylaire de l’ovule pour atteindre leur cible (Figure 1 a)2. Par conséquent, les tubes polliniques doit avoir la capacité de pénétrer les obstacles physiques, tout en tolérant la contrainte de compression de leur environnement. Les poils sont un autre type de cellule végétale productrices de pointe qui doit résister à des obstacles physiques dans l’environnement, sous forme de particules de terre battue (Figure 1 b).

Différentes propriétés mécaniques du tube pollinique ont été étudiées, y compris la pression de turgescence et la rigidité de la région apicale de la cellule, qui peut être mesurée au moyen du début de la plasmolyse méthode3,4 et microscopie à force cellulaire (CFM) 5 , 6, respectivement. Cependant, ces méthodes seuls ne révèlent pas si les tubes polliniques sont capables d’allonger à travers des barrières physiques le long de leur parcours de croissance. Une autre technique qui permet l’allongement du tube pollinique d’être surveillé en vivo est deux photons microscopie7. Cependant, avec cette méthode, il est difficile d’observer les changements morphologiques dans les tubes polliniques individuels à l’intérieur du tissu de l’ovule. En outre, la croissance des cheveux de la racine dans le sol peut être visualisée à l’aide de la radiographie calculée par tomodensitométrie (TDM) et l’imagerie par résonance magnétique (IRM)8, mais avec une résolution faible. Nous présentons ici une méthode qui permet d’acquérir des images à haute résolution du processus de déformation de la cellule sur un microscope conventionnel.

L’objectif global de la méthode décrite ici consiste à visualiser la capacité d’allongement des Astuce croissance des cellules végétales, y compris les tubes polliniques, les poils et de la mousse protonéma, dans des espaces très réduits. Comme les micro-dispositifs poly-diméthylsiloxane (PDMS) présentées dans ce manuscrit sont optiquement transparents et air perméable, nous pouvons la culture de cellules vivantes à l’intérieur de l’appareil et observer leurs comportements de croissance sous un microscope. Il est également possible de créer des micro ~ espaces échelle nanométrique par la technique de lithographie douce9 avec l’utilisation de moules. Ces caractéristiques nous permettent d’étudier la capacité d’allongement des Astuce croissance des cellules végétales en milieu confiné physiquement.

Dans ce travail, nous construit 1 µm et grandes lacunes (4 µm de hauteur) dans des dispositifs microfluidiques et examiné la capacité des tubes polliniques de pénétrer ces obstacles artificiels qui sont beaucoup plus petits que le diamètre du tube pollinique cylindrique (environ 8 µm). Cette plate-forme expérimentale nous permet de visualiser la réponse du tube pollinique de microgaps et de capturer des images de la réponse, Time-lapse qui suivre les processus de déformation de la cellule. Nous avons également élaboré les micro-dispositifs qui peut être utilisé pour étudier la capacité de pénétration des poils absorbants et protonéma de mousse. Plusieurs microdevices ont été signalés à ce jour permettant la visualisation de la racine10,11,12,13 et moss protonéma14 croissance végétale à haute résolution. Dans notre dispositif, une série de canaux de croissance de cheveux de la racine sont connectés perpendiculairement à une chambre de croissance des racines et radicelles individuels (environ 7 µm de diamètre) sont guidés vers les canaux fluidiques avec un grand écart de 1 µm. Nous avons cultivé aussi mousse protonéma (environ 20 µm de diamètre) dans un MICRODISPOSITIF contenant microgaps afin d’examiner leurs réponses à ces barrières physiques. L’approche proposée par microfluidique permet d’explorer la capacité des différentes cellules végétales astuce-de plus en plus à s’allonger dans des espaces extrêmement faibles, qui ne peuvent être examinées par toute autre méthode actuellement disponible.

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Protocol

1. fabrication de la MICRODISPOSITIF PDMS pour étudier la croissance des Tubes polliniques et point de riz protonéma

NOTE : Nous avons utilisé un instrument sans masque photolithographie pour préparer des moules PDMS sur des plaquettes de silicium. Les détails concernant le fonctionnement du système sont omises dans ce manuscrit. Une technique de photolithographie standard9 à l’aide d’un photomasque peut également être utilisé pour créer les moules PDMS décrits dans ce manuscrit.

  1. Verser 11 g de mélange PDMS prépolymère (élastomère de base : polymérisation agent à un ratio de 10:1) dans chaque moule de 4 pouces.
  2. Dégazer le moule préparé à l’étape 1.1 pendant 20 min dans une chambre à vide.
  3. Après durcissement à 65 ° C pendant 90 min dans un four sans convection, éplucher la couche PDMS hors du moule et percer des trous d’accès dans les circuits fluidiques à l’aide de poinçons de biopsie.
    Remarque : Pour le dispositif du tube pollinique, la taille du trou doit être ajustée pour tenir compte du diamètre du pistil. Cette valeur va donc varier par espèce. Dans cette expérience, nous avons perforé un trou de 1 mm pour les entrées de pistil et trous de 1,5 mm pour les réservoirs moyens liquides. Pour le dispositif de protonéma moss, un trou de 4 mm a été utilisé pour le réservoir de l’échantillon.
  4. Exposer la couche PDMS et un plat en verre bas (3,5 à 5 cm de diamètre) dans le pour atmosphère de plasma pour 50 s.
  5. Appuyez sur la couche PDMS dans le plat en verre bas et chauffer à 65 ° C pendant 30 min dans un four sans convection d’isoler complètement le réseau microfluidique.

2. fabrication de la MICRODISPOSITIF PDMS pour poils absorbants

  1. Répétez les étapes 1.1 à 1.3, en utilisant les moules pour préparer deux couches PDMS à la racine et les poils absorbants microdevices.
    NOTE : Nous avons utilisé un trou de 2 mm pour les réservoirs liquides moyens dans le MICRODISPOSITIF de racine.
  2. Exposer les deux couches PDMS air plasma pour 50 s.
  3. Assembler les deux couches PDMS sous un stéréomicroscope utilisant un aligneur de bureau sur mesure.
    Remarque : Les microcanaux sur ces couches PDMS doivent faire face à l’autre. Avant le montage, s’assurer que les repères sur les deux couches s’alignent.
  4. Chauffer à 65 ° C pendant 30 min dans un four sans convection d’isoler complètement le réseau microfluidique.
  5. Retirer la lamelle couvre-objet de la MICRODISPOSITIF construite et placez l’appareil sur un plat de fond de verre qui est de 5 cm de diamètre.

3. préparation du milieu de Culture cellulaire In Vitro pour les Tubes polliniques (Torenia fournieri)

  1. Préparer le milieu de Nitsch modifiée comme décrit plus haut15 et stériliser le milieu à 121 ° C pendant 20 min.
    Remarque : La composition du milieu de la Nitsch modifed est NH4NO3 (80 mg/L), le KNO3 (125 mg/L), le Ca (NO3)2‧4H2O (500 mg/L), MgSO4‧7H2O (125 mg/L), KH2PO4 (125 mg/L ), MnSO4‧4H2O (3 mg/L), ZnSO4‧7H2O (0,5 mg/L), H3BO3 (10 mg/L), CuSO4‧5H2O (0,025 mg/L), Na2MoO4‧2H2O (0,025 mg/L), saccharose (50 000 mg/L) et la caséine (500 mg/L). Le prêt moyen peut être stocké à 4 ° C pendant 4 mois au moins.
  2. Préparer le polyéthylèneglycol de 26 % (p/v) à l’aide de l’eau désionisée autoclavé et filtrer la solution avec un filtre de porosité de 0,3 µm.
    Remarque : Le support préparé peut être stocké à 4 ° C pendant 1 mois.
  3. Mélanger les réactifs préparés à l’étape 3.1 et 3.2 dans un ratio de 1:1 (v/v).
    NOTE : Ce support doit être préparé fraîche pour chaque utilisation.

4. préparation du milieu de Culture cellulaire In Vitro pour les poils absorbants (Arabidopsis thaliana)

  1. Préparer une solution de saccharose de 0,215 % (p/v) milieu de Murashige et Skoog moyenne, 0,05 % (p/v) MES, de 1 % (p/v) et 1 % (p/v) d’agar dans de l’eau désionisée. Autoclave la solution à 121 ° C pendant 20 min.

5. préparation du milieu de Culture cellulaire In Vitro pour Moss protonéma (Physcomitrella patens)

  1. Les incuber le protonéma de mousse en BCDAT moyenne16 dans une boîte de Pétri.
    Remarque : La composition du milieu BCDAT est 1 mM MgSO4, 10 mM KNO3, 45 µM FeSO4, 1,8 mM KH2PO4 (pH ajusté à 6.5 avec KOH), solution d’oligo-éléments (0,22 µM CuSO4, 0,19 µM ZnSO4, 10 µM H3BO 3, 0,1 µM Na2MoO4, 2 µM MnCl2, 0,23 µM CoCl2et 0,17 µM KI), 1 mM CaCl2et 5 mM diammonium (+)-tartrate.
  2. Culture de la mousse dans le milieu BCDATG dans le MICRODISPOSITIF.
    NOTE : Le support BCDATG est BCDAT moyenne de 0,5 % (p/v) de glucose. Le prêt moyen peut être stocké à 4 ° C pendant 1 mois.

6. in Vitro Culturing des Tubes polliniques fournieri T. dans la MICRODISPOSITIF

  1. Placer le tube pollinique MICRODISPOSITIF dans une chambre à vide et dégazer pendant 20 min.
  2. Enlever le MICRODISPOSITIF de la chambre à vide et d’introduire le milieu de croissance à l’entrée du pistil à l’aide d’une micropipette avec une pointe très fine. Remplir les puits restants à leur partie supérieure avec le même milieu. Attendez quelques minutes jusqu'à ce que tous les microcanaux sont remplis avec le milieu grâce à la dépression créée à l’intérieur les microcanaux.
  3. Placer une serviette de papier humide dans le plat de fond de verre pour maintenir l’humidité dans le plat.
  4. Transférer les grains de pollen d’un sauvage fournieri T. fleur « bleu et blanc » à ses stigmates à l’aide d’une aiguille de dissection.
    NOTE : Nous avons également effectué cette expérience avec un transgénique fournieri T. « Couronne violet » fleur (le RPS5Ap::H2B-tdTomato ligne17), avec des tubes polliniques contenant les spermatozoïdes fluorescent étiquetés et noyaux végétatifs.
  5. Couper le style pollinisée (1 cm de long) à l’aide d’une lame.
  6. Insérer le style coupé dans l’entrée de l’appareil, tel qu’illustré à la Figure 2.
  7. Mettez un couvercle sur le plat et scellez-la avec du ruban adhésif.
  8. Placez l’appareil dans un incubateur à 28 ° C pendant 5-6 h dans l’obscurité.

7. in Vitro Culturing des poils absorbants Arabidopsis dans le MICRODISPOSITIF

Remarque : Les étapes 7.1-7,9 (à l’exception de 7.3 et 7.5) devraient être effectuées sous une hotte à flux laminaire.

  1. Stériliser les graines de la Colombie a. thaliana (Col-0) et les transgéniques ligne UBQ10pro::H2B-mClover (contenant le marqueur fluorescent nucléaire) en les trempant dans un liquide stérile (eau de Javel domestique 5 % (v/v) et 0,02 % (v/v) X-100 Triton) pendant 5 min.
  2. Bien rincer les graines stérilisés avec de l’eau stérilisés à l’autoclave.
  3. Stocker les graines rincés dans l’eau pendant 2 jours à 4 ° C dans l’obscurité.
  4. Stériliser le MICRODISPOSITIF sous la lumière ultraviolette du jour au lendemain.
  5. Placer le MICRODISPOSITIF dans une chambre à vide et dégazer pendant 20 min.
  6. Introduire le substrat de croissance pour les puits dans l’appareil à l’aide d’une micropipette. Attendez quelques minutes jusqu'à ce que le vide remplit tous les microcanaux avec le milieu.
  7. Placez un essuie-tout humide autoclavés dans le plat de fond de verre pour maintenir l’humidité dans le plat.
  8. Transférer une graine stérilisée dans l’entrée de l’appareil.
  9. Mettez un couvercle sur le plat et scellez-la avec du ruban adhésif.
  10. Placez l’appareil verticalement dans un incubateur à 22 ° C sous un éclairage blanc continu.
  11. Contrôler la croissance des cheveux de la racine après 4 à 10 jours d’incubation. Obtenir le champ lumineux et fluorescents images à l’aide d’un microscope inversé.

8. in Vitro Culturing du P. patens (moss) protonéma dans le dispositif microfluidique

Remarque : Les étapes 8.2-8,6 (à l’exception de 8,3) devraient être effectuées sous une hotte à flux laminaire.

  1. Préculture P. patens souche Gransden 200418 sur milieu BCDAT recouvert de cellophane dans une boîte de Pétri pendant une semaine sous une lumière blanche continue à 25 ° C.
  2. Stériliser le MICRODISPOSITIF sous la lumière UV du jour au lendemain dans une hotte à flux laminaire.
  3. Placer le MICRODISPOSITIF dans une chambre à vide et dégazer pendant 20 min.
  4. Introduire le substrat de croissance pour les puits à l’aide d’une micropipette. Attendez quelques minutes jusqu'à ce que le vide remplit tous les microcanaux avec le milieu.
  5. Ajouter l’eau stérilisés à l’autoclave dans la capsule qui entoure la MICRODISPOSITIF pour maintenir l’humidité dans le plat.
  6. Transférer un petit morceau de tissu de protonéma de mousse à l’entrée de la MICRODISPOSITIF et la culture du tissu dans un incubateur à 25 ° C sous un éclairage blanc continu.
  7. Vérifier la croissance de protonéma de mousse après 2-3 semaines d’incubation. Obtenir des images de champ lumineux à l’aide d’un microscope.

9. Time-lapse imagerie de la croissance du Tube pollinique fournieri T.

  1. Placez le MICRODISPOSITIF sur un microscope à fluorescence inversé équipé du matériel d’acquisition image (e.g., une caméra CCD) et de logiciels. Trouver les endroits de faible.
    Remarque : Pour le logiciel d’acquisition image, nous avons utilisé un produit disponible dans le commerce (Table des matières). Logiciel de microscopie Open source tels que µManager est également disponible en ligne (https://micro-manager.org/wiki/Micro-Manager). Nous vous recommandons d’installer un condenseur de microscope sur la loupe pour obtenir des images de résolution supérieure.
  2. Capturer des images de champ lumineux toutes les 10 s en utilisant le logiciel d’acquisition image microscope.
  3. Pour observer les cellules du sperme fluorescent étiquetés et noyau végétatif dans le tube pollinique de la ligne de RPS5Ap::H2B-tdTomato , irradier l’échantillon avec 561 laser nm et utiliser un filtre optique passe-bande (578/105 nm).
    Remarque : Bien que les images de Time-lapse de la croissance du tube pollinique ont été capturés fréquemment, l’imagerie ne semble pas affecter la croissance. Toutefois, il est toujours recommandé pour réduire l’intensité du laser, durée d’exposition et l’intervalle Time-lapse, de minimiser la phototoxicité et photoblanchiment du fluorophore.
  4. Ajuster la luminosité et le contraste des images et de préparer un fichier vidéo à l’aide de logiciels ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/).

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Representative Results

Tel qu’illustré à la Figure 1, pointe-culture de cellules végétales rencontrent une série de barrières le long de leurs voies de croissance in vivo. L’in vitro cell culture plateformes microfluidiques présentés dans cette étude a permis l’examen le de la culture pointe de process en trois types de cellules végétales (tubes polliniques, poils absorbants et mousse protonéma) par des fentes artificielle de 1 µm (Figure 3, Figure 4et Figure 5). Pour l’étude du tube pollinique, imagerie de cellules vivantes a été utilisé pour surveiller les changements morphologiques dans la région apicale des tubes polliniques ainsi que le noyau végétatif et les spermatozoïdes en réponse à rencontrer un espace tout petit (Supplemental Movie 1 et 2).

Bien que la majeure partie de la microgaps ont été fabriqués avec succès en utilisant la méthode décrite ici, nous avons remarqué que certains d'entre eux ont été complètement fermé (Figure 6). Parce que les canaux large de 1µm créés sur le moule silicone sont fragiles, l’utilisation répétée de ce moule risquerait d’endommager les lacunes, conduisant à l’écart de blocage sur la couche PDMS. Par conséquent, avant d’effectuer l’expérience, il est important de vérifier que les microgaps PDMS sont intacts.

Figure 1
Figure 1 : la pénétration de la culture pointe de cellules végétales en espaces physiquement contraints. (A) tube pollinique allongeant à travers plusieurs barrières physiques sur son chemin vers l’ovule. Obstacles, mentionnons transmettant des tissus des voies dans le style et les téguments entourant le micropyle. (B) les poils absorbants pénétrant dans le sol dense. Encarts dans (A) et (B) montrent les élargissements des régions en boîte. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Caractéristiques de la microdevices utilisé pour étudier les tubes polliniques fournieri T. , a. thaliana racine poils et P. patens protonéma. Dans les schémas de microcanaux, un échantillon est placé à l’emplacement indiqué par un astérisque (*). Microchannel dessins, des photographies de chaque appareil, les structures de canal et périodes de culture de cellules sont résumées. Ce chiffre a été modifié avec la permission de Yanagisawa et al. 19de 2017. Balance bar, 20 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : T. fournieri tube pollinique allongement par un trou de 1 µm. (A) tube pollinique en passant par un écart élevé de 1 µm µm de large et 4. Les images de Time-lapse champ lumineux ont été capturées à l’aide d’un microscope inversé équipé d’un système confocal de filature-disque. Echelle, 20 µm. (B) des images d’un noyau végétatif fluorescent étiqueté et les spermatozoïdes dans un tube pollinique de l' RPS5Ap::H2B-tdTomato ligne traversant le faible. Barre de l’échelle, 20 µm. Figure (A) et (B) ont été modifiés avec la permission de Yanagisawa et al. 19de 2017. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
La figure 4. A. thaliana racine cheveux élongation dans une brèche de µm 1. (A) croissance des racines et des poils absorbants dans le MICRODISPOSITIF. Les microgaps (1 µm de largeur) et 4 µm de hauteur sont situés sur le côté gauche de la voie de la croissance de racine. Les microcanaux sur le côté droit ne contiennent pas de microgaps et peuvent être utilisés comme un contrôle. Barre d’échelle, 100 µm. (B) champ lumineux, fluorescence (C) et (D) fusionnent images des poils absorbants, en passant par le microgaps. Les noyaux dans les poils absorbants sont étiquetés fluorescent dans la ligne de UBQ10pro::H2B-mClover . La pointe de chaque poil est indiquée par une flèche. Echelle, 30 µm. Ces chiffres ont été modifiés avec la permission de Yanagisawa et al. 19de 2017. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
La figure 5. Élongation protonéma P. patens dans une brèche de µm 1. Cellules de protonéma traversant un écart de 1 µm (4 µm de hauteur), qui a été élargi en raison de la pression de turgescence du protonéma au point de riz. Echelle, 20 µm. La figure a été modifiée avec la permission de Yanagisawa et al. 19de 2017. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6. Fermé microgaps. Image de SEM de la région de gap 1 µm. La faible sur la droite est complètement fermée. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Film supplémentaire 1. Croissance du tube pollinique par une lacune µm 1. Time-lapse champ lumineux images ont été captées toutes les 10 s à l’aide d’un microscope inversé équipé d’un microscope confocal de disque de filature. Balance bar, 20 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Film supplémentaire 2. Pénétration du noyau végétatif et spermatozoïdes grâce à un écart µm 1. Time-lapse images lumineuses de champ et de fluorescence ont été capturés toutes les 20 s à l’aide d’un microscope à fluorescence inversé. Balance bar, 20 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

Plusieurs étapes cruciales dans le protocole doivent être suivies avec précision afin d’obtenir les résultats présentés ci-dessus. Tout d’abord, les PDMS couche verre fond plat des surfaces et doivent tous deux être traités avec plasma pendant une durée suffisante avant collage. Dans le cas contraire, la couche PDMS peut se détacher localement de la surface du verre, tandis que les cellules productrices de pointe traversent le microgaps. Une autre étape cruciale dans le protocole de protonéma de poils absorbants et moss est la stérilisation de la MICRODISPOSITIF. Normalement, les poils et moss protonéma cellules doivent être cultivées dans le MICRODISPOSITIF pendant quelques semaines. Sans l’appareil de stérilisation, micro-organismes peuvent s’épanouir, qui pourraient affecter la croissance de ces cellules productrices de pointe. Stérilisation de l’appareil tube pollinique n’est pas aussi critique, étant donné que l’expérience est conclue au sein d’une demi-journée. Nous avons utilisé régulièrement de l’appareil tube pollinique sans stérilisation et n’a pas observé d’éventuels effets indésirables au cours de l’expérience.

La conception de microcanaux doit être modifiée selon les cellules d’intérêt. Dans notre travail, la conception de canaux utilisée pour l’expérience de poils absorbants d’a. thaliana était différente de celle utilisée pour le tube pollinique fournieri T. et les expériences de protonéma P. patènes . Différents dispositifs sont nécessaires parce que les échantillons ont des dimensions différentes ; par exemple, les poils sont beaucoup plus courts que les tubes polliniques et protonéma de mousse. Par conséquent, notre dispositif de poils absorbants visait tels que les régions de faible étaient adjacentes à la chaîne de racine principale. Outre la conception de la chaîne, la procédure de préparation de l’appareil de poils absorbants varie également de procédures utilisées pour les tubes polliniques ou mousse protonéma. Pour les études de protonéma tube pollinique et la mousse, nous avons utilisé un MICRODISPOSITIF contenant une seule couche PDMS avec les microcanaux scellés contre un plat de fond de verre. Toutefois, le dispositif utilisé pour étudier les poils absorbants comporte deux couches PDMS : la couche supérieure avec un microchannel (profondeur : 200 µm) pour la racine principale est scellée contre la couche de fond, contenant des microcanaux (profondeur : 4 µm) pour les poils absorbants. La technique de photolithographie standard qui a été utilisée pour fabriquer le moule silicone est limitée à un allongement d’autour de 5:1. Par conséquent, pour créer un espace large de 1 µm, la hauteur du canal sera limitée à environ 5 µm. Il est également techniquement difficile d’aligner précisément un chenal profond (e.g., 200 µm) près de le 1 écart µm sur un moule de silicone. Par conséquent, nous préparé PDMS des calques distincts pour la racine principale et les poils absorbants et construit l’appareil en scellant leur ensemble.

Alors que ce protocole a été utilisé avec succès pour visualiser le processus des tubes polliniques par le biais de la microgaps (supplémentaire film 1 et 2), Time-lapse imagerie des poils absorbants cultivait et allongement de protonéma de mousse à la région faible serait plus un défi. Dans le MICRODISPOSITIF utilisé pour la culture des poils absorbants Arabidopsis , la hauteur des canaux secondaires où les microgaps sont situés (4 µm) est beaucoup moins profonde que celui de la chambre de croissance racinaire (200 µm), donc la plupart des poils absorbants sont incapables d’agir dans les chenaux secondaires. Même si les poils trouvez l’entrée du chenal côté, il est difficile de prédire quand ils vont y entrer. Pour capturer des images de Time-lapse de la croissance des cheveux de la racine à la faible, nous recommandons d’utiliser un microscope équipé d’une scène automatisée qui peut être programmée pour se situer à postes multiples pour l’acquisition d’images. Lorsque ces instruments n’est pas disponible, nous vous suggérons de chercher les poils absorbants qui sont déjà entrés dans les chenaux secondaires mais n’ont pas encore traversé la microgaps. Étant donné que le taux de croissance des poils absorbants a. thaliana est beaucoup plus lent (typiquement 1 à 2,5 µm/min20) que celui des tubes polliniques de T. fournieri (généralement 22 et 23 µm/min19), il peut être possible de saisir des images de Time-lapse de ces poils absorbants qui sont sur le point de traverser le microgaps. En revanche, point de riz protonéma observations exigent un système de Time-lapse qui peut être utilisé exclusivement pour cette étude, car il faut une période d’observation prolongée en raison du taux de croissance lente.

L’approche de la microfluidique présentée ici est la première méthode qui nous permet d’étudier la capacité des cellules végétales au bout-de plus en plus à s’allonger dans des espaces très étroits. Ces micro-dispositifs peuvent être utiles pour le dépistage des dosages qui examinent les fonctions des gènes associés à la biosynthèse de la paroi cellulaire et de l’intégrité de la culture pointe de cellules par l’intermédiaire de leur capacité de pénétration. En outre, Julie et al. 21 a récemment démontré une rupture de l’enveloppe nucléaire et le mécanisme de réparation en serrant une cellule cancéreuse dans un espace confiné, préparé dans un dispositif microfluidique et il peut être possible d’étudier si un mécanisme similaire existe dans les tubes polliniques en utilisant notre appareil. Cette plate-forme expérimentale nouvellement mis au point peut être utilisée pour étudier comment les cellules répondent aux espaces physiquement contraints et peut ainsi améliorer notre compréhension des mécanismes de croissance apicale.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Acknowledgments

Nous remercions Tsutsui H. et D. Kurihara pour nous avoir fourni des plantes transgéniques, notamment la ligne T. fournieriRPS5Ap::H2B-tdTomato et la ligne a. thaliana UBQ10pro::H2B-mClover , respectivement. Ce travail a été soutenu par l’Institut de transformatrices biomolécules de l’Université de Nagoya et le Japan Advanced Plant Science Network. Soutien financier à ce travail a été fourni par les subventions de la Japan Science and Technology Agency (projet ERATO grant no. JPMJER1004 pour T.H.), une subvention pour la recherche scientifique sur les domaines innovants (Nos. JP16H06465 et JP16H06464 pour T.H.) et la société japonaise pour les Promotion of Science (JSPS) de subventions pour la difficile recherche exploratoire (subvention no 26600061 pour nos N.Y. et grant 25650075 et 15 K 14542 pour Y.S.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PDMS Dow Corning Co. Sylgard184
Murashige & Skoog Medium Wako Pure Chemical 392-00591
MES Dojindo 345-01625
Sucrose Wako Pure Chemical 196-00015
50 mm glass-bottom dish Matsunami Glass D210402
35 mm glass-bottom dish Iwaki  3971-035
Surgical blade Feather No.11
biopsy punches Harris Uni-Core
Gel loading tips Bio-Bik 124-R-204
Inverted Microscope Olympus IX83
CSU-W1 Yokogawa Electric No Catalog number is avairable for this customized microscope
MetaMorph imaging software Molecular Devices

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Higashiyama, T., Takeuchi, H. The Mechanism and Key Molecules Involved in Pollen Tube Guidance. Annu. Rev. Plant. Biol. 66, 393-413 (2015).
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Yanagisawa, N., Sugimoto, N., Higashiyama, T., Sato, Y. Development of Microfluidic Devices to Study the Elongation Capability of Tip-growing Plant Cells in Extremely Small Spaces. J. Vis. Exp. (135), e57262, doi:10.3791/57262 (2018).

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