Summary
אנו מתארים שיטה כדי לחקור את היכולת של עצה גידול תאי צמחים, כולל אבקה צינורות, שערות השורש, וטחב protonemata, להאריך להידחק למרווחים צרים מאוד (~ 1 מיקרומטר) במכשיר microfluidic.
Abstract
In vivo, תאי צמחים הגדלים טיפ צריך להתגבר על סדרה של מכשולים פיזיים; עם זאת, החוקרים חוסר המתודולוגיה להמחיש התנהגות הסלולר בתנאים מגבילים כאלה. כדי לטפל בבעיה זו, פותחו תאי צמיחה עבור עצה גידול הצמח תאים המכילים סדרה של פערים צר, מפוברק-מיקרו (~ 1 מיקרומטר) במצע פולי-dimethylsiloxane (PDMS). חומר שקוף זה מאפשר למשתמש לעקוב אחר עצה התארכות התהליכים תאים בודדים בזמן החדירה microgap על ידי הדמיה בצילום מואץ. באמצעות פלטפורמה ניסיוני זו, נצפו שינויים מורפולוגיים אבקה צינורות כפי שהם חדרו את microgap. אנחנו נתפס השינויים הדינמיים בצורה של גרעין וגטטיבי fluorescently שכותרתו ותאי הזרע צינור אבקה בתהליך זה. יתר על כן, אנו הפגינו את היכולת של שערות השורש, מוס protonemata לחדור הפער 1 מיקרומטר. פלטפורמה זו במבחנה ניתן ללמוד תאים מסוימים, להגיב מקומות מוגבל פיזית, עשוי לספק תובנות לגבי מנגנוני עצה-צמיחה.
Introduction
לאחר גרגרי אבקה לנבוט על סטיגמה, כל גרגיר מייצרת צינור אבקה יחיד שנושאת תאי זרע לתא הביצה, התא המרכזי להפרייה לדישון כפול. אבקה צינורות להאריך באמצעות הסגנון ולהגיע בסופו של דבר ביצית על ידי חישה רמזים הדרכה מרובים לאורך הדרך שלהם1. במהלך התארכות, אבקה צינורות נתקל סדרה של מכשולים פיזיים; המסלול שידור מלא תאים, אבקה צינורות עליך להזין הפתח micropylar דקה של ביצית להגיע שלהם היעד (איור 1 א')2. לכן, אבקה צינורות צריכה להיות יכולת לחדור מכשולים פיזיים, תוך כדי לנקוט הלחץ compressive של סביבתם. שערות השורש הינם סוג נוסף של גידול עצה תא צמח זה חייבים לעמוד חסימות בסביבת, בצורה של חלקיקי הקרקע ארוז (איור 1B).
תכונות מכאניות שונות הנביטה נחקרו, כולל לחץ טורגור הנוקשות של אזור הפסגה של התא, אשר ניתן למדוד באמצעות מיקרוסקופ כוח הסלולר פלסמוליזה התחלתית שיטה3,4 (CFM) 5 , 6, בהתאמה. עם זאת, שיטות אלה לבד אינם מגלים אם צינורות אבקה מסוגלים מתארך דרך מחסומים פיזיים לאורך נתיבים הצמיחה שלהם. טכניקה חלופית המאפשר התארכות הנביטה בפיקוח ויוו היא מיקרוסקופ שני הפוטונים7. עם זאת, בשיטה זו, קשה לצפות את שינויים מורפולוגיים צינורות בודדים אבקה עמוק בתוך הרקמה ביצית. בנוסף, צמיחת השיער שורש בקרקע, ניתן לאבחן באמצעות טומוגרפיה הממחושבת טומוגרפיה ממוחשבת (CT) ודימות תהודה מגנטית (MRI)8, אמנם עם רזולוציה נמוכה. כאן, אנו מציגים שיטה שבה ניתן להשתמש כדי לרכוש תמונות ברזולוציה גבוהה של תהליך דפורמציה של התא במיקרוסקופ רגיל.
המטרה הכוללת של השיטה המתוארת כאן היא להמחיש את היכולת התארכות של עצה גידול תאי צמחים, כולל אבקה צינורות, שערות השורש, מוס protonemata, בחללים קטנים מאוד. כמו microdevices פולי-dimethylsiloxane (PDMS) הציג כתב יד זה שקופים שטיחות והאוויר חדיר, אנחנו יכולים התרבות תאים חיים בתוך המכשיר ובדוק אם צוינו והתנהגותם צמיחה תחת מיקרוסקופ. אפשרי גם ליצירת מיקרו ~ ננומטר רווחים בקנה מידה על ידי טכניקת הדפס אבן רכה9 עם השימוש בתבניות. תכונות אלה מאפשרות לנו ללמוד את היכולת התארכות של תאי צמחים הגדלים עצה בסביבה מוגבלת פיזית.
בעבודה זו, אנו נבנה 1 מיקרומטר רחב פערים (4 מיקרומטר בגובה) במכשירים microfluidic, בחן את היכולת של אבקה צינורות לחדור מכשולים מלאכותיים אלה, כי הם הרבה יותר קטן מאשר הקוטר של הצינור אבקה גלילי (כ 8 מיקרומטר). פלטפורמה ניסיוני זו מאפשרת לנו לדמיין של הנביטה בתגובה microgaps, ללכוד תמונות בצילום מואץ של התגובה, אשר לעקוב אחר תהליך דפורמציה של התא. פיתחנו גם את microdevices יכול לשמש כדי לחקור את יכולת החדירה של שערות השורש, מוס protonemata. מספר microdevices דווחו עד היום המאפשרים את החזיית שורש10,11,12,13 ו מוס protonemata14 צימוח ברזולוציה גבוהה. במכשיר שלנו, סדרה של שורש השיער הצמיחה ערוצי מחוברות בניצב לתא צמיחה שורש, שורש בודדים שערות (כ 7 מיקרומטר בקוטר) מודרכים ערוצי fluidic עם פער רחב 1 מיקרומטר. אנחנו גם תרבותי מוס protonemata (כ 20 מיקרומטר בקוטר) ב- microdevice המכיל microgaps לבחון את התגובות שלהם את המחסומים הפיזיים. הגישה המוצעת מבוססת-microfluidic מאפשר לנו לבחון את היכולת של תאי צמחים שונים הגדלים עצה להאריך דרך חללים קטנים מאוד, אשר לא יכול להיבדק על ידי כל שיטה אחרת זמין כרגע.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ייצור של Microdevice PDMS כדי לבחון גדל אבקה צינורות וטחב Protonemata
הערה: השתמשנו מכשיר פוטוליתוגרפיה maskless להכין בתבניות PDMS על שבבי סיליקון. הפרטים לגבי המבצע של המערכת מושמטים בכתב היד. טכניקת פוטוליתוגרפיה תקן9 באמצעות photomask עשוי לשמש גם ליצירת התבניות PDMS המתואר בכתב היד.
- יוצקים 11 גרם של פולימר טרום PDMS תערובת (elastomer הבסיס: אשפרה הסוכן ביחס של 10:1) לתוך כל עובש 4 אינץ.
- דגה כייר מוכן בשלב 1.1 עבור 20 דקות בתוך תא ואקום.
- לאחר ריפוי-65 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות בתנור שאינו הסעת חום, לקלף את השכבה PDMS את העובש, מנקבים חורים גישה לתוך הערוצים fluidic באמצעות ביופסיה אגרופים.
הערה: עבור ההתקן הנביטה, גודל החור חייב להיות מותאם כדי לשקף את הקוטר של העלי. ערך זה ישתנה ולכן על ידי מינים. בניסוי זה, אנחנו מנוקב חור 1 מ"מ עבור פתחי הכניסה העלי וחורים 1.5 mm עבור המאגרים בינוני נוזלי. עבור ההתקן protonemata מוס, חור 4 מ מ שימשה המאגר הדגימה. - לחשוף את השכבה PDMS ואת צלחת תחתית זכוכית (3.5-5 ס מ קוטר) לשידור פלזמה 50 s.
- הקש את השכבה PDMS לתוך צלחת תחתית זכוכית חום-65 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בתנור שחומם ללא הסעה לאטום לגמרי את הרשת microfluidic.
2. ייצור של Microdevice PDMS של שערות השורש
- חזור על שלבים 1.1-1.3 באמצעות התבניות כדי להכין שתי שכבות PDMS השורש ואת שורש השיער microdevices.
הערה: השתמשנו חור 2 מ מ עבור המאגרים בינוני נוזלי ב microdevice השורש. - לחשוף את שתי שכבות PDMS האווירית, פלזמה 50 s.
- שתי השכבות PDMS תחת stereomicroscope באמצעות aligner שולחן בהזמנה אישית להרכיב.
הערה: microchannels את שכבות אלה PDMS להתייצב אחד את השני. לפני הרכבת, ודא כי הסימנים היישור על שתי שכבות התאמה. - חום-65 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בתנור שחומם ללא הסעה לאטום לגמרי את הרשת microfluidic.
- הסר תגית כיסוי microdevice שלא נבנה ומניחים את המכשיר על צלחת תחתית זכוכית הוא 5 ס מ בקוטר.
3. הכנה של חוץ גופית תא תרבות בינוני אבקה צינורות (Torenia fournieri)
- להכין בינוני של Nitsch ששונה כפי שתואר לעיל,15 והחיטוי המדיום ב 121 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
הערה: ההרכב של בינוני של Nitsch modifed הוא מלון NH43 (80 mg/L), יודע3 (125 מ ג/ליטר) Ca (3)2‧4H2O (500 מ ג/ליטר), MgSO4‧7H2O (125 מ"ג/ליטר), ח'2PO4 (125 מ ג/ליטר ), MnSO4‧4H2O (3 מ ג/ליטר), ZnSO4‧7H2O (0.5 מ ג/ליטר), H3בו3 (10 mg/L), CuSO4‧5H2O (0.025 mg/L), נה2MoO4‧2H2O (0.025 mg/L), סוכרוז (50,000 mg/L), קזאין (500 mg/L). המדיום מוכן שניתן לאחסן ב 4 ° C 4 חודשים לפחות. - להכין 26% (w/v) פוליאתילן גליקול באמצעות מים יונים בלוק ולסנן את הפתרון עם מסנן נקבובית מיקרומטר 0.3.
הערה: המדיום מוכן שניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס במשך חודש. - מערבבים את נוגדנים מוכנה בשלב 3.1 ו- 3.2 ביחס 1:1 (v/v).
הערה: בינוני להכין טרי כל שימוש.
4. הכנה של חוץ גופית תא תרבות בינוני שערות השורש (תודרנית לבנה)
- להכין פתרון של 0.215% (w/v) Murashige & Skoog בינוני, 0.05% (w/v) MES, 1% (w/v) סוכרוז, ו- 1% (w/v) אגר במים יונים. אוטוקלב הפתרון ב 121 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
5. הכנה של חוץ גופית תא תרבות בינוני מוס Protonemata (Physcomitrella patens)
- מראש תדגור על protonemata מוס BCDAT בינוני16 בצלחת פטרי
הערה: ההרכב של BCDAT בינוני הוא 1 מ MgSO4, 10 מ מ יודע3, 45 מיקרומטר מכל4, מ מ 1.8 ח'2PO4 (pH להתאים ל- 6.5 עם קו), פתרון יסוד קורט (0.22 מיקרומטר CuSO4, ZnSO מיקרומטר 0.194, 10 מיקרומטר H3בו 3, 0.1 מיקרומטר נה2MoO4, 2 מיקרומטר MnCl2, מיקרומטר 0.23 CoCl2ו- 0.17 מיקרומטר קי), 1 מ מ CaCl2ו- 5 מ מ דיאמוניום (+)-tartrate. - תרבות האיזוב במדיום BCDATG, microdevice.
הערה: המדיום BCDATG היא BCDAT בינונית עם 0.5% (w/v) גלוקוז. המדיום מוכן שניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס במשך חודש.
6. Culturing במבחנה של צינורות אבקה טי fournieri Microdevice
- במקום microdevice את האבקה בתוך תא ואקום, דגה כעשרים דקות.
- להסיר את microdevice מן החדר ואקום, להציג את מדיום הגידול לים פיסטיל באמצעות micropipette עם טיפ מצוין. למלא הבארות הנותרים על גגותיהם עם המדיום אותו. חכו מספר דקות עד כל microchannels את מלאים המדיום על ידי הוואקום שנוצר בתוך microchannels.
- מניחים מגבת נייר רטובה קצת בצלחת התחתונה זכוכית כדי לשמור על הלחות בצלחת.
- להעביר את גרגרי אבקה מפראי-סוג פרח "כחול ולבן" טי fournieri לסטיגמה שלה באמצעות מחט לנתיחה.
הערה: גם ערכנו ניסוי זה עם הטרנסגניים טי fournieri 'כתר סגול' פרח ( RPS5Ap::H2B-tdTomato קו17), עם צינורות אבקה המכילה תאי זרע fluorescently שכותרתו, גרעינים וגטטיבי. - גזור הסגנון pollinated (1 ס"מ) באמצעות סכין.
- הכנס את הסגנון לחתוך לתוך הים של המכשיר כמוצג באיור2.
- לשים מכסה על המנה, לאטום אותו עם סרט.
- למקם את המכשיר בתוך אינקובטור ב 28 מעלות צלזיוס במשך 5-6 h בחשכה.
7. Culturing במבחנה של שערות השורש לבנה א ב Microdevice
הערה: השלבים 7.1-7.9 (למעט 7.3 ו- 7.5) צריכה להתבצע בתוך תא למינארי.
- לעקר את הזרעים מקולומביה לבנה א (Col-0), הטרנסגניים קו UBQ10pro::H2B-מק'לאבר (המכיל את סמן גרעיני פלורסנט) בהשריה בנוזל סטרילי (מלבין ביתי 5% (v/v) ו- 0.02% (v/v) טריטון X-100) למשך 5 דקות.
- לשטוף ביסודיות את הזרעים סטיריליים במים בלוק.
- לאחסן זרעים שטופים במים במשך יומיים ב 4 ° C בחשכה.
- לחטא את microdevice תחת אור UV בן לילה.
- מניחים את microdevice תא ואקום, דגה כעשרים דקות.
- להציג את מדיום הגידול לבארות את ההתקן באמצעות של micropipette. המתן מספר דקות עד הריק ממלא כל microchannels את המדיום.
- מניחים מגבת נייר רטובה בלוק בצלחת התחתונה זכוכית כדי לשמור על הלחות בצלחת.
- העברת זרע סטיריליים לתוך הים של המכשיר.
- לשים מכסה על המנה, לאטום אותו עם סרט.
- מניחים את המכשיר אנכית בתוך אינקובטור ב 22 ° C תחת אור לבן רציף.
- בדוק צמיחת שורש השיער לאחר 4-10 ימי דגירה. להשיג את השדה החיובי והן פלורסנט תמונות באמצעות מיקרוסקופ הפוכה.
8. Culturing במבחנה של patens פ (מוס) Protonemata את ההתקן Microfluidic
הערה: השלבים 8.2-8.6 (למעט 8.3) צריכה להתבצע בתוך תא למינארי.
- Preculture patens פ זן Gransden 200418 באמצעי BCDAT מכוסה צלופן בצלחת פטרי לשבוע אחד תחת אור לבן רציף ב 25 º C.
- לחטא את microdevice תחת אור UV ללון בתוך תא למינארי.
- מניחים את microdevice תא ואקום, דגה כעשרים דקות.
- להציג מדיום הגידול הבארות באמצעות של micropipette. המתן מספר דקות עד הריק ממלא כל microchannels את המדיום.
- מוסיפים מים בלוק לתוך המנה המקיפים את microdevice כדי לשמור על הלחות בצלחת.
- להעביר חתיכה קטנה של אזוב protonemata רקמות לים של microdevice ואת התרבות הרקמה באינקובטור 25 ° c תחת אור לבן רציף.
- בדוק את הצמיחה protonemata מוס לאחר 2-3 שבועות של דגירה. להשיג תמונות שדה בהיר באמצעות מיקרוסקופ.
9. זמן לשגות הדמיה של צמיחה הנביטה טי fournieri
- מניחים את microdevice על מיקרוסקופ פלורסצנטיות הפוכה מצויד עם התמונה רכישת חומרה (למשל., מצלמת CCD) ותוכנות. למצוא את מיקומי microgap.
הערה: עבור התוכנה רכישת התמונה, השתמשנו מוצר זמין מסחרית (טבלה של חומרים). תוכנת קוד פתוח מיקרוסקופ כגון µManager הוא גם זמין באינטרנט (https://micro-manager.org/wiki/Micro-Manager). אנו ממליצים להתקין את הקבל מיקרוסקופ על המיקרוסקופ להשיג תמונות ברזולוציה גבוהה. - לכידת תמונות שדה בהיר כל 10 s באמצעות מיקרוסקופ תמונה רכישת תוכנה.
- כדי לבחון את תאי הזרע fluorescently שכותרתו ואת גרעין וגטטיבי בצינור אבקה של קו RPS5Ap::H2B-tdTomato , להאיר את הדגימה. עם 561 ננומטר לייזר ולהשתמש מסנן אופטי bandpass (578/105 ננומטר).
הערה: למרות תמונות בצילום מואץ של האבקה הצמיחה בה נתפסים לעתים קרובות הדמיה לא נראה להשפיע על הגדילה. עם זאת, תמיד מומלץ כדי למזער את עוצמת הלייזר, זמן החשיפה, מרווח זמן לשגות, כדי למזער את phototoxicity ואת photobleaching של fluorophore. - להתאים את הבהירות והחדות של התמונות והכן קובץ וידאו באמצעות תוכנת ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כמופיע באיור1, תאי צמחים הגדלים עצה נתקלים סדרה של מחסומים פיזיים לאורך נתיבים שלהם צמיחה בתוך vivo. Microfluidic במבחנה תא תרבות פלטפורמות שהוצגו במחקר זה מופעל הבדיקה גידול עצה תהליך בשלושה סוגים של תאי צמחים (אבקה צינורות שערות השורש, מוס protonemata) באמצעות הפערים מלאכותיים 1 מיקרומטר (איור 3, איור 4, איור 5). לצורך המחקר הנביטה, הדמיה לחיות תאים שימש לעקוב אחר שינויים מורפולוגיים באזור הפסגה של אבקה צינורות, כמו גם גרעין וגטטיבי ואת תאי זרע בתגובה היתקלות שטח קטן מאוד (משלימה סרט 1 ו- 2).
אף על פי רוב microgaps הללו זוייפו בהצלחה על-ידי הפעלת השיטה המתוארת כאן, שמנו לב כי כמה מהם היו לגמרי סגור (איור 6). כי הערוצים רחב 1 מיקרומטר נוצר על העובש סיליקון הם שבירים, השימוש החוזר ונשנה של עובש זה שעלול לגרום נזק הפערים, המוביל אל הפער חסימה על השכבה PDMS. לפני ביצוע הניסוי, לכן חשוב לבדוק microgaps PDMS שלמים.
איור 1: חדירה של עצה גידול הצמח תאים לתוך מקומות מוגבל פיזית. (א) הנביטה מתארך דרך מספר מחסומים פיזיים בדרכה ביצית. מחסומים כוללים העברת רקמות בדרכי הסגנון, את integuments המקיפים את micropyle. שערות השורש (B) לחדור דרך אדמת צפופה. כניסות ב (א) ו- (ב) מציגים הגדלות של האזורים מסגרת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: מאפייני microdevices המשמשות ללימוד טי fournieri אבקה צינורות, שערות השורש לבנה א ו patens פ protonemata. בציורים סכמטי של microchannels, מדגם ממוקמת במיקום שצוין על-ידי סימן כוכבית (*). Microchannel עיצובים, תמונות של כל מכשיר, ערוץ מבנים ו תא culturing תקופות מסוכמים. דמות זו שונתה באישור Yanagisawa et al. 201719. סולם בר, 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: ט fournieri הנביטה התארכות דרך פרצה 1 מיקרומטר. (א) הנביטה עובר 1 מיקרומטר רחב ו- 4 מיקרומטר גבוהה פער. תמונות בצילום מואץ שדה בהיר נלכדו באמצעות מיקרוסקופ הפוכה מצויד עם מערכת קונאפוקלית ספינינג-דיסק. סרגל קנה מידה, 20 מיקרומטר. (B) זמן לשגות תמונות של גרעין וגטטיבי שכותרתו fluorescently תאי זרע צינור אבקה RPS5Ap::H2B-tdTomato קו חוצה את microgap. סולם בר, 20 מיקרומטר. איור () ו- (ב) שונו באישור Yanagisawa et al. 201719. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 4. לבנה א התארכות שורש השיער דרך פרצה 1 מיקרומטר. (א) שורש, שורש השיער הצמיחה microdevice. Microgaps (1 µm רוחב) ו- 4 מיקרומטר בגובה ממוקמים בצד שמאל של הערוץ צמיחה השורש. Microchannels את בצד ימין אינם מכילים microgaps, יכול לשמש פקד. סרגל קנה מידה 100 מיקרומטר. שדה בהיר (B) , קרינה פלואורסצנטית (ג) , (ד) התמזגה תמונות של שערות השורש עובר microgaps. הגרעינים של שערות השורש fluorescently מסומנות בקו UBQ10pro::H2B-מק'לאבר . בקצה של כל השיער שורש מסומן על ידי חץ. סולם בר, 30 מיקרומטר. הדמויות שונו באישור Yanagisawa et al. 201719. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5. התארכות protonemata patens פ דרך פרצה 1 מיקרומטר. מוס תאים protonemata חוצה דרך פרצה 1 מיקרומטר (מיקרומטר 4 גובה), אשר התרחבו בגלל לחץ טורגור של protonemata. סולם בר, 20 מיקרומטר. האיור השתנה באישור Yanagisawa et al. 201719. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6. סגור microgaps. תמונת SEM של האזור הפער 1 מיקרומטר. Microgap בצד הימין סגור לחלוטין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
הסרט משלים 1. האבקה צמיחה דרך פער 1 מיקרומטר. תמונות בצילום מואץ שדה בהיר נלכדו כל 10 s באמצעות מיקרוסקופ הפוכה מצויד עם מיקרוסקופ קונפוקלי של הדיסק מסתובב. סולם בר, 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
הסרט משלים 2. חדירה של גרעין וגטטיבי, תאי הזרע דרך פער 1 מיקרומטר. שדה בהיר זמן לשגות ותמונות פלורסצנטיות נלכדו כל 20 s באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות הפוכה. סולם בר, 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול צריך להיות מלווה בדיוק כדי להשיג את התוצאות שהוצגו לעיל. ראשית, PDMS שכבת זכוכית התחתון מאכל משטחים שניהם להתייחס עם פלזמה עבור כמות מספקת של זמן לפני מליטה. אחרת, השכבה PDMS עשוי באופן מקומי ניתוק ממשטח הזכוכית בעוד תאי גידול עצה חוצה את microgaps. עוד צעד קריטי בפרוטוקול protonemata שורש והשיער מוס הוא של microdevice העיקור. בדרך כלל, שערות השורש ותאים protonemata מוס צריך להיות בתרבית ב microdevice במשך כמה שבועות. בלי לחיטוי המכשיר, מיקרואורגניזמים ישגשג, מה שיכול להשפיע על צמיחת תאים אלה הגדלים עצה. עיקור וסירוס של המכשיר האבקה אינה מכרעת, שכן הניסוי הסתיים תוך חצי יום. אנו בקביעות השתמשו ההתקן הנביטה ללא עיקור, לא להתבונן תופעות בלתי רצויות במהלך הניסוי.
העיצוב microchannel צריך לשנות בהתאם התאים עניין. בעבודתנו, העיצוב ערוץ המשמש את הניסוי שורש השיער לבנה א היה שונה מזו המשמש fournieri ט הנביטה של הניסויים protonemata patens פ . התקנים שונים נדרשים כי הדגימות יש ממדים שונים; למשל, שערות השורש הם הרבה יותר קצר מאשר אבקה צינורות, מוס protonemata. לכן, התקן שורש השיער שלנו תוכנן כך האזורים microgap היו סמוכים לערוץ הבסיס העיקרי. בנוסף לעיצוב הערוץ, הליך הכנת המכשיר שורש השיער גם משתנה בין ההליכים צינורות אבקה או מוס protonemata. עבור המחקרים protonemata הנביטה, מוס, השתמשנו של microdevice המכילה שכבה PDMS אחת עם microchannels את אטום צלחת תחתית זכוכית. עם זאת, ההתקן המשמש ללמוד שערות השורש כוללת שתי שכבות PDMS: השכבה העליונה עם microchannel (עומק: 200 מיקרומטר) כי הבסיס העיקרי הוא אטום נגד השכבה התחתונה, המכיל microchannels (עומק: 4 מיקרומטר) עבור שערות השורש. הטכניקה פוטוליתוגרפיה סטנדרטי אשר הועסק כדי לבדות כייר הסיליקון הוא מוגבל ליחס גובה-רוחב של סביב 5:1. לכן, כדי ליצור פער רחב 1 מיקרומטר, הגובה ערוץ תהיה מוגבלת כ 5 מיקרומטר. זה גם טכנית מאתגר ליישור בדיוק תעלה עמוקה (למשל., 200 מיקרומטר) ליד הפער 1 מיקרומטר רחב על תבנית סיליקון. לכן, אנו מוכנים שכבות נפרדות PDMS הבסיס העיקרי של שערות השורש, שבנה את המכשיר איטום אותם יחד.
פרוטוקול זה שימש בהצלחה כדי להמחיש את הטיפ גדל תהליך של אבקה צינורות דרך microgaps (משלים סרט 1 ו-2), זמן לשגות הדמיה של שורש השיער ואילו מוס התארכות protonemata על אזור microgap יהיה יותר מאתגר. ב microdevice המשמש culturing שערות השורש א לבנה , הגובה של ערוצי הצד איפה microgaps ממוקם (4 מיקרומטר) הוא רדודים בהרבה מזה של התא צמיחה השורש (200 מיקרומטר), כך רוב שערות השורש הם אפשרות להמשיך לתוך הערוצים בצד. גם אם השערות שורש למצוא הכניסה לתעלה בצד, קשה לחזות מתי הם יזינו את זה. כדי ללכוד תמונות בצילום מואץ של שורש השיער לצמיחה microgap, אנו ממליצים להשתמש במיקרוסקופ מצויד שלב אוטומטיות שניתן לתכנת אמור להיות ממוקם על מיקומים מרובים עבור ייבוא תמונות. כאשר מכשור כזה זמין, אנו ממליצים לחפש השערות שורש כבר נכנסו הערוצים בצד, אך עדיין לא חצו את microgaps. מאז קצב הצמיחה של שערות השורש לבנה א הוא הרבה יותר איטית (בדרך כלל 1-2.5 מיקרומטר/דקה20) מזה של fournieri טי אבקה צינורות (בדרך כלל 22-23 מיקרומטר/דקה19), ייתכן שתהיה אפשרות ללכוד תמונות בצילום מואץ של שערות השורש האלה זה עומדים לחצות את microgaps. מצד שני, מוס protonemata תצפיות דורשים מערכת זמן לשגות יכול לשמש באופן בלעדי עבור מחקר זה, מאחר תקופה התבוננות ממושכת נדרש בשל קצב צמיחה איטי.
הגישה microfluidic המובאת כאן היא השיטה הראשונה זה מאפשר לנו ללמוד את היכולת של תאי צמחים הגדלים עצה להאריך דרך מרחבים צרים מאוד. Microdevices אלה עשויה להיות שימושית עבור הקרנה מבחני זה חיקרו את הפונקציות של גנים הקשורים דופן התא ביוסינטזה והיושרה של גידול עצה תאים דרך יכולת החדירה שלהם. בנוסף, Denais et al. 21 לאחרונה הפגינו קרע מעטפת הגרעין, מנגנון תיקון לוחצת תא סרטני דרך ודחוק המבושלות מכשיר microfluidic, ייתכן שניתן ללמוד אם מנגנון דומה קיים באמצעות צינורות אבקה שלנו המכשיר. הפלטפורמה החדשה שפותחה ניסיוני יכול לשמש כדי לחקור תאים בודדים איך להגיב מקומות מוגבל פיזית, ובכך עשוי לשפר את ההבנה שלנו של מנגנונים עצה-צמיחה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.
Acknowledgments
אנו מודים Tsutsui ה ו Kurihara ד שסיפקו הצמחים הטרנסגניים, כולל קו ט fournieriRPS5Ap::H2B-tdTomato וקו א לבנה מק'לאבר-UBQ10pro::H2B , בהתאמה. עבודה זו נתמכה על ידי המכון של טרנספורמטיבי ביו-מולקולות של אוניברסיטת נאגויה, יפן מתקדמת צמח מדע ברשת. תמיכה כספית עבור עבודה זו העניקה מלגות יפן המדע, הטכנולוגיה סוכנות (ERATO הפרוייקט הענק לא. JPMJER1004 עבור תוצרת הארץ), מענק הסיוע למחקר מדעי בתחומים חדשניים (Nos. JP16H06465 ו JP16H06464 עבור תוצרת הארץ), וחברה ביפן עבור Grants-in-Aid של קידום המדע (JSPS) לצורך מחקר גישוש מאתגר (גרנט 26600061 מס עבור N.Y. וגרנט ' קט ' 25650075 ו- 15 K 14542 עבור Y.S.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS | Dow Corning Co. | Sylgard184 | |
| Murashige & Skoog Medium | Wako Pure Chemical | 392-00591 | |
| MES | Dojindo | 345-01625 | |
| Sucrose | Wako Pure Chemical | 196-00015 | |
| 50 mm glass-bottom dish | Matsunami Glass | D210402 | |
| 35 mm glass-bottom dish | Iwaki | 3971-035 | |
| Surgical blade | Feather | No.11 | |
| biopsy punches | Harris | Uni-Core | |
| Gel loading tips | Bio-Bik | 124-R-204 | |
| Inverted Microscope | Olympus | IX83 | |
| CSU-W1 | Yokogawa Electric | No Catalog number is avairable for this customized microscope | |
| MetaMorph imaging software | Molecular Devices |
References
- Higashiyama, T., Takeuchi, H. The Mechanism and Key Molecules Involved in Pollen Tube Guidance. Annu. Rev. Plant. Biol. 66, 393-413 (2015).
- Vogler, H., Shamsudhin, N., Nelson, B. J., Grossniklaus, U. Measuring cytomechanical forces on growing pollen tubes. Pollen Tip Growth. Obermeyer, G., Feijó, J. , Springer. 65-85 (2017).
- Kehr, J., Wagner, C., Willmitzer, L., Fisahn, J. Effect of modified carbon allocation on turgor, osmolality, sugar and potassium content and membrane potential in the epidermis of transgenic potato (Solanum tuberosum L.) plants. J. Exp. Bot. 50 (334), 565-571 (1999).
- Benkert, R., Obermeyer, G., Bentrup, F. W. The turgor pressure of growing lily pollen tubes. Protoplasma. 198, 1-8 (1997).
- Vogler, H., et al. The pollen tube: a soft shell with a hard core. Plant J. 73 (4), 617-627 (2013).
- Shamsudhin, N., et al. Massively parallelized pollen tube guidance and mechanical measurements on a Lab-on-a-Chip platform. PloS one. 11 (12), e0168138 (2016).
- Cheung, A. Y., Boavida, L. C., Aggarwal, M., Wu, H. M., Feijó, J. A. The pollen tube journey in the pistil and imaging the in vivo process by two-photon microscopy. J Exp Bot. 61 (7), 1907-1915 (2010).
- Metzner, R., et al. Direct comparison of MRI and X-ray CT technologies for 3D imaging of root systems in soil: Potential and challenges for root trait quantification. Plant Methods. 11 (1), 1-11 (2015).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft Lithography. Angew Chemie Int Ed. 37 (5), 550-575 (1998).
- Massalha, H., Korenblum, E., Malitsky, S., Shapiro, O. H., Aharoni, A. Live imaging of root-bacteria interactions in a microfluidics setup. P Natl Acad Sci. 114 (17), 4549-4554 (2017).
- Grossmann, G., et al. Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using the RootChip. J Vis Exp. (65), (2012).
- Busch, W., et al. A microfluidic device and computational platform for high-throughput live imaging of gene expression. Nature Methods. 9, 1101-1106 (2012).
- Parashar, A., Pandey, S. Plant-in-chip: Microfluidic system for studying root growth and pathogenic interactions in Arabidopsis. Appl. Phys. Lett. 98, 263703 (2011).
- Bascom, C. S., Wu, S. -Z., Nelson, K., Oakey, J., Bezanilla, M. Long-Term Growth of Moss. in Microfluidic Devices Enables Subcellular Studies in Development. Plant Physiol. 172 (1), 28-37 (2016).
- Higashiyama, T., Kuroiwa, H., Kawano, S., Kuroiwa, T. Guidance in vitro of the pollen tube to the naked embryo sac of Torenia fournieri. Plant Cell. 10, 2019-2032 (1998).
- Nishiyama, T., Hiwatashi, Y., Sakakibara, K., Kato, M., Hasebe, M. Tagged mutagenesis and gene-trap in the moss, Physcomitrella patens by shuttle mutagenesis. DNA Res. 7, 9-17 (2000).
- Maruyama, D., et al. Independent Control by Each Female Gamete Prevents the Attraction of Multiple Pollen Tubes. Dev. Cell. 25 (3), 317-323 (2013).
- Rensing, S., et al. The Physcomitrella genome reveals evolutionary insights into the conquest of land by plants. Science. 319, 64-69 (2008).
- Yanagisawa, N., Sugimoto, N., Arata, H., Higashiyama, T., Sato, Y. Capability of tip-growing plant cells to penetrate into extremely narrow gaps. Sci. Rep. 7 (1), 1403 (2017).
- Dolan, L., et al. Clonal relationships and cell patterning in the root epidermis of Arabidopsis. Development. 120, 2465-2474 (1994).
- Denais, C. M., et al. Nuclear envelope rupture and repair during cancer cell migration. Science. 352 (6283), 353-358 (2016).
