Summary
Vi beskriver en metod för att undersöka tip växande växtceller, inklusive pollen tubes, rothår, förmåga och moss protonemata, att förlänga genom extremt smala luckor (~ 1 µm) i en mikroflödessystem enhet.
Abstract
In vivo, tip-växande växtceller måste övervinna en serie av fysiska hinder; dock saknar forskare metoden för att visualisera cellulära beteende i sådana restriktiva villkor. Om du vill åtgärda det här problemet har vi utvecklat tillväxt kammare för tip-växande växtceller som innehåller en rad smala, mikro-fabricerade luckor (~ 1 µm) i en poly-dimethylsiloxane (PDMS) substrat. Detta transparenta material tillåter användaren att övervaka tip töjning processer i enskilda celler under microgap penetration genom time-lapse imaging. Använder denna experimentell plattform, observerat vi morfologiska förändringar i pollen rör som de trängt in i microgap. Vi fångade de dynamiska förändringarna i form av en fluorescently märkt vegetativt kärna och sädesceller i ett pollen-rör under denna process. Dessutom visade vi rothår och moss protonemata förmåga att penetrera 1 µm klyftan. In vitro- plattformen kan användas för att studera hur enskilda celler svara till fysiskt begränsade utrymmen och kan ge insikter i tip-tillväxt mekanismer.
Introduction
Efter pollenkorn gror på ett stigma, producerar varje korn ett enda pollen rör som transporterar spermierna att äggcellen och den centrala cellen i ägget för dubbel befruktning. Pollen rör elongate genom stil och så småningom nå ägget genom att känna flera vägledning ledtrådar längs deras väg1. Under förlängningen stöta pollen rör en rad fysiska barriärer; sändande banan är fylld med celler, och pollen rören måste ange minut micropylar öppnandet av ägget att nå sina mål (figur 1A)2. Därför skall pollen rören ha förmågan att tränga igenom fysiska hinder, samtidigt tolerera tryckkraft stressen från sin omgivning. Rothår är en annan typ av tip växande växtcell som måste tåla fysiska hinder i miljön i form av packade jordpartiklar (figur 1B).
Olika mekaniska egenskaper av pollen röret har studerats, inklusive saftspänningen och stelhet i cellens apikala regionen, vilket kan mätas med hjälp av begynnande plasmolysis metod3,4 och cellulära kraft mikroskopi (CFM) 5 , 6, respektive. Dessa metoder ensam avslöjar dock inte om pollen rören klarar av elongating genom fysiska barriärer längs deras tillväxt vägar. En alternativ teknik som tillåter pollen tube töjning vara övervakade i vivo är två photon mikroskopi7. Med den här metoden är det dock svårt att iaktta de morfologiska förändringarna i enskilda pollen rör djupt inne i fröämnet vävnaden. Dessutom kan rot hår tillväxt i jord visualiseras med hjälp av röntgen beräknade datortomografi (CT) och magnetresonanstomografi (Mr)8, om än med låg upplösning. Här presenterar vi en metod som kan användas för att förvärva högupplösta bilder av cellens deformation processen på ett konventionellt Mikroskop.
Det övergripande målet för den metod som beskrivs här är att visualisera tip växande växtceller, inklusive pollen tubes, rothår, töjning kapacitet och moss protonemata, i mycket små utrymmen. Som de poly-dimethylsiloxane (PDMS) microdevices presenteras i detta manuskript är optiskt transparenta och luft permeable, kan vi kultur levande celler inuti enheten och observera deras tillväxt beteenden under ett mikroskop. Det är också möjligt att skapa mikro ~ nanometer skala utrymmen med mjuk litografi teknik9 med användning av formar. Dessa funktioner tillåter oss att studera töjning kapacitet av tip växande växtceller i en fysiskt trånga miljö.
I detta arbete, vi konstruerade 1 µm breda luckor (4 µm i höjd) i ultrakalla enheter och undersökte pollen rör förmåga att penetrera dessa konstgjorda hinder som är mycket mindre än diametern på cylindriska pollen röret (cirka 8 µm). Detta experimentell plattform gör det möjligt för oss att visualisera pollen rörets svar på microgaps och fånga time-lapse bilder i svaret, som spårar cellens deformation processen. Vi har även utvecklat en microdevices som kan användas för att undersöka rothår och moss protonemata penetration förmåga. Flera microdevices har rapporterats hittills som möjliggör visualisering av växternas rot10,11,12,13 och moss protonemata14 tillväxt med hög upplösning. I vår enhet, en serie av roten hår tillväxt kanaler är vinkelrätt anslutna till en rot tillväxt kammare och enskilda rothår (cirka 7 µm i diameter) styrs till fluidic kanaler med 1 µm skillnaderna. Vi odlade också moss protonemata (ungefärligt 20 µm i diameter) i en microdevice som innehåller microgaps för att undersöka deras Svaren till dessa fysiska hinder. Det föreslagna tillvägagångssättet med mikroflödessystem-baserade tillåter oss att utforska olika tip växande växtceller förmåga att elongate genom extremt små utrymmen, som inte kan granskas av någon annan tillgänglig metod.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. tillverkning av den PDMS Microdevice att undersöka växande Pollen rör mossa Protonemata
Obs: Vi använde en maskless photolithography instrumentet för att förbereda PDMS formar på kiselskivor. Detaljerna kring driften av systemet har utelämnats i detta manuskript. En standard photolithography teknik9 med en photomasken kan också användas för att skapa PDMS formarna beskrivs i detta manuskript.
- Häll 11 g före polymer PDMS blandning (elastomer bas: härdare i förhållandet 10:1) i varje 4-tums mögel.
- Degas mögel bereddes i steg 1.1 i 20 min i en vakuumkammare.
- Efter härdning vid 65 ° C i 90 min i en icke-varmluftsugn, skala PDMS lagret av mögel, och stansa tillgång hål i fluidic kanalerna med hjälp av biopsi stämplingar.
Obs: För pollen tube enheten, storleken på hålet måste justeras för att återspegla diametern på pistillen. Detta värde kan därför variera beroende arter. I detta experiment stansade vi 1 mm hål för pistill öppningarna och 1,5 mm hål för flytande medium behållarna. För moss protonemata enheten användes ett 4 mm hål för provet reservoaren. - Exponera PDMS lagret och ett glas botten maträtt (3,5-5 cm i diameter) för att lufta plasma för 50 s.
- Tryck på PDMS lagret i botten glasskål och värme vid 65 ° C i 30 min i en icke-varmluftsugn att helt isolera mikroflödessystem nätverket.
2. tillverkning av den PDMS Microdevice för rothår
- Upprepa steg 1.1-1.3 använder formarna för att förbereda två PDMS lager för roten och rot hår microdevices.
Obs: Vi använde ett 2 mm hål för de flytande medium reservoarerna i den roten microdevice. - Exponera både PDMS lager för plasma för 50 s.
- Montera de två PDMS lagrarna under ett stereomikroskop med en skräddarsydd stationära aligner.
Obs: Mikrokanaler på dessa PDMS lager måste möta varandra. Innan montering, se till att justering märken på båda lagren matcha upp. - Värme vid 65 ° C i 30 min i en icke-varmluftsugn att helt isolera mikroflödessystem nätverket.
- Ta bort täckglaset från det konstruerade microdevice och placera enheten på en glas botten maträtt som är 5 cm i diameter.
3. förberedelse av In Vitro cellodlingsmedium för Pollen rör (Torenia fournieri)
- Förbereda modifierade Nitsch's medium som tidigare beskrivits15 och autoklavera mediet vid 121 ° C i 20 min.
Obs: Sammansättningen av den modifed Nitsch medium är NH4Nej3 (80 mg/L), KNO3 (125 mg/L), Ca (nr3)2‧4H2O (500 mg/L), MgSO4‧7H2O (125 mg/L), KH2PO4 (125 mg/L ), MnSO4‧4H2O (3 mg/L), ZnSO4‧7H2O (0,5 mg/L), H3BO3 (10 mg/L), CuSO4‧5H2O (0,025 mg/L), Na2MoO4‧2H2O (0,025 mg/L), sackaros (50.000 mg/L) och kasein (500 mg/L). Det förberedda mediet kan lagras vid 4 ° C i 4 månader minst. - Förbereda 26% (w/v) polyetylenglykol använder Ånghärdad avjoniserat vatten och filtrera lösningen med 0,3 µm porstorlek filter.
Obs: Det förberedda mediet kan lagras vid 4 ° C i 1 månad. - Blanda de reagens som bereddes i steg 3.1 och 3.2 i förhållandet 1:1 (v/v).
Obs: Detta medium bör vara beredda färska för varje användning.
4. beredning av In Vitro cellodlingsmedium för rothår (Arabidopsis thaliana)
- Bered en lösning av 0,215% (w/v) Murashige & Skoog Medium, 0,05% (w/v) MES, 1% (w/v) sackaros och 1% (w/v) agar i avjoniserat vatten. Autoklav lösningen vid 121 ° C i 20 min.
5. beredning av In Vitro cellodlingsmedium för Moss Protonemata (Physcomitrella patens)
- Preinkubera de moss-protonemata i BCDAT medium16 i en petriskål.
Obs: Sammansättningen av BCDAT medium är 1 mM MgSO4, 10 mM KNO3, 45 µM FeSO4, 1,8 mM KH2PO4 (pH justeras till 6,5 med KOH), spårämne lösning (0,22 µM CuSO4, 0,19 µM ZnSO4, 10 µM H3BO 30.1 µM Na2MoO4, 2 µM MnCl2, 0,23 µM CoCl2och 0.17 µM KI), 1 mM CaCl2och 5 mM diammoniumfosfat (+)-tartrat. - Kultur mossa i BCDATG medium i microdevice.
Obs: BCDATG mediet är BCDAT medium med 0,5% (w/v) glukos. Det förberedda mediet kan lagras vid 4 ° C i 1 månad.
6. in Vitro Culturing T. fournieri Pollen rör i Microdevice
- Placera den pollen tube microdevice i en vakuumkammare och degas i 20 min.
- Ta bort microdevice från vakuumkammare och introducera odlingsmedium till inloppet pistill med hjälp av en mikropipett med en mycket fin spets. Fyll återstående brunnarna till deras toppar med samma medium. Vänta några minuter tills alla mikrokanaler är fyllda med medlet av det vakuum som skapats inuti mikrokanaler.
- Placera några våt pappershandduk i glas botten skålen att bibehålla fuktigheten i skålen.
- Överföra pollenkorn från en vildtyp T. fournieri 'blå och vita' blomma till dess stigma med en dissektion nål.
Obs: Vi har även utfört detta experiment med en transgena T. fournieri 'Crown violett' blomma (den RPS5Ap::H2B-tdTomato linje17), med pollen rör som innehåller fluorescently märkt spermier och vegetativa atomkärnor. - Skär den pollinated stilen (1 cm långa) med hjälp av ett blad.
- Infoga den skurna stilen i öppningen av enheten som visas i figur 2.
- Sätta ett lock på skålen och försegla den med tejp.
- Placera enheten i en inkubator vid 28 ° C för 5-6 h i mörker.
7. in Vitro Culturing av A. thaliana rothår i Microdevice
Obs: Steg 7,1-7,9 (utom 7,3 och 7,5) bör utföras i en LAF.
- Sterilisera frön från A. thaliana Columbia (Col-0) och de transgena linje UBQ10pro::H2B-mClover (innehållande fluorescerande nukleära markören) genom att blötlägga dem i steril vätska (5% (v/v) hushållsblekmedel och 0,02% (v/v) Triton x-100) för 5 min.
- Skölj ordentligt steriliserade frön med Ånghärdad vatten.
- Lagra sköljda frön i vatten i 2 dagar vid 4 ° C i mörker.
- Sterilisera microdevice under UV-ljus under natten.
- Placera microdevice i en vakuumkammare och degas i 20 min.
- Presentera odlingsmedium för brunnar i enheten med hjälp av en mikropipett. Vänta några minuter tills vakuum fyller alla mikrokanaler med medlet.
- Placera autoklaveras våta hushållspapper i glas botten skålen att bibehålla fuktigheten i skålen.
- Över en steriliserad utsäde till öppningen av enheten.
- Sätta ett lock på skålen och försegla den med tejp.
- Placera enheten vertikalt i en inkubator vid 22 ° C under kontinuerlig vitt ljus.
- Kontrollera root hårväxt efter 4-10 dagars inkubation. Få både ljusa fält och fluorescerande bilder med ett inverterat Mikroskop.
8. in Vitro Culturing av P. patens (moss) Protonemata i ultrakalla enheten
Obs: Steg 8,2-8,6 (förutom 8,3) bör utföras i en LAF.
- Preculture P. patens stam Gransden 200418 på BCDAT medium täckt med cellofan i en petriskål i en vecka under kontinuerlig vitt ljus vid 25 ° C.
- Sterilisera microdevice i UV-belysning över natten i en LAF.
- Placera microdevice i en vakuumkammare och degas i 20 min.
- Presentera odlingsmedium för brunnarna med hjälp av en mikropipett. Vänta några minuter tills vakuum fyller alla mikrokanaler med medlet.
- Tillsätt Ånghärdad vatten i skålen kring microdevice för att bibehålla fuktigheten i skålen.
- Överföra en liten bit av moss protonemata vävnad till öppningen av microdevice och kultur vävnaden i en inkubator vid 25 ° C under kontinuerlig vitt ljus.
- Kontrollera moss protonemata tillväxten efter 2-3 veckors ruvning. Få ljusa fält bilder med hjälp av ett mikroskop.
9. time-lapse avbildning av T. fournieri Pollen Tube tillväxt
- Placera microdevice på en inverterad fluorescens Mikroskop utrustat med bild förvärv maskinvara (t.ex., en CCD-kamera) och programvara. Hitta de microgap platserna.
Obs: För förvärvet bildbehandlingsprogram använde vi en kommersiellt tillgänglig produkt (Tabell för material). Öppen källkod mikroskopi programvara såsom µManager är också tillgängliga online (https://micro-manager.org/wiki/Micro-Manager). Vi rekommenderar att du installerar en Mikroskop kondensor på mikroskopet få bilder med högre upplösning. - Fånga ljusa fält bilder varje 10 s med mikroskopet förvärv bildbehandlingsprogram.
- För att iaktta fluorescently märkt sädesceller och vegetativa kärnan i pollen röret av raden RPS5Ap::H2B-tdTomato , bestråla provexemplaret med 561 nm laser och använda en optisk bandpassfilter (578/105 nm).
Obs: Även om time-lapse bilder av pollen tube tillväxt fångades ofta, imaging föreföll inte påverka tillväxten. Dock är det alltid rekommenderat att minimera den laser intensitet, exponeringstid och time-lapse intervall, för att minimera fototoxicitet och fotoblekning av fluorophore. - Justera ljusstyrka och kontrast i bilderna och förbereda en videofil med ImageJ programvara (https://imagej.nih.gov/ij/).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som illustreras i figur 1, möter tip-växande växtceller en rad fysiska barriärer längs deras tillväxt sökvägar i vivo. Simuleras i vitro cell kultur plattformarna presenteras i denna studie aktiverat undersökningen den tip växande process i tre typer av växtceller (pollen rör, rothår och moss protonemata) genom 1 µm konstgjorda luckor (figur 3, Figur 4, figur 5). För pollen tube studien användes live-cell imaging att övervaka morfologiska förändringar i apikala regionen av pollen rör samt vegetativa nucleus och spermier celler som svar på möter ett extremt litet utrymme (kompletterande film 1 och 2).
Även om de flesta av microgaps var framgångsrikt fabricerade genom att använda den metod som beskrivs här, vi märkte att några av dem var helt stängd (figur 6). Eftersom de 1 µm breda kanaler som skapats på kisel mögel är ömtåliga, kan upprepad användning av detta mögel skada luckorna, vilket leder till gap blockerar PDMS i lagret. Därför, innan du utför experimentet, det är viktigt att kontrollera att de PDMS microgaps är intakt.
Figur 1: genomträngningen av tip växande växtceller till fysiskt begränsade utrymmen. (A) Pollen tube elongating genom flera fysiska hinder på sin väg till en fröämnet. Hinder inkluderar överföring tarmkanalen vävnad i stil och de hovdjurens kring micropyle. (B) rothår tränger igenom tät jord. Inläggningar i (A) och (B) Visa utvidgningar av Regionkommittén boxed. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Kännetecken av den microdevices som används för att studera T. fournieri pollen rör, A. thaliana rothår och P. patens protonemata. i de schematiska ritningarna av mikrokanaler, en provet placeras på plats som anges av en asterisk mark (*). MicroChannel mönster, fotografier av varje enhet, kanal strukturer och cell odlingsskålar perioder summeras. Denna siffra har ändrats med tillstånd från Yanagisawa et al. 201719. Skala bar, 20 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3: T. fournieri pollen tube töjning genom en lucka i 1 µm. (A) Pollen tube passerar genom en 1 µm breda och 4 µm hög lucka. Time-lapse ljusa fält bilder fångades med ett inverterat Mikroskop utrustat med en spinning-disk confocal systemet. Skalstapeln, 20 µm. (B) tid förflutit bilder av en fluorescently märkt vegetativt kärna och sädesceller i en pollen tub av den RPS5Ap::H2B-tdTomato linje korsar microgap. Skalstapeln, 20 µm. figur (A) och (B) har ändrats med tillstånd från Yanagisawa et al. 201719. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. A. thaliana rotahåret töjning genom en 1 µm gap. (A) rot och rot hår tillväxt i microdevice. Microgaps (1 µm i bredd) och 4 µm i höjd ligger på vänster sida av roten Tillväxtbanan. Mikrokanaler på höger sida innehåller inte microgaps och kan användas som en kontroll. Skalstapeln, 100 µm. (B) ljusa fält, (C) fluorescens och (D) samman bilder av rothår som passerar genom microgaps. Atomkärnor i rothår etiketten fluorescently i raden UBQ10pro::H2B-mClover . Spetsen på varje rotahåret indikeras av en pil. Skalstapeln, 30 µm. Dessa siffror har ändrats med tillstånd från Yanagisawa et al. 201719. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. P. patens protonemata töjning genom en 1 µm gap. Moss protonemata celler passerar genom ett 1 µm mellanrum (4 µm i höjd), som utvidgades på grund av saftspänningen av protonemata. Skalstapeln, 20 µm. Figuren är modifierad med tillstånd från Yanagisawa et al. 201719. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. Stängt microgaps. SEM-bild av regionen gap 1 µm. Microgap till höger är helt stängd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande film 1. Pollen tube tillväxt genom ett 1 µm mellanrum. Time-lapse ljusa fält bilder fångades varje 10 s med ett inverterat Mikroskop utrustat med en snurrande bricka confocal Mikroskop. Skala bar, 20 µm. vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Kompletterande film 2. Penetration av vegetativa nucleus och spermier celler genom ett 1 µm mellanrum. Time-lapse ljusa fält och fluorescens bilder fångades varje 20 s med en inverterad fluorescens Mikroskop. Skala bar, 20 µm. vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flera kritiska steg i protokollet behöver följas exakt för att få de resultat som presenteras ovan. Först, PDMS lager och glas botten maträtt ytor måste båda behandlas med plasma för en tillräckligt lång tid innan limning. Annars kan PDMS lagret lokalt lossna från glasytan medan tip växande celler korsar microgaps. Ett annat avgörande steg i rotahåret och moss protonemata protokollet är sterilisering av microdevice. Normalt behöver rothår och moss protonemata celler vara odlade i microdevice för ett par veckor. Utan att sterilisera enheten, kan mikroorganismer blomstra, vilket kan påverka tillväxten av dessa tips växande celler. Sterilisering av pollen tube enheten är inte lika kritisk, eftersom experimentet avslutas inom en halv dag. Vi har regelbundet använt pollen tube enheten utan sterilisering och iakttog inte några oönskade effekter under experimentet.
Microchannel utformningen bör modifieras enligt cellerna av intresse. I vårt arbete var kanal design används för A. thaliana rotahåret experimentet annorlunda från den som används för T. fournieri pollen röret och P. patens protonemata experimenten. Olika enheter krävs eftersom proverna har olika dimensioner; exempelvis är rothår mycket kortare än pollen rör och mossa protonemata. Vår rotahåret enhet var därför utformat så att de microgap regionerna var intill kanalen huvudsakliga roten. Förutom den kanal designen varierar förfarandet för förbereder rotahåret enheten också från de förfaranden som används för pollen rör eller mossa protonemata. Pollen tube och moss protonemata i studierna använde vi en microdevice som innehåller ett enda PDMS-lager med den mikrokanaler tätad mot ett glas botten maträtt. Dock den anordning som används för att studera rothår består av två PDMS lager: det översta lagret med en microchannel (djup: 200 µm) för huvudsakliga roten är tätad mot bottenlagret, innehållande mikrokanaler (djup: 4 µm) för rothår. Den standard photolithography-teknik som var anställd för att fabricera silikon mögel är begränsad till ett bildförhållande på runt 5:1. Därför, för att skapa en 1 µm breda lucka, kanal höjden kommer att begränsas till cirka 5 µm. Det är också tekniskt utmanande att exakt anpassa en djup kanal (t.ex., 200 µm) nära 1 µm breda gapet på en silikon mögel. Därför vi förberett separata PDMS lager för huvudsakliga roten och rothår, och konstruerade enheten genom att täta dem tillsammans.
Medan detta protokoll har framgångsrikt använts för att visualisera spetsen växande process av pollen rör genom microgaps (kompletterande film 1 och 2), time-lapse imaging av roten hår och moss protonemata töjning vid microgap regionen skulle vara mer utmanande. I den microdevice som används för odling av A. thaliana rothår, är höjd sida kanaler där microgaps är beläget (4 µm) mycket ytligare än roten tillväxt kammaren (200 µm), så de flesta rothår inte kan gå vidare till de sida kanalerna. Även om rothår hittar kanal sidoingången, är det svårt att förutsäga när de kommer in. För att fånga time-lapse bilder av roten hårväxt på microgap, rekommenderar vi att du använder Mikroskop utrustad med en automatiserad steg som kan programmeras att vara beläget på flera positioner för bild förvärv. När sådana instrumentering är otillgänglig, föreslår vi att söka efter de rothår som redan har angett de sida kanalerna men har ännu inte passerat microgaps. Eftersom ökningen av A. thaliana rothår är mycket långsammare (normalt 1-2,5 µm/min20) än hos T. fournieri pollen rör (vanligtvis 22-23 µm/min19), kan det vara möjligt att fånga time-lapse bilder av dessa rothår som är på väg att korsa microgaps. Däremot, kräver moss protonemata observationer en time-lapse system som kan användas enbart för denna studie, eftersom en förlängd observationsperiod krävs på grund av den långsamma tillväxten.
Metoden mikroflödessystem som presenteras här är den första metoden som tillåter oss att studera tip växande växtceller förmåga att elongate genom extremt trånga utrymmen. Dessa microdevices kan vara användbar för screening analyser som undersöka fungerar av gener associerade med växtcellväggar och integritet tip växande celler via deras penetration förmåga. Dessutom Denais et al. 21 nyligen visat en kärn kuvert bristning och reparation mekanism genom att klämma en cancercell genom ett trångt utrymme som förberett i en mikroflödessystem enhet, och det kan vara möjligt att undersöka om en liknande mekanism finns i pollen rören med hjälp av våra enheten. Denna nyutvecklade experimentell plattform kan användas för att undersöka hur enskilda celler svarar på fysiskt begränsade utrymmen och kan därmed förbättra vår förståelse av tip-tillväxt mekanismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
Vi tackar H. Tsutsui och D. Kurihara för att förse oss med transgena växter, inklusive T. fournieriRPS5Ap::H2B-tdTomato linjen och A. thaliana UBQ10pro::H2B-mClover linjen, respektive. Detta arbete stöds av institutet av omvälvande Bio-molekylerna i Nagoya University och Japan avancerade Plant Science Network. Ekonomiskt stöd för detta arbete lämnades av bidrag från Japan Science och Technology Agency (ERATO projektanslag nr. JPMJER1004 för T.H.), ett bidrag för vetenskaplig forskning på innovativa områden (Nos. JP16H06465 och JP16H06464 för T.H.), och Japan Society for de befordran av vetenskap (JSPS) Grants-in-Aid för utmanande förberedande forskning (grant nr 26600061 för N.Y. och grant nr 25650075 och 15 K 14542 för Y.S.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS | Dow Corning Co. | Sylgard184 | |
| Murashige & Skoog Medium | Wako Pure Chemical | 392-00591 | |
| MES | Dojindo | 345-01625 | |
| Sucrose | Wako Pure Chemical | 196-00015 | |
| 50 mm glass-bottom dish | Matsunami Glass | D210402 | |
| 35 mm glass-bottom dish | Iwaki | 3971-035 | |
| Surgical blade | Feather | No.11 | |
| biopsy punches | Harris | Uni-Core | |
| Gel loading tips | Bio-Bik | 124-R-204 | |
| Inverted Microscope | Olympus | IX83 | |
| CSU-W1 | Yokogawa Electric | No Catalog number is avairable for this customized microscope | |
| MetaMorph imaging software | Molecular Devices |
References
- Higashiyama, T., Takeuchi, H. The Mechanism and Key Molecules Involved in Pollen Tube Guidance. Annu. Rev. Plant. Biol. 66, 393-413 (2015).
- Vogler, H., Shamsudhin, N., Nelson, B. J., Grossniklaus, U. Measuring cytomechanical forces on growing pollen tubes. Pollen Tip Growth. Obermeyer, G., Feijó, J. , Springer. 65-85 (2017).
- Kehr, J., Wagner, C., Willmitzer, L., Fisahn, J. Effect of modified carbon allocation on turgor, osmolality, sugar and potassium content and membrane potential in the epidermis of transgenic potato (Solanum tuberosum L.) plants. J. Exp. Bot. 50 (334), 565-571 (1999).
- Benkert, R., Obermeyer, G., Bentrup, F. W. The turgor pressure of growing lily pollen tubes. Protoplasma. 198, 1-8 (1997).
- Vogler, H., et al. The pollen tube: a soft shell with a hard core. Plant J. 73 (4), 617-627 (2013).
- Shamsudhin, N., et al. Massively parallelized pollen tube guidance and mechanical measurements on a Lab-on-a-Chip platform. PloS one. 11 (12), e0168138 (2016).
- Cheung, A. Y., Boavida, L. C., Aggarwal, M., Wu, H. M., Feijó, J. A. The pollen tube journey in the pistil and imaging the in vivo process by two-photon microscopy. J Exp Bot. 61 (7), 1907-1915 (2010).
- Metzner, R., et al. Direct comparison of MRI and X-ray CT technologies for 3D imaging of root systems in soil: Potential and challenges for root trait quantification. Plant Methods. 11 (1), 1-11 (2015).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft Lithography. Angew Chemie Int Ed. 37 (5), 550-575 (1998).
- Massalha, H., Korenblum, E., Malitsky, S., Shapiro, O. H., Aharoni, A. Live imaging of root-bacteria interactions in a microfluidics setup. P Natl Acad Sci. 114 (17), 4549-4554 (2017).
- Grossmann, G., et al. Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using the RootChip. J Vis Exp. (65), (2012).
- Busch, W., et al. A microfluidic device and computational platform for high-throughput live imaging of gene expression. Nature Methods. 9, 1101-1106 (2012).
- Parashar, A., Pandey, S. Plant-in-chip: Microfluidic system for studying root growth and pathogenic interactions in Arabidopsis. Appl. Phys. Lett. 98, 263703 (2011).
- Bascom, C. S., Wu, S. -Z., Nelson, K., Oakey, J., Bezanilla, M. Long-Term Growth of Moss. in Microfluidic Devices Enables Subcellular Studies in Development. Plant Physiol. 172 (1), 28-37 (2016).
- Higashiyama, T., Kuroiwa, H., Kawano, S., Kuroiwa, T. Guidance in vitro of the pollen tube to the naked embryo sac of Torenia fournieri. Plant Cell. 10, 2019-2032 (1998).
- Nishiyama, T., Hiwatashi, Y., Sakakibara, K., Kato, M., Hasebe, M. Tagged mutagenesis and gene-trap in the moss, Physcomitrella patens by shuttle mutagenesis. DNA Res. 7, 9-17 (2000).
- Maruyama, D., et al. Independent Control by Each Female Gamete Prevents the Attraction of Multiple Pollen Tubes. Dev. Cell. 25 (3), 317-323 (2013).
- Rensing, S., et al. The Physcomitrella genome reveals evolutionary insights into the conquest of land by plants. Science. 319, 64-69 (2008).
- Yanagisawa, N., Sugimoto, N., Arata, H., Higashiyama, T., Sato, Y. Capability of tip-growing plant cells to penetrate into extremely narrow gaps. Sci. Rep. 7 (1), 1403 (2017).
- Dolan, L., et al. Clonal relationships and cell patterning in the root epidermis of Arabidopsis. Development. 120, 2465-2474 (1994).
- Denais, C. M., et al. Nuclear envelope rupture and repair during cancer cell migration. Science. 352 (6283), 353-358 (2016).
