Summary
لا رجعة فيه انهانسر (غضب) أسلوب الاجتثاث غير الحرارية المستخدمة لعلاج سرطان البنكرياس المتقدم محلياً. هي كونها تقنية جديدة نسبيا، آثار غضب على نمو الورم غير مفهومة. قمنا بتطوير نموذج ماوس سينجينيك التي تسهل دراسة آثار غضب على سرطان البنكرياس.
Abstract
وقد تهرب سرطان البنكرياس (PC)، مرض الذي يودي بحياة حوالي 40,000 المرضى في كل سنة في الولايات المتحدة، بنجاح عدة النهج العلاجية بما في ذلك الاستراتيجيات إيمونوثيرابيوتيك التي تبشر بالخير. لا رجعة فيه انهانسر (غضب) هو أسلوب الاجتثاث غير الحرارية التي يستحث موت الخلايا السرطانية دون تدمير الهياكل collagenous المتاخمة، مما يتيح الإجراء المراد تنفيذها في أورام قريبة جداً من الأوعية الدموية. خلافا لتقنيات الاستئصال الحراري، غضب يؤدي إلى موت الخلية apoptotic تدريجيا، جنبا إلى جنب مع نخر الاجتثاث الفوري التي يتسبب فيها، وهو حاليا قيد الاستخدام السريري للمرضى المحدد مع الكمبيوتر المتقدمة محلياً. الجر، يمكن لإجراءات محددة غير المستهدفة مثل غضب حمل عددا كبيرا من الردود في ورم المكروية. دراسات قليلة تناولت آثار غضب على نمو الأورام في أنواع أخرى من الأورام، ولكن بلا ركزت على جهاز الكمبيوتر. قمنا بتطوير نموذج ماوس سينجينيك للكمبيوتر يمكن فيه تحت الجلد (ميدان) وأورثوتوبيك علاج الأورام بنجاح مع غضب في وضع شديد، وتيسير مختلف الدراسات الطولية بعد الإجراء. هذا نموذج الحيوان بمثابة نظام قوي لدراسة آثار غضب والسبل الكفيلة بتحسين فعالية سريرية من غضب.
Introduction
من المتوقع أن تصبح السبب الرئيسي الثاني لوفيات السرطان في الولايات المتحدة حوالي عام 20201البنكرياس الأقنية غدية (PC). الغالبية العظمى من المرضى الذين شخصت مع الكمبيوتر سوف يموت في نهاية المطاف من المرض المنتشر بعيد2. المكروية الكمبيوتر كآبته المعروف وتشيموريسيستانت. ستروما ديسموبلاستيك به يحتوي على ندرة الخلايا T المستجيب (المضادة للورم) ومكانه من الكريات البيضاء المثبطة للمناعة، بما في ذلك الورم المرتبطة الضامة (تامس)، القامع المشتقة النقوي الخلايا (مدسكس)، والخلايا T التنظيمية (تريجس)3 . وهذه تكمن وراء الحاجة إلى تطوير استراتيجيات النقل المتعدد الوسائط للتصدي لهذه الآثار المكروية.
وقد وضعت غضب كأسلوب غير الحرارية للاستئصال الورم. خلافا لتقنيات الاستئصال الحراري، غضب لا يسبب نخر coagulative السريع، لكن النتائج بدلاً من ذلك في موت الخلية apoptotic التدريجي4. الأهم من ذلك لاورام البنكرياس، غضب ليس عرضه لتأثيرات "بالوعة الحرارة" ويمكن أن يؤديها بجوار الأوعية الدموية5. هذه التكنولوجيا قد إزالة 510(k) من إدارة الأغذية والعقاقير6 ، وهي تستخدم حاليا سريرياً، للمرضى المحدد مع إقامة سرطان البنكرياس resectable محلياً متقدمة أو الشريط الحدودي. في أكبر سلسلة المنشورة من غضب للكمبيوتر7، كان متوسط بقاء المرضى الذين يخضعون لغضب تقريبا مزدوجة البقاء على قيد الحياة للمرضى الذين يعالجون بالعلاج الكيماوي الحديثة وحدها دون استئصال8،9.
أظهرت العديد من الدراسات أن الاجتثاث الحرارية الحث استجابة المناعية النظمية في سائر أنواع الورم (استعرض في Chu et al. 10)-الترددات الراديوية الاجتثاث (احتياطي اﻹيواء الميداني) في ورم الحيوان نماذج يؤدي إلى زيادة تي خلية يخترق11،12، بما في ذلك زيادة في الخلايا القاتلة الطبيعية المنشط (ناغورني كاراباخ) في المرضى سرطانه الخلية السرطان13، 14، وانخفاض في تريجس المثبطة للمناعة في مرضى سرطان الرئة15. وقد درست عدد أقل من الدراسات المناعي، ميكرونفيرونمينتال، واستجابات الإصابة إلى غضب16. غضب ما ثبت أنه يحفز استجابة المناعة النظمية في نماذج الماوس الأشخاص فيها نمو allografts الثانوي الخلايا الكلوية (كونترالاتيرال) كان خفض أو منع بغضب للورم الابتدائي أسبوعين قبل17. ولاحظوا أيضا أن الفئران الأشخاص المطلوب أقل الجهد للانحدار كاملة عما الفئران المناعة. قد تم الافتراض بأن غضب قد يؤدي عرض مستضد محسنة مقارنة بنخر coagulative من الاستئصال الحراري، ولكن هذا ليس تحديداً ودرست.
قمنا بتطوير نموذج ماوس سينجينيك للكمبيوتر من خط خلية 4580 فيلق حماية كوسوفو-لوك (هدية من جي جي ية في جامعة كارولاينا الشمالية)، المستمد من ورم التي وضعت في ذكور LSL-كراسG12D/+؛ LSL-Trp53R172H/+؛ PDX1Cre/+؛ LSL-ROSA26 لوك/+ الماوس، لدراسة آثار غضب18،19وجهازيه. هذا الخط خلية معربا عن لوسيفراس مكسبه والورميه أيضا في الأشخاص C57BL/6 الفئران عند حقن مربعا أو أورثوتوبيكالي وموثوق بها وتنتج الانبثاث الكبد عند حقنها في الطحال. ونحن قد استخدمت مولد نبض موجه مربعة قابلة لبرمجة توصيل نبضات المايكروثانيه 100 من الكهرباء بنسبة جهد/مسافة من 1,500 V/سم باستخدام مسبار إبرة اثنين الصفيف (مفصولة 5 مم) أو تروديس الملاقط البلاتين للأورام ميدان أو أورثوتوبيك، على التوالي، في الفئران نموذج آثار غضب في حيوانات صغيرة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
إجراء جميع التجارب على الحيوانات التالية هذا البروتوكول يجب أن يقرها كل "العناية بالحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك). جميع الإجراءات الموصوفة هنا أقرتها جامعة كاليفورنيا سان دييغو إياكوك.
1-شراء الحيوانات المستفيدة
ملاحظة: أنشئ خط الخلية 4580 لوك فيلق حماية كوسوفو من ورم الناشئة عن LSL-كراسG12D/+؛ LSL-Trp53R172H/+؛ PDX1Cre/+؛ LSL-ROSA26 لوك/+ الماوس (KPC)، التي تعد نموذجا وراثيا للكمبيوتر على خلفية C57BL/6. وميزة هذا الخط خلية أن مؤثرا وتعرب عن تمكين لوسيفراس الورم الرصد في نماذج أورثوتوبيك. ومع ذلك، كما يمكن استخدام خطوط الخلايا الأخرى طالما أنها تتوافق مع الخلفية الوراثية للفئران المستفيدة.
- تحديد المجموعات التجريبية والعدد من الحيوانات في كل مجموعة في وقت مبكر.
- اختر السن (6-10-الأسبوع القديمة الفئران الموصى بها) ويستخدم الجنس للحيوانات المستخدمة وفقا للفرضية وخط الخلية.
2-الثقافة الخلايا
- استخدام دولبيكو تعديل النسر المتوسطة (دميم): مزيج المغذيات F12 الوسائط (50/50) التي تحتوي على 10% مصل بقرى الجنين (FBS) والمضادات الحيوية البنسلين والستربتوميسين 1% (وسائط النمو الكامل) أن تنمو خلايا 4580 لوك فيلق حماية كوسوفو.
- في حالة تجمد، إذابة الخلايا 4 أيام قبل غرس الورم.
- تنمو الخلايا في 37 درجة مئوية مع 5% CO2 و 95% رطوبة تحت ظروف معقمة.
- تريبسينيزي الخلايا مع 0.25% التربسين لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية قبل أن تصل إلى > كونفلوينسي 80% وتحييد التربسين بإضافة مرتين حجم وسائط النمو الكامل.
ملاحظة: هذه الخلايا لا تنشئ الأورام كفاءة في الفئران إذا استخدمت في كونفلوينسي 100%، أو إذا كانت هي باساجيد لأكثر من 12 مرة. ومن ثم، فمن المستحسن لتجميد الخلايا في فقرات سابقة تحت كونفلوينسي الأمثل. - عد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير والمضي قدما لتحريض الأورام في حالة وجود إعداد كافية (0.5-1 × 106 خلايا/الماوس). إذا لم يكن الأمر كذلك، توسيع نطاق الخلايا لمرور أكثر واحد حتى يتم الحصول على إعداد كافية من الخلايا.
3-تنظيم دورات تعريفية للأورام مربعا
- إعداد المواد المطلوبة: P1000 و P100 الماصات ونصائح، حقنه 1 مل، 25 ز الإبر، الغشاء مصفوفة (بم)، دميم الوسائط القاعدية، 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي. الحفاظ على جميع المواد المعقمة والباردة (4 درجة مئوية) حتى نهاية الإجراءات. كما تبقى مقص الشعر ومسحات الكحول جاهزة للاستعمال الحيواني.
- تريبسينيزي (حسب الخطوة 2.4) عد الخلايا وريسوسبيند لهم بتركيز 2-4 × 107 خلايا/مل من دميم الباردة.
- إضافة وحدة تخزين تساوي 100% بم جعل تعليق خلية نهائي في 50% بم. وحدة التخزين النهائي ينبغي أن تصل إلى 50 ميليلتر من تعليق خلية لكل الماوس المطلوبة. إعداد 10% في الزائدة لاستيعاب الفضاء الميت في المحاقن، وعن أية أخطاء بيبيتينج.
- اليكووت وضع التعليق في مجلدات ميليلتر 550 في أنابيب الطرد المركزي 1.5 مل في الجليد.
- كبح جماح الحيوانات (6-الأسبوع القديمة ذكور الفئران C57BL/6) باستخدام ريسترينير أو يدوياً.
ملاحظة: بدلاً من ذلك، الفئران يمكن أن تكون فظاعتها مع isoflurane 2.5% في غاز الأكسجين بمعدل تدفق لاستخدام المبخر دقة 2 لتر في الدقيقة. - موقع الحقن، التي يفضل أن يستخدم في الجناح أعلى ساق، ماكينة الحلاقة. استخدام مسحه الكحول، تنظيف موقع حقن مرتين.
- رسم 250 ميليلتر من تعليق خلية في تركيز نهائي من 1-2 × 107 خلايا/مل في حقنه البرد 1 مل وإزالة أي فقاعات الهواء عن طريق تحريك المكبس صعودا وهبوطاً. إرفاق إبرة ز 25 للمحاقن وتأكد لملء المساحة داخل الإبرة.
- عناية إدراج إبرة تحت الجلد بزاوية 30 درجة إلى الجسم القرب من الجناحين، التأكد من أن الإبرة لا بيرس التجويف الصفاقى أو الجهاز العضلي من أطرافه.
- تسطيح الإبرة موازية للجسم، وتسطيح التجاعيد على الجلد. ببطء بحقن 50 ميليلتر من تعليق خلية. اضغط الإبرة في موقع الحقن لمدة 10 ق للسماح بم على ترسيخ لمنع أي تسرب.
- سحب الإبرة إبقائها موازية دون أي حركة جانبية ببطء. بلطف تنظيف مكان الحقن بمسحه الكحول وحرر الماوس السكن.
ملاحظة: إذا تم تخديره الماوس أثناء الإجراء، رصد هذا الحيوان حتى تستعيد به ردود الفعل رايتينج. - رصد نمو الورم بانتظام باستخدام الفرجار حتى يصل قطرها 5 ملم.
4-تنظيم دورات تعريفية للأورام أورثوتوبيك
- إعداد المواد المطلوبة. اﻷوتوكﻻف العمليات الجراحية وأدوات مثل المقص، المشارط، إبرة السائقين، وأشار الملقط مسطحة ذات الرؤوس. تبقى يدوية خيوط عقيمة (الامتصاص 6-0 و 4-0 غير الامتصاص) ومسحات الكحول ومقص الشعر، كريم مزيل الشعر، تشحيم العين، شاش القطن، حل اليود 10% البوفيدون، الستائر الجراحية، ومنصات التدفئة، البوبرينورفين ووكلاء مخدر.
- Euthanize ماوس مانحة (يفضل أن تكون من نفس الخلفية اللازمة لنموذج أورثوتوبيك) تحمل ورم ميدان فيلق حماية كوسوفو باستخدام دائرة تعبئة بطيئة CO2 . المكوس الورم مربعا بعناية تحت ظروف معقمة في غطاء BSL-2 استخدام الملقط العقيمة وميكروسسيسورس قبل وقت قصير من زرع أورثوتوبيك. أثناء استئصال الورم الحرص على عدم ثقب التجويف الصفاقى وتغسل الورم مباشرة مع 2 تبادل PBS العقيمة.
- استخدام المشارط العقيمة، فرم الورم قصت في 1 ملم3 قطع ووضعها على طبق بتري يحتوي على البارد الإعلام القاعدي دميم العقيمة، وتخزين على الجليد حتى غرس.
- إدارة الماوس المتلقية 0.05-1 مغ/كغ البوبرينورفين مسكن مربعا، 30 دقيقة قبل الجراحة.
- تخدير الفئران المستفيدة مع إيسوفلوراني 2-3% في الأكسجين (2 لتر في الدقيقة) باستخدام المبخر دقة (أو وكلاء آخرين مخدر). تبقى الفئران على 37 درجة مئوية تدفئة وسادة للإجراء بأكملها. تطبيق مواد التشحيم للعين لمنع جفاف. اختبار عمق التخدير بسبب نقص مذهل منعكس في البداية، وتأكيد التخدير الجراحي الطائرة بعدم وجود دواسة العاكسة لقرصة إصبع لطيف. الحفاظ على التخدير أثناء الإجراءات الجراحية بأكملها.
- ضع الماوس على ظهرها ولطف تحويلها إلى الجانب الأيمن حيث أن يتعرض الجانب الأيسر من البطن. إزالة شعر البطن من الماوس باستخدام كريم مزيل الشعر وتنظيف مع الشاش لضمان لا الشعر الحر يدخل شق آخر بطنه. إعداد البطن الأيسر للجراحة باستخدام 3 دورات من اليود البوفيدون 10% تليها مناديل الكحول لتطهير الجلد.
- استخدام مشرط معقم، جعل شق عرضية أو مائلة 1.5 سم في الجلد، 1 سم إلى اليسار من خط الوسط، أسفل القفص الصدري، الآنسي قليلاً إلى الطحال. ثم، تمديد شق عن طريق عضلات البطن، النسخ المتطابق شق سطحية السطحية.
- موقع الطحال استخدام شقة مقلوب الملقط وتخريج ذلك بلطف من تجويف البطن. التراجع عن الطحال باستخدام قضيب القطن معقمة، والعثور على ذيل البنكرياس تعلق على الجزء السفلي من الطحال.
- استخدام الملقط مسطحة ذات الرؤوس، سحب ذيل البنكرياس أفقياً.
- التقاط قطعة واحدة الورم مفروم ناعما من الماوس المانحة مع غيض من إبرة سوتورينج العقيمة غرامة (6-0)، ووضعه باستخدام الملقط العقيمة.
- بينما بلطف سحب الذيل/الجسم البنكرياس جانبياً، إدراج إبرة خياطة تحتوي على جزء الورم في ذيل البنكرياس. تمرير خياطة ببطء من خلال الأنسجة، عقد الورم على اتصال بذيل البنكرياس. تطبيق واحد أو اثنين من خيوط إضافية تبعاً لاتجاه جزء التعليمات فيما يتعلق بالانسجة.
- إزالة الإبرة تماما من الأنسجة وإبقاء البنكرياس/الطحال تخريجها 60 إضافية s خلال تفقده لأي علامات نزيف أو تسرب. ثم استيعابها بلطف في تجويف البطن باستخدام الملقط حادة.
- عضلات البطن باستخدام 6-0 خياطة قابلة لامتصاص أما مع غرزة متواصلة أو متقطعة أغلق، والجلد السطحية باستخدام 3-0 بخياطة متقطعة غير الامتصاص 6-0. وقف التخدير في هذه المرحلة.
- تسمح الماوس لاسترداد في قفصة المنزل مع حرية الوصول إلى الغذاء والماء. ضع القفص على منصة تدفئة لتسهيل استرداد. رصد العلامات الحيوية مثل التنفس، ونضح إلخ، أثناء عملية الاسترداد.
- تأكيد علامات الاستقامة منعكس مرة واحدة الماوس للشفاء، ويمكن القفص ثم العودة إلى السكن العادية.
- إدارة البوبرينورفين 0.05-0.1 مغ/كغ ح 8-12 بعد الجراحة، وكل ح 8-12 بعد الإجراء كما هو مطلوب لعلامات ألم.
- رصد نمو الورم باستخدام في فيفو الإضاءة الحيوية نظام التصوير (انظر الجدول للمواد).
- تتبع نمو الورم بالتصوير اعتبارا من اليوم الرابع بعد زرع أورثوتوبيك، والقيام بالتصوير مرتين في أسبوع.
- في يوم التصوير، إدارة (الحقن داخل) 30 مغ/كغ لوسيفرين د أنيسثيتيزيد الماوس المتلقية (2-3% إيسوفلوراني في الأكسجين (2 لتر في الدقيقة)) 10 دقيقة قبل التصوير.
- صورة للنشاط لوسيفراس باستخدام الإعداد التﻷلؤ دون أي عوامل الانبعاثات للحد ني تعرض s 5 في تصوير التﻷلؤ السيارات-الأسفار مرحلة ساخنة مجانية ومع احتفاظها التخدير للفئران.
5-غضب أورام مربعا
- إعداد المواد المطلوبة: ساحة اليكتروبوراتور الموجه وسلامة القدم التبديل، أقطاب (إبرة الصفيف مقابل ترود الملاقط)، ومحولات. الحفاظ على خيوط عقيمة (غير امتصاص 4-0) ومسحات الكحول ومقص الشعر، كريم مزيل الشعر، زيوت التشحيم العين، شاش القطن، البوبرينورفين والمسكنات أيضا في الجوار.
- تعقيم الملاقط أو إبرة أقطاب صفيف باستخدام غازات التعقيم. لا ينصح بالتعقيم. استخدام التعقيم حبة زجاج تعقيم كهربائي بين الحيوانات.
- إدارة البوبرينورفين 0.05-0.1 مغ/كغ في الفئران الحاملة للورم 30 دقيقة قبل الإجراء.
- اتبع الخطوات 4.4-4.5 لحمل التخدير في الفئران بنجاح بمجرد زرع الورم مربعا يبلغ قطرها 5 ملم.
- ضع الماوس أنيسثيتيزيد على جانبها الوصول إلى الورم مربعا في الجناح. إزالة الشعر باستخدام مقص والجلد نظيفة باستخدام مسحه الكحول.
- للأورام مربعا، استخدام صفيف 2-إبرة كهربائية. رفع الجلد مباشرة تحت الموقع الورم باستخدام الملقط وإدراج الأقطاب من خلال الجلد موازية للهيئة التأكد من أنها لم تخترق التجويف الصفاقى. مرة واحدة عن طريق الجلد، ووضع أقطاب كهربائية في مثل هذه طريقة أنها قوس الورم.
- برنامج اليكتروبوراتور لتسليم 100 المايكروثانيه النبضات على تردد 1 هرتز في 1,500 الخامس/سم بالنسبة لإجمالي 150 البقول. توصيل نبضات استخدام دواسة القدم. فصل كل مجموعة من 10 نبضات من 10 ق، بغية السماح لتبديد الحرارة وتأكيد الموقف الصحيح من أقطاب كهربائية.
ملاحظة: دون استخدام وكلاء مشلول، سوف يتعرض الفئران تقلصات عضلة مع غضب يمكن أن تسبب تشريد الأقطاب إلا إذا حصل يدوياً. - إزالة الأقطاب بعد الجرعات الكاملة، التي لا ينبغي أن تتجاوز 200 سجل س. تسليم الجهد الفعلي، التي يتم عرضها على اليكتروبوراتور. السماح للفئران لاسترداد بعد غضب وفقا للخطوات 4.14-4.16.
6-غضب أورام أورثوتوبيك
ملاحظة: غضب أورام أورثوتوبيك ينطوي على عملية جراحية بقاء ثاني على الماوس نفسها مما يتطلب موافقة خاصة من إياكوك المحلية قبل بداية.
- إعداد المواد المطلوبة: اﻷوتوكﻻف الأدوات الجراحية مثل مقص، المشارط، إبرة السائقين، وأشار الملقط، ويميل شقة الملقط. تذكر ما يلي القريبة، وكذلك: خيوط عقيمة (الامتصاص 6-0 و 4-0 غير الامتصاص)، مسحات الكحول، مقص الشعر، كريم مزيل الشعر، تشحيم العين، شاش القطن، 10% محلول اليود البوفيدون، الستائر الجراحية، منصات التدفئة، اليكتروبوراتور موجه مربعة، سلامة القدم التبديل واقطاب كهربائية ومحولات، البوبرينورفين والمسكنات.
- تقييم الفئران لنمو الورم أورثوتوبيك بالتصوير في فيفو (راجع الخطوة 4، 17) عن طريق حقن 30 ملغ/كغ لوسيفرين د إينترابيريتونيلي.
ملاحظة: تعتبر مثالية لغضب العلاج 8 إلى 10 أيام بعد زرع الأورام أورثوتوبيك عندما تكون الأورام واضحة للعيان ولا تزال محصورة في البنكرياس كما يمكن أن يرى على الصور التﻷلؤ لوسيفراس (انظر نتائج الممثل). - اتبع الخطوات 4، 4-4-9، لتحديد موقع الورم مزروع. إذا ليس من السهل تحديد موقع الورم، استخدام ملقط الآنف حادة لتحريك المعدة والطحال برفق للتعرف على الورم.
- تخريج الورم مع ملقط الآنف حادة والتقاط الورم محكم مع أقطاب البلاتين من الملاقط-ترودي. توصيل نبضات انهانسر المبرمجة في خطوة 5.7 باستخدام اليكتروبوراتور موجه مربعة في مجموعات من 10 نبضات الخاضعة للتبديل سيرا على الأقدام.
- يبقى الورم تخريجها على الأقل 60 s وظيفة غضب لمراقبة أي علامات للنزيف. إدراج الورم مرة أخرى في تجويف البطن وإغلاق الشق كوصف (الخطوات السابقة 4.13-4.16) ورصد الماوس حتى أنه يتعافى.
- رصد آثار غضب على نمو الورم باستخدام التصوير في فيفو لوسيفراس حسب الخطوة 4.17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
نحن اتباع الإجراءات الموصوفة أعلاه، وتولد الأورام مربعا في الأسبوع 5-6 تلقيح الفئران C57BL/6 نوع البرية القديمة مع 1 × 106 خلايا مع 50% بم. عندما بلغ حجم الورم 5-6 ملم في القطر، عدد قليل من الفئران قد euthanized، وهذه الأورام قد اقتطعت، ومزروع أورثوتوبيكالي في فئران المستفيدة C57BL/6. وكان غضب غرس الوظيفة المؤداة 10 أيام كما هو مبين في الجدول الزمني في الشكل 1. غضب أجريت على الفئران المتبقية تحمل الأورام مربعا.
في ميدان الأورام، مدة الجهد ونبض غضب وأبقى مستمر في 1,500 الخامس/سم والمايكروثانيه 100، على التوالي، ولكن يختلف عدد النبضات. ويبين الشكل 2 أن الأورام مربعا في الفئران قليلة تراجعت تماما بعد البقول 150 من غضب ولكنه ليس كذلك مع البقول 75. وفي المجموع، أظهرت الفئران 4 من أصل 9 الانحدار الورم كاملة بعد البقول 150 من غضب. التحليل النسيجي للورم الأنسجة الأسبوع 1 وظيفة غضب أظهرت مناطق شاسعة من نخر الورم المركزية التي لا ينظر إليها في التحكم في علاج الأورام. هذا لب نخرية كان محاط بأنسجة الورم يعيش في حالات الورم غير مكتملة الانحدار (الشكل 3). كما تحقق نجاح غرس الورم أورثوتوبيك، وتم رصد معدل نمو استخدام التصوير الإضاءة الحيوية في الجسم الحي يظهر ورم في يوم 10 ويوم 15 (الشكل 4) بعد زرع. غضب في البقول 150 ثبت أيضا أن تكون فعالة في أورثوتوبيك الأورام (الشكل 5) عرض تخفيض حجم الورم. عموما، هذه النتائج تدل على قدرة هذا النموذج على محاكاة آثار غضب في نموذج ماوس الأشخاص، مما يوفر منبرا لاختبار مختلف ظروف غضب وتركيبات التعامل مع جهاز الكمبيوتر.
الشكل 1 : يظهر التمثيل التخطيطي بالطبع الوقت زرع الورم و IRE. للأورام مربع، يتم تنفيذ غضب حالما يصل الورم إلى 5-6 ملم في القطر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : التصوير بالإضاءة الحيوية لوسيفراس يظهر انخفاضا في نمو الورم وظيفة غضب في نموذج مربع. مؤسسة البترول الكويتية-لوك خط الخلية مؤثرا وتعرب عن لوسيفراس مما يجعل من الممكن لمراقبة نمو الأورام في استجابة لغضب في الوقت الحقيقي. الإضاءة الحيوية 14 يوم التصوير وظيفة غضب يظهر الانحدار كاملة من ورم في أحد الفئران تعامل مع البقول 150 من غضب، بينما كان ينظر الانحدار غير مكتملة مع البقول 75 من غضب عند مقارنة إلى عنصر التحكم غير المعالجة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : توضع وتلطيخ ويوزين أنسجة الورم يظهر آخر التغييرات في هندسة الأنسجة IRE. وأظهرت أورام مربعا تتعرض لغضب مناطق شاسعة من نخر مركزياً، محاطة بمناطق الأنسجة الحية مما يشير إلى عدم كفاية التغطية غضب في بعض الحالات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : يظهر التصوير بالإضاءة الحيوية الناجحة غرس الورم أورثوتوبيك ونموها مع مرور الوقت- تم أخذ صور استخدام الإضاءة الحيوية تجارية التصوير الصك مع التﻷلؤ تم التقاطها في التعرض 1 دقيقة. تم حقن الفئران مع 30 ملغ/كغ حل لوسيفرين د إينترابيريتونيلي 10 دقيقة قبل التصوير. وأبقى الفئران فظاعتها استخدام isoflurane 2% أثناء الإجراء. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 : غضب يؤدي إلى الحد من نمو الورم في الأورام أورثوتوبيك PC- (أ) بيولومينيسسيكنسي صور فئران التي تأوي أورثوتوبيك PC أظهر إشارة لوسيفراس انخفاض 7 أيام بعد غضب بالمقارنة مع شام جراحة اقتراح تخفيض عبء الورم العيش نتيجة لغضب. (ب) حجم متوسط قصت أورثوتوبيك الأورام (+ الخطأ القياسي) في الفئران التحكم مقابل الفئران التي خضعت لغضب. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذه الدراسة، وقد أثبتنا طراز ماوس الأشخاص لأجهزة الكمبيوتر التي يمكن استخدامها لدراسة آثار غضب على نمو الورم. وحاليا، يستخدم غضب كأسلوب الاجتثاث غير الحرارية فقط في الغاية المحددة محلياً متقدمة PC المرضى الذين ليس لديهم تطور المرض بعيدة بعد أشهر علاج قبل الجراحة. ولذلك اقتصر استعماله لأن معظم المرضى مع الكمبيوتر محلياً متقدمة وضع المرض المنتشر بعيدة20. سيعمل هذا النموذج كأساس لإجراء دراسات لتقييم آثار غضب على جهاز الكمبيوتر باستخدام معلمات علاج موسع وتركيبات مختلفة.
أهم شيء للنظر خلال البروتوكول هو حجم الورم الذي يتم تنفيذ غضب. المسابر المتاحة تجارياً لنماذج الفئران مقيدة بالقطب المسافة التي تفصل بينهما (5-10 مم). ومن ثم، يأخذ الاجتثاث غير مكتملة في أورام أكبر بكثير من المسافة القطب، المكان. للأورام مربعا، وهو يوصي باستخدام أقطاب صفيف 2-إبرة على الملاقط-تروديس كما الجلد المحيطة بالورم يزيد المقاومة لتدفق التيار في ملقط-تروديس. تقييد حجم الأقطاب صفيف 2-إبرة يمكن التغلب عليها عن طريق إجراء غضب في الأعماق وزوايا مختلفة في نفس الورم؛ غير أن هذا النهج يجعل من الصعب على علاج الأورام في شكل موحد. وبدلاً من ذلك، للأورام أكبر (تصل إلى 10 ملم)، يمكن إجراء شق في الجلد أسفل الورم لمدة أطول قليلاً من قطر الورم. يمكن ثم يتم تخريجها الورم عن طريق الشق بعكس الجلد السطحية باستخدام الملقط. ويمكن علاج الورم ثم مع ملقط-تروديس، مشابهة للأورام أورثوتوبيك الموصوفة أعلاه. يمكن ثم يتم إعادة إدراجها الورم اليكتروبوراتيد تحت الجلد، والجلد خياطة مع 4-0 خياطة غير امتصاص غرزة توقف. ومع ذلك، قد آثار الشق إرباك آثار غضب، ووجدنا أن أداء غضب عندما تكون الأورام داخل المسافة العمل من أقطاب إبرة اثنين الصفيف (~ 5-6 مم) يوفر توحيد أفضل.
بغض النظر عن النهج، يحتاج عدد النبضات يتحدد تجريبيا تبعاً لنوع الورم. وقد استخدمت الدراسات المنشورة بين 150-300 البقول في هذا الجهد17. ومع ذلك، حددنا العدد الأمثل من البقول في تجربة استجابة لجرعة أولى. وهناك نماذج للتنبؤ بمنطقة الاستئصال الكامل استناداً إلى المسافة والجهد الكهربائي، ولكن أنواع الورم يمكن أن تختلف اختلافاً كبيرا في الأوعية الدموية والتليف، والتي قد تؤثر على الاستجابة انهانسر21.
تم فصل كل مجموعة من 10 نبضات من 10 ق لتفادي آثار التدفئة التي تحدث إذا تم تسليم عدد كبير جداً من البقول بسرعة كبيرة جداً. يمكن أن يؤدي الإفراط في معالجة الاجتثاث الحرارية، التي قد تحول دون توصيف دقيق لآثار غضب غير الحرارية. الفاصل الزمني 10 s كما يسمح لنا مرارا تأكيد دقة تحديد المواقع القطب حيث يمكن أن يسبب تقلصات عضلة التشريد الكهربائي. لم يسمح لنا إياكوك بعد استخدام وكلاء مشلول في الحيوانات الصغيرة، التي يمكن أن تقلل إلى حد كبير تقلصات العضلات أثناء غضب. في حالة الأورام أورثوتوبيك، الملاقط-تروديس يسمح لنا بعقد الأورام شكل محكم ويكون لها مساحة سطح قطب أكبر مقارنة بمسرى إبرة.
على الرغم من أن غضب حاليا تستخدم كإجراء الجر في الإعداد السريرية، فقط انهانسر بشكل عام قد طائفة واسعة من التطبيقات بدءاً من التنشيط الأعصاب والعضلات لإنجاز مختلف العقاقير والنوكليوتيد. من خلال تحليل التغيرات الفيزيولوجية المرضية التي تحدث أثناء وبعد غضب استخدام هذا النموذج بعناية، فمن الممكن وضع استراتيجيات علاجية لا حصر لها للكمبيوتر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب قد لا الكشف عن البيانات المالية ذات الصلة.
Acknowledgments
ررو تلقت دعما لهذا العمل من "منحة بحثية تعاونية متعدية" تمولها "دواسة بدرس C3 سان دييغو" في قضية (#PTC2017).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ECM 830 square wave electroporator | Harvard Apparatus | BTX # 45-0002 ( 58018-004 ) | |
| 2 needle array electrode | Harvard Apparatus | 45-0167 | |
| Safety foot switch | Harvard Apparatus | 45-0211 | |
| Platinum Tweezer-trode | Harvard Apparatus | 45-0486 | |
| DMEM-F12 media | ThermoFisher Scientific | 11320-033 | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific | 10437028 | |
| Trypsin | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich, Inc. | 792632 | |
| Lacrilube | Fisher Scientific | 19090646 | |
| Buprenorphine | Fisher Scientific | NC1292810 | |
| D-luciferrin | Perkin Elmer | 122799 | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | 124262 | |
| Mouse strain C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 000664/Black 6 | |
| Cell line (KPC-Luc 4580) | J.J. Yeh Lab at University of North Carolina | ||
| BD Precisionglide syringe needles | Sigma-Aldrich, Inc. | Z192406 | |
| Alcohol Swab(70% isopropyl alcohol ) | BD | 326895 | |
| Digital calipers | ThermoFisher Scientific | 14-648-17 | |
| Disposable Scalpels, Sterile | VWR | 21909 | |
| Cotton Tipped Applicators | VWR | 89198 | |
| Suture Needle, 45 cm, Size 6-0 | Harvard Apparatus | 72-3308 | |
| Suture Needle, 45 cm, Size 4-0 | Harvard Apparatus | 72-3314 | |
| Povidone-iodine 10% | BD | 29900-404 | |
| Disposable Warming Pad | KENT SCIENTIFIC CORP. | TP-3E | |
| Mouse Hair Clipper | KENT SCIENTIFIC CORP. | CL8787 | |
| Surgical Drape | Harvard Apparatus | 59-7421 | |
| Phosphate-buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 10010023 |
References
- Rahib, L., et al. Projecting cancer incidence and deaths to 2030: the unexpected burden of thyroid, liver, and pancreas cancers in the United States. Cancer Res. 74 (11), 2913-2921 (2014).
- Howlader, N., et al. SEER Cancer Statistic Review, 1975-2013. , http://seer.cancer.gov/csr/1975_2013/ (1975).
- Clark, C. E., et al. Dynamics of the immune reaction to pancreatic cancer from inception to invasion. Cancer Res. 67 (19), 9518-9527 (2007).
- Lee, E. W., Loh, C. T., Kee, S. T. Imaging guided percutaneous irreversible electroporation: ultrasound and immunohistological correlation. Technol Cancer Res Treat. 6 (4), 287-294 (2007).
- Charpentier, K. P. Irreversible electroporation for the ablation of liver tumors: are we there yet? Arch Surg. 147 (11), 1053-1061 (2012).
- Narayanan, G. Irreversible Electroporation. Seminars in Interventional Radiology. 32 (4), 349-355 (2015).
- Martin, R. C. 2nd Treatment of 200 locally advanced (stage III) pancreatic adenocarcinoma patients with irreversible electroporation: safety and efficacy. Ann Surg. 262 (3), 486-494 (2015).
- Belfiore, M. P., et al. Percutaneous CT-guided irreversible electroporation followed by chemotherapy as a novel neoadjuvant protocol in locally advanced pancreatic cancer: Our preliminary experience. Int J Surg. 21 Suppl 1, S34-S39 (2015).
- Belfiore, G., et al. Concurrent chemotherapy alone versus irreversible electroporation followed by chemotherapy on survival in patients with locally advanced pancreatic cancer. Med Oncol. 34 (3), 38 (2017).
- Chu, K. F., Dupuy, D. E. Thermal ablation of tumours: biological mechanisms and advances in therapy. Nat Rev Cancer. 14 (3), 199-208 (2014).
- Wissniowski, T. T., et al. Activation of tumor-specific T lymphocytes by radio-frequency ablation of the VX2 hepatoma in rabbits. Cancer Res. 63 (19), 6496-6500 (2003).
- Eros de Bethlenfalva-Hora, C., et al. Radiofrequency ablation suppresses distant tumour growth in a novel rat model of multifocal hepatocellular carcinoma. Clin Sci (Lond). 126 (3), 243-252 (2014).
- Zerbini, A., et al. Radiofrequency thermal ablation for hepatocellular carcinoma stimulates autologous NK-cell response. Gastroenterology. 138 (5), 1931-1942 (2010).
- Ali, M. Y., et al. Activation of dendritic cells by local ablation of hepatocellular carcinoma. J Hepatol. 43 (5), 817-822 (2005).
- Fietta, A. M., et al. Systemic inflammatory response and downmodulation of peripheral CD25+Foxp3+ T-regulatory cells in patients undergoing radiofrequency thermal ablation for lung cancer. Hum Immunol. 70 (7), 477-486 (2009).
- Jiang, C., Davalos, R. V., Bischof, J. C. A review of basic to clinical studies of irreversible electroporation therapy. IEEE Trans Biomed Eng. 62 (1), 4-20 (2015).
- Neal, R. E. 2nd, et al. Improved local and systemic anti-tumor efficacy for irreversible electroporation in immunocompetent versus immunodeficient mice. PLoS One. 8 (5), e64559 (2013).
- Hingorani, S. R., et al. Trp53R172H and KrasG12D cooperate to promote chromosomal instability and widely metastatic pancreatic ductal adenocarcinoma in mice. Cancer Cell. 7 (5), 469-483 (2005).
- Safran, M., et al. Mouse reporter strain for noninvasive bioluminescent imaging of cells that have undergone Cre-mediated recombination. Mol Imaging. 2 (4), 297-302 (2003).
- Martin, R. C. 2nd, McFarland, K., Ellis, S., Velanovich, V. Irreversible electroporation in locally advanced pancreatic cancer: potential improved overall survival. Ann Surg Oncol. 20 Suppl 3, S443-S449 (2013).
- Neal, R. E., Garcia, P. A., Robertson, J. L., Davalos, R. V. Experimental Characterization and Numerical Modeling of Tissue Electrical Conductivity during Pulsed Electric Fields for Irreversible Electroporation Treatment Planning. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 59 (4), 1076-1085 (2012).
