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Cancer Research

एक Syngeneic अग्नाशय के कैंसर माउस मॉडल अपरिवर्तनीय Electroporation के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए

Published: June 8, 2018 doi: 10.3791/57265
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Moores Cancer Center, University California San Diego, 2Duke University School of Medicine

Summary

अपरिवर्तनीय electroporation (गुस्सा) एक गैर थर्मल पृथक स्थानीय रूप से उन्नत अग्नाशय के कैंसर के उपचार के लिए इस्तेमाल किया तकनीक है । एक अपेक्षाकृत नई तकनीक होने के नाते, ट्यूमर के विकास पर गुस्सा के प्रभाव खराब समझ रहे हैं । हम एक syngeneic माउस मॉडल है कि अग्नाशय के कैंसर पर गुस्सा के प्रभाव का अध्ययन करने की सुविधा विकसित की है ।

Abstract

अग्नाशय के कैंसर (पीसी), एक रोग है जो अमेरिका में लगभग ४०,००० रोगियों को हर साल मारता है, सफलतापूर्वक होनहार immunotherapeutic रणनीतियों सहित कई चिकित्सकीय दृष्टिकोण से बच निकला है । अपरिवर्तनीय electroporation (गुस्सा) एक गैर थर्मल पृथक तकनीक है कि आसन्न कोलेजन संरचनाओं के विनाश के बिना ट्यूमर कोशिका मौत लाती है, इस प्रकार प्रक्रिया को सक्षम करने के लिए ट्यूमर में प्रदर्शन किया जा रक्त वाहिकाओं के लिए बहुत करीब है । थर्मल पृथक तकनीक के विपरीत, गुस्सा क्रमिक अपोप्तोटिक कोशिका मौत में परिणाम, तत्काल पृथक प्रेरित परिगलन के साथ, और स्थानीय रूप से उंनत पीसी के साथ चयनित रोगियों के लिए नैदानिक उपयोग में वर्तमान में है । एक पंचमी विभक्ति, गैर-लक्ष्य क्रोध की तरह विशिष्ट प्रक्रिया ट्यूमर microenvironment में प्रतिक्रियाओं के असंख्य प्रेरित कर सकते हैं । कुछ अध्ययनों से अन्य ट्यूमर प्रकार में ट्यूमर के विकास पर गुस्सा के प्रभाव को संबोधित किया है, लेकिन कोई भी पीसी पर ध्यान केंद्रित किया है. हम पीसी के एक syngeneic माउस मॉडल विकसित किया है जिसमें चमड़े के नीचे (वर्ग) और orthotopic ट्यूमर सफलतापूर्वक एक उच्च नियंत्रित सेटिंग में गुस्सा के साथ इलाज किया जा सकता है, विभिंन अनुदैर्ध्य अध्ययन पोस्ट प्रक्रिया की सुविधा । यह पशु मॉडल एक मजबूत प्रणाली के रूप में कार्य करता है के लिए गुस्सा और तरीके के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए गुस्सा की नैदानिक प्रभावकारिता में सुधार ।

Introduction

अग्नाशय डक्टर ग्रंथिकर्कटता (पीसी) २०२०1के आसपास अमेरिका में कैंसर से होने वाली मौतों का दूसरा प्रमुख कारण बनने का अनुमान है । रोगियों के विशाल बहुमत पीसी के साथ का निदान अंततः दूर मेटास्टेटिक रोग से मर जाएगा2. पीसी microenvironment कुख्यात immunosuppressive और chemoresistant है । इसके desmoplastic स्ट्रोमा में प्रभाव की कमी होती है (एंटी-ट्यूमर) टी कोशिकाओं और immunosuppressive ल्यूकोसाइट्स की एक प्रमुखता शामिल है, जिसमें ट्यूमर से जुड़े मैक्रोफेज (TAMs), माइलॉयड व्युत्पन्न दमन कोशिकाओं (MDSCs), और विनियामक टी कोशिकाओं (Tregs)3 . इन आबाद को microenvironment के इन प्रभावों को प्रभावहीन करने वाली multimodal कार्यनीतियों को विकसित करने की आवश्यकता है.

गुस्सा ट्यूमर पृथक के एक गैर थर्मल विधि के रूप में विकसित किया गया है । थर्मल पृथक तकनीक के विपरीत, गुस्सा तेजी से coagulative परिगलन का कारण नहीं है, लेकिन इसके बजाय क्रमिक अपोप्तोटिक कोशिका मृत्यु4में परिणाम है । अग्नाशय के ट्यूमर के लिए महत्वपूर्ण बात, गुस्सा "हीट सिंक" प्रभाव को कमजोर नहीं है और सही रक्त वाहिकाओं के बगल में किया जा सकता है5. इस प्रौद्योगिकी के एफडीए6 से 510 (कश्मीर) मंजूरी है और वर्तमान में नैदानिक रूप से इस्तेमाल किया जा रहा है, स्थानीय रूप से उन्नत या प्रतिच्छेदन अग्नाशय के कैंसर की सीमा रेखा के साथ चयनित रोगियों के लिए. 7पीसी के लिए गुस्सा का सबसे बड़ा प्रकाशित श्रृंखला में, गुस्सा के दौर से गुजर रोगियों के औसत जीवित रहने लगभग8,9के बिना अकेले आधुनिक कीमोथेरेपी के साथ इलाज रोगियों के अस्तित्व को दोगुना था ।

कई अध्ययनों से प्रदर्शन किया है कि थर्मल पृथक अंय ट्यूमर प्रकार में एक प्रणालीगत प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया लाती है (चू एट अल में समीक्षा की । 10). रेडियोफ्रीक्वेंसी पृथक (RFA) पशु ट्यूमर मॉडल में वृद्धि हुई टी सेल की ओर जाता है11,12, hepatocellular कैंसर रोगियों में सक्रिय प्राकृतिक हत्यारा (NK) कोशिकाओं में वृद्धि सहित13, 14, और फेफड़ों के कैंसर के रोगियों में immunosuppressive Tregs में कमी15। अध्ययन की एक बहुत छोटी संख्या प्रतिरक्षा, microenvironmental की जांच की है, और16गुस्सा को चोट की प्रतिक्रियाएं । गुस्सा असुरक्षित माउस मॉडल जिसमें माध्यमिक (contralateral) गुर्दे सेल allografts के विकास में कम या एक प्राथमिक ट्यूमर के गुस्से से दो सप्ताह पहले17से रोका गया था में एक प्रणालीगत प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को उत्तेजित करने के लिए दिखाया गया है । उंहोंने यह भी कहा कि असुरक्षित चूहों प्रतिरक्षा चूहों की तुलना में पूरा प्रतिगमन के लिए कम वोल्टेज की आवश्यकता है । यह कल्पना की गई है कि गुस्सा बेहतर प्रतिजन प्रस्तुति थर्मल पृथक के coagulative परिगलन की तुलना में परिणाम हो सकता है, लेकिन यह विशेष रूप से अध्ययन नहीं किया गया है ।

हम KPC-ल्यूक ४५८० सेल लाइन से पीसी के एक syngeneic माउस मॉडल विकसित किया है (उत्तरी कैरोलिना विश्वविद्यालय में जे जे ये से उपहार), जो एक ट्यूमर है कि एक पुरुष LSL में विकसित से व्युत्पंन किया गया था-KrasG12D/ LSL-Trp53R172H/+; PDX1Cre/+; LSL-ROSA26 ल्यूक/+ माउस, गुस्सा18,19के स्थानीय और प्रणालीगत प्रभाव का अध्ययन करने के लिए । यह luciferase-एक्सप्रेस सेल लाइन immunogenic है और यह भी असुरक्षित C57BL में tumorigenic/6 चूहों जब वर्ग या orthotopically इंजेक्शन और मज़बूती से जिगर मेटास्टेसिस जब तिल्ली में इंजेक्शन का उत्पादन । हम एक प्रोग्राम वर्ग तरंग पल्स जनरेटर का उपयोग किया है १००-बिजली की µs दालों को एक वोल्टेज/१,५०० V/एक दो सुई सरणी जांच का उपयोग कर (5 मिमी से अलग) या प्लेटिनम नोचना-trodes वर्ग या orthotopic ट्यूमर के लिए, क्रमशः में, चूहों एक छोटे जानवर में गुस्सा के प्रभाव मॉडल के लिए ।

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Protocol

सभी पशु प्रयोगों इस प्रोटोकॉल का पालन किया संबंधित संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया जाना चाहिए । यहां बताई गई सभी प्रक्रियाओं को IACUC UCSD ने मंजूरी दे दी है ।

1. प्राप्तकर्ता पशुओं की खरीद

नोट: KPC-ल्यूक ४५८० सेल लाइन एक LSL में उत्पंन ट्यूमर से स्थापित किया गया था-KrasG12D/ LSL-Trp53R172H/+; PDX1Cre/+; LSL-ROSA26 ल्यूक/+ माउस (KPC), जो एक C57BL/6 पृष्ठभूमि पर पीसी का एक आनुवंशिक रूप से इंजीनियर मॉडल है । इस सेल लाइन का लाभ यह है कि यह constitutively luciferase-orthotopic मॉडल में ट्यूमर की निगरानी को सक्षम व्यक्त करता है । हालांकि, अंय कक्ष रेखाओं का उपयोग तब तक भी किया जा सकता है जब तक कि वे प्राप्तकर्ता चूहों की आनुवंशिक पृष्ठभूमि से सुसंगत हों ।

  1. प्रायोगिक समूहों और पहले से प्रति समूह पशुओं की संख्या निर्धारित करें ।
  2. उम्र चुनें (6-10 सप्ताह पुराने चूहों की सिफारिश की) और परिकल्पना और सेल लाइन के अनुसार इस्तेमाल किया जा रहा जानवरों के सेक्स ।

2. संस्कृति कोशिकाओं

  1. Dulbecco के संशोधित ईगल मीडियम (DMEM) का उपयोग करें: पोषक मिश्रण F12 (50:50) मीडिया 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 1% पेनिसिलिन-streptomycin एंटीबायोटिक (पूरा विकास मीडिया) KPC-ल्यूक ४५८० कोशिकाओं को विकसित करने के लिए युक्त.
  2. यदि जमे हुए, गल कोशिकाओं 4 दिन पहले ट्यूमर आरोपण के लिए ।
  3. अपूतित शर्तों के तहत 5% CO2 और ९५% आर्द्रता के साथ ३७ ° c पर कोशिकाओं को बढ़ाएँ ।
  4. Trypsinize ३७ डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ०.२५% Trypsin के साथ कोशिकाओं से पहले वे पहुंच > 80% प्रवाह और पूर्ण विकास मीडिया की मात्रा में दो बार जोड़कर Trypsin बेअसर ।
    नोट: इन कोशिकाओं को चूहों में कुशलतापूर्वक ट्यूमर स्थापित नहीं अगर वे १००% पर उपयोग किया जाता है प्रवाह या यदि वे अधिक से अधिक 12 बार के लिए पारित कर रहे हैं । इसलिए, यह इष्टतम प्रवाह के तहत पहले के मार्ग पर कोशिकाओं को फ्रीज करने के लिए सलाह दी जाती है ।
  5. एक hemocytometer का उपयोग कर कोशिकाओं गिनती और ट्यूमर प्रेरण करने के लिए आगे बढ़ना अगर पर्याप्त संख्या मौजूद हैं (०.५-1 एक्स 106 कोशिकाओं/ यदि नहीं, तो पर्याप्त कक्ष संख्या प्राप्त होने तक एक और बीतने के लिए कक्षों का विस्तार करें ।

3. वर्ग ट्यूमर की प्रेरण

  1. आवश्यक सामग्री तैयार: P1000 और P100 पिपेट और टिप्स, 1 मिलीलीटर सिरिंज, 25G सुई, तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स (बीएमएम), DMEM बेसल मीडिया, १.५-एमएल केंद्रापसारक ट्यूबों । प्रक्रिया के अंत तक सभी सामग्री बाँझ और ठंड (4 डिग्री सेल्सियस) रखें. इसके अलावा बाल कतरनी और अल्कोहल झाड़ू पशु उपयोग के लिए तैयार रखें ।
  2. Trypsinize (२.४ कदम के अनुसार) और कोशिकाओं की गिनती, और उंहें 2-4 x 107 कोशिकाओं की एकाग्रता पर reसस्पैंड/
  3. ५०% बीएमएम में अंतिम सेल सस्पेंशन बनाने के लिए १००% बीएमएम के बराबर वॉल्यूम जोड़ें । अंतिम मात्रा प्रत्येक माउस की आवश्यकता के लिए सेल निलंबन के ५० µ l के लिए राशि चाहिए । सिरिंज में मृत अंतरिक्ष और किसी भी pipetting त्रुटियों के लिए समायोजित करने के लिए अतिरिक्त में 10% तैयार करें ।
  4. Aliquot में ५५० µ एल वॉल्यूम में १.५ मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूबों बर्फ में रखा ।
  5. जानवरों को नियंत्रित (6 सप्ताह पुराने पुरुष C57BL/6 चूहों) एक निरोधक या स्वयं का उपयोग कर ।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, चूहों के साथ anaesthetized जा सकता है २.५% isoflurane ऑक्सीजन गैस में 2 L/मिनट की एक प्रवाह दर पर एक सटीक vaporizer का उपयोग कर ।
  6. इंजेक्शन की साइट दाढ़ी, जो अधिमानतः एक पैर के ऊपर एक पार्श्व पर है, एक क्लिपर का उपयोग कर । एक शराब झाड़ू का उपयोग कर, इंजेक्शन की साइट को दो बार साफ ।
  7. ड्रा २५० µ एल सेल निलंबन की एक अंतिम एकाग्रता में 1-2 x 107 कोशिकाओं/एमएल एक 1 मिलीलीटर ठंडा सिरिंज में और पिस्टन ऊपर और नीचे ले जाकर किसी भी हवा के बुलबुले को हटा दें । सिरिंज के लिए एक 25G सुई संलग्न और सुई के भीतर अंतरिक्ष को भरने के लिए सुनिश्चित करें.
  8. ध्यान से एक 30 ° कोण पर त्वचा के नीचे सुई डालने के लिए पार्श्वों के पास शरीर को, यकीन है कि सुई पेरिटोनियल गुहा या अंगों के पेशियां पियर्स नहीं करता है बना ।
  9. शरीर के समानांतर सुई समतल, और त्वचा पर झुर्रियों को समतल । धीरे सेल निलंबन के ५० µ एल इंजेक्षन । 10 एस के लिए इंजेक्शन की साइट पर सुई पकड़ो बीएमएम को किसी भी रिसाव को रोकने के जमना के लिए अनुमति देते हैं ।
  10. धीरे से किसी भी बग़ल में आंदोलन के बिना यह समानांतर रखने सुई वापस ले लो । धीरे से एक शराब झाड़ू के साथ इंजेक्शन की साइट को साफ और अपने आवास के लिए माउस को रिहा ।
    नोट: यदि माउस प्रक्रिया के दौरान anesthetized था, पशु की निगरानी जब तक यह अपनी लेकन सजगता फिर से प्राप्त ।
  11. ट्यूमर के विकास की निगरानी नियमित रूप से कैलिपर्स का उपयोग कर जब तक यह व्यास में 5 मिमी तक पहुंचता है ।

4. Orthotopic ट्यूमर की प्रेरण

  1. आवश्यक सामग्री तैयार करते हैं । आटोक्लेव जैसे कैंची, नश्तर, सुई ड्राइवरों, और नुकीले और फ्लैट इत्तला दे दी संदंश के सर्जिकल उपकरण । काम बाँझ टांके रखें (अवशोषित 6-0 और गैर अवशोषित 4-0), शराब झाड़ू, बाल कतरनी, लोमनाशक क्रीम, नेत्र स्नेहक, कपास धुंध, 10% povidone आयोडीन समाधान, सर्जिकल पर्दे, हीटिंग पैड, buprenorphine, और संवेदनाहारी एजेंटों ।
  2. Euthanize एक दाता माउस (एक ही orthotopic मॉडल के लिए आवश्यक पृष्ठभूमि के अधिमानतः) एक वर्ग KPC एक धीमी भरें सह2 चैंबर का उपयोग कर ट्यूमर ले । आबकारी वर्ग ट्यूमर ध्यान से एक बीएसएल में बाँझ शर्तों के तहत-2 बाँझ संदंश और शीघ्र ही orthotopic आरोपण से पहले microscissors का उपयोग हुड. ट्यूमर के दौरान उत्पाद का ध्यान रखना पेरिटोनियल गुहा पंचर और तुरंत बाँझ पंजाबियों के 2 बाजारों के साथ ट्यूमर धोने के लिए नहीं ।
  3. बाँझ नश्तर का प्रयोग, 1 मिमी3 टुकड़ों में उत्पाद का ट्यूमर कीमा, उंहें एक पेट्री ठंड बाँझ DMEM बेसल मीडिया युक्त पकवान पर जगह है, और बर्फ पर दुकान तक आरोपण ।
  4. प्रशासन प्राप्तकर्ता माउस ०.०५-1 मिलीग्राम/buprenorphine एनाल्जेसिक वर्ग, सर्जरी से पहले 30 मिनट ।
  5. प्राप्तकर्ता चूहों Anesthetize में 2-3% isoflurane के साथ ऑक्सीजन (2 L/min) एक प्रेसिजन vaporizer (या अन्य संवेदनाहारी एजेंट्स) का उपयोग कर । चूहों एक ३७ डिग्री सेल्सियस हीटिंग पैड पर प्रक्रिया की संपूर्णता के लिए रखें । आंखों को सुखाना रोकने के लिए स्नेहक लागू करें । शुरू में चौंकाने पलटा की कमी से संज्ञाहरण की गहराई का परीक्षण, और एक कोमल पैर की अंगुली चुटकी करने के लिए पेडल पलटा की कमी से शल्य विमान संज्ञाहरण की पुष्टि । पूरी शल्य प्रक्रिया के दौरान संज्ञाहरण बनाए रखें ।
  6. माउस को अपनी पीठ पर लगाएं और धीरे से इसे अपनी दाईं ओर मोड़ दें जिससे पेट की बायीं ओर का संपर्क खुल जाए । लोमनाशक क्रीम का उपयोग कर माउस के उदर बाल निकालें और यह सुनिश्चित करने के लिए कोई मुक्त बाल पेट पोस्ट चीरा में प्रवेश करती है धुंध के साथ साफ । 10% povidone आयोडीन के 3 चक्र का उपयोग कर सर्जरी के लिए छोड़ दिया पेट तैयार त्वचा को संक्रमित करने के लिए शराब पोंछे के बाद ।
  7. एक बाँझ स्केलपेल का उपयोग करना, एक १.५ सेमी अनुप्रस्थ या त्वचा में टेढ़ा चीरा, 1-midline के बाईं ओर सेमी, ribcage के नीचे, तिल्ली के लिए थोड़ा औसत दर्जे. फिर, उदर पेशियां के माध्यम से चीरा का विस्तार, झूठ सतही चीरा दर्पण ।
  8. फ्लैट इत्तला दे दी संदंश का उपयोग कर तिल्ली का पता लगाने और धीरे से यह उदर गुहा से externalize. एक बाँझ कपास applicator का उपयोग कर तिल्ली वापस लेना, और तिल्ली के नीचे से जुड़ी अग्न्याशय की पूंछ पाते हैं ।
  9. सपाट इत्तला दे दी संदंश का उपयोग करना, अग्ंयाशय की पूंछ बाद में वापस लेना ।
  10. एक ठीक (6-0) बाँझ suturing सुई की नोक के साथ दाता माउस से एक पतले कीमा बनाया हुआ ट्यूमर टुकड़ा उठाओ और यह बाँझ संदंश का उपयोग कर स्थिति ।
  11. जबकि धीरे से वापस लेने के पूंछ/अग्न्याशय के शरीर बाद में, अग्ंयाशय की पूंछ में ट्यूमर टुकड़ा युक्त सीवन की सुई डालें । धीरे ऊतक के माध्यम से सीवन से गुजारें, अग्नाशय पूंछ के साथ संपर्क में ट्यूमर पकड़े । ऊतक के संबंध में टुकड़ा के अभिविन्यास के आधार पर एक या दो अतिरिक्त टांके लागू.
  12. ऊतक से पूरी तरह से सुई को हटा दें और एक अतिरिक्त ६० एस के लिए बाहर अग्ंयाशय/तिल्ली का नकसीर या रिसाव के किसी भी लक्षण के लिए निरीक्षण करते समय रखें । फिर, internalize उंहें धीरे से उदर गुहा में कुंद संदंश का उपयोग कर ।
  13. बंद उदर पेशियां या तो एक सतत या बाधित सिलाई के साथ एक 6-0 अवशोषित सीवन का उपयोग कर, और बंद एक 3-0 6-0 गैर अवशोषित बाधित टांका का उपयोग कर त्वचा । इस बिंदु पर संज्ञाहरण बंद करो ।
  14. भोजन और पानी के लिए स्वतंत्र पहुँच के साथ अपने घर पिंजरे में ठीक करने के लिए माउस की अनुमति दें । एक हीटिंग पैड पर पिंजरे प्लेस वसूली की सुविधा । ऐसे श्वास, छिड़काव आदि, वसूली प्रक्रिया के दौरान के रूप में महत्वपूर्ण संकेत की निगरानी ।
  15. लेकन पलटा एक बार माउस को ठीक करने के संकेत की पुष्टि करें, और फिर पिंजरे वापस करने के लिए नियमित रूप से आवास कर सकते हैं ।
  16. प्रशासन buprenorphine ०.०५-०.१ मिलीग्राम/kg 8-12 h सर्जरी के बाद, और हर 8-12 एच के रूप में दर्द के संकेत के लिए आवश्यक प्रक्रिया के बाद ।
  17. में एक का उपयोग कर ट्यूमर विकास की निगरानी vivo bioluminescence इमेजिंग प्रणाली ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
    1. इमेजिंग द्वारा 4 दिन पर शुरू orthotopic आरोपण के बाद ट्यूमर के विकास का पालन करें, और इमेजिंग सप्ताह में दो बार प्रदर्शन करते हैं ।
    2. इमेजिंग के दिन, प्रशासन (intraperitoneal इंजेक्शन) 30 मिलीग्राम/kg D-luciferin करने के लिए एक anesthetized (2-3% isoflurane ऑक्सीजन (2 L/min)) प्राप्तकर्ता माउस 10 मिनट इमेजिंग करने से पहले ।
    3. luciferase गतिविधि के लिए छवि ऑटो प्रतिदीप्ति मुक्त गर्म मंच के साथ एक luminescence imager में 5 एस जोखिम की एक ंयूनतम के लिए किसी भी उत्सर्जन फिल्टर के बिना luminescence सेटिंग का उपयोग कर और जबकि अभी भी चूहों के लिए संज्ञाहरण को बनाए रखने ।

5. वर्ग ट्यूमर का गुस्सा

  1. आवश्यक सामग्री तैयार करें: स्क्वायर वेव electroporator, सुरक्षा पैर स्विच, इलेक्ट्रोड (सुई सरणी बनाम नोचना-trode), और एडेप्टर । बाँझ टांके (गैर अवशोषित 4-0), शराब झाड़ू, बाल कतरनी, लोमनाशक क्रीम, नेत्र स्नेहक, कपास धुंध, buprenorphine, और निश्चेतक भी पास रखें ।
  2. गैस नसबंदी का उपयोग कर नोचना या सुई सरणी इलेक्ट्रोड निष्फल. Autoclaving अनुशंसित नहीं है । जानवरों के बीच इलेक्ट्रोड को निष्फल करने के लिए एक गिलास मनका नसबंदी का उपयोग करें.
  3. प्रशासन buprenorphine ०.०५-०.१ मिलीग्राम/ट्यूमर असर चूहों को 30 मिनट प्रक्रिया से पहले ।
  4. चरणों का पालन ४.४-४.५ सफलतापूर्वक चूहों में संज्ञाहरण पैदा करने के लिए एक बार वर्ग ट्यूमर प्रत्यारोपण 5 मिमी व्यास तक पहुंचता है ।
  5. पार्श्व पर वर्ग ट्यूमर का उपयोग करने के लिए अपनी तरफ anesthetized माउस प्लेस । कतरनों और साफ त्वचा का उपयोग कर एक शराब झाड़ू का उपयोग कर बालों को हटा दें ।
  6. वर्ग ट्यूमर के लिए, 2-सुई सरणी इलेक्ट्रोड का उपयोग करें. संदंश का उपयोग कर ट्यूमर साइट के तहत सीधे त्वचा तरक्की और यकीन है कि वे पेरिटोनियल गुहा घुसना नहीं कर शरीर के लिए समानांतर त्वचा के माध्यम से इलेक्ट्रोड डालें । एक बार त्वचा के माध्यम से, इस तरह से इलेक्ट्रोड की स्थिति है कि वे ट्यूमर ब्रैकेट.
  7. electroporator कार्यक्रम के लिए १०० µs दालों की एक आवृत्ति पर उद्धार करने के लिए 1 हर्ट्ज १,५०० पर १५० दालों की कुल के लिए V/ पैर पेडल का उपयोग कर दालों उद्धार । 10 एस द्वारा 10 दालों के प्रत्येक सेट को अलग, गर्मी अपव्यय के लिए अनुमति देने के लिए और इलेक्ट्रोड की सही स्थिति की पुष्टि करने के लिए.
    नोट: लकवाग्रस्त एजेंटों के उपयोग के बिना, चूहों गुस्सा है कि इलेक्ट्रोड के विस्थापन के कारण जब तक मैन्युअल रूप से सुरक्षित कर सकते हैं के साथ मांसपेशियों में संकुचन का अनुभव होगा.
  8. पूर्ण खुराक के बाद इलेक्ट्रोड निकालें, जो २०० एस रिकॉर्ड वास्तविक वोल्टेज दिया है, जो electroporator पर प्रदर्शित किया जाता है से अधिक नहीं होना चाहिए. चूहों के लिए कदम ४.१४-४.१६ के अनुसार गुस्सा के बाद ठीक करने की अनुमति दें ।

6. Orthotopic ट्यूमर का गुस्सा

नोट: orthotopic ट्यूमर का गुस्सा एक ही माउस इस प्रकार शुरुआत से पहले स्थानीय IACUC से विशेष अनुमोदन की आवश्यकता पर एक दूसरे अस्तित्व सर्जरी शामिल है ।

  1. आवश्यक सामग्री तैयार करें: आटोक्लेव जैसे कैंची, नश्तर, सुई ड्राइवरों, नुकीले संदंश, और फ्लैट इत्तला दे दी संदंश सर्जिकल उपकरण । निंनलिखित के रूप में अच्छी तरह से पास रखें: बाँझ टांके (अवशोषित 6-0 और गैर अवशोषित 4-0), शराब झाड़ू, बाल कतरनी, लोमनाशक क्रीम, नेत्र स्नेहक, कपास धुंध, 10% povidone आयोडीन समाधान, सर्जिकल पर्दे, हीटिंग पैड, स्क्वायर वेव electroporator, सुरक्षा पैर स्विच, इलेक्ट्रोड और उनके एडेप्टर, buprenorphine, और निश्चेतक.
  2. vivo इमेजिंग में द्वारा orthotopic ट्यूमर वृद्धि के लिए चूहों का आकलन (४.१७ कदम देखें) इंजेक्शन द्वारा डी-Luciferin intraperitoneally के 30 मिलीग्राम/
    नोट: orthotopic ट्यूमर गुस्सा उपचार के लिए आदर्श है 8 से 10 दिनों के बाद आरोपण जब ट्यूमर स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे है और अभी भी अग्ंयाशय तक ही सीमित के रूप में Luciferase luminescence छवियों पर देखा जा सकता है ( प्रतिनिधि परिणामदेखें) ।
  3. प्रत्यारोपित ट्यूमर का पता लगाने के लिए कदम ४.४-४.९, का पालन करें । ट्यूमर को खोजने के लिए आसान नहीं है, तो पेट और तिल्ली धीरे ट्यूमर की पहचान करने के लिए ले जाने के लिए कुंद नाक संदंश का उपयोग करें ।
  4. कुंद नाक संदंश के साथ ट्यूमर Externalize और नोचना-trode के प्लेटिनम इलेक्ट्रोड के साथ कसकर ट्यूमर पर कब्जा । पैर स्विच द्वारा नियंत्रित 10 दालों के सेट में वर्ग तरंग electroporator का उपयोग ५.७ चरण में क्रमादेशित के रूप में electroporation दालों उद्धार.
  5. रक्तस्राव के किसी भी लक्षण के लिए निगरानी करने के लिए कम से ६० एस पद गुस्सा के लिए बाह्य ट्यूमर रखें । ट्यूमर वापस उदर गुहा में डालें और पहले वर्णित के रूप में चीरा बंद करें (चरण ४.१३-४.१६) और यह ठीक हो जाता है जब तक माउस की निगरानी.
  6. कदम ४.१७ के अनुसार vivo luciferase इमेजिंग में उपयोग ट्यूमर के विकास पर गुस्सा के प्रभाव की निगरानी ।

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Representative Results

हम ऊपर वर्णित प्रक्रिया के बाद और 5-6 सप्ताह पुराने जंगली प्रकार C57BL/6 चूहों ५०% बीएमएम के साथ 1 एक्स 106 कोशिकाओं के साथ inoculated पर वर्ग ट्यूमर उत्पन्न । जब ट्यूमर आकार व्यास में 5-6 मिमी तक पहुंच गया, चूहों के कुछ euthanized थे, उनके ट्यूमर थे, और एक प्राप्तकर्ता C57BL/6 चूहों में प्रत्यारोपित orthotopically । गुस्सा 10 दिनों के बाद आरोपण प्रदर्शन किया गया के रूप में 1 चित्रापर समयरेखा में दिखाया गया है । गुस्सा शेष वर्ग ट्यूमर असर चूहों पर प्रदर्शन किया गया ।

वर्ग ट्यूमर में, गुस्सा वोल्टेज और नाड़ी अवधि १,५०० V/सेमी और १०० µs, क्रमशः पर लगातार रखा गया है, लेकिन विभिंन दालों की संख्या । चित्रा 2 से पता चलता है कि कुछ चूहों में वर्ग ट्यूमर regressed पूरी तरह से गुस्सा की १५० दालों के बाद नहीं बल्कि ७५ दालों के साथ के रूप में अच्छी तरह से । कुल में, 9 चूहों में से 4 गुस्सा की १५० दालों के बाद पूरा ट्यूमर प्रतिगमन दिखाया. ट्यूमर ऊतक के ऊतकवैज्ञानिक विश्लेषण 1 सप्ताह के बाद गुस्सा केंद्रीय ट्यूमर परिगलन कि नियंत्रण अनुपचारित ट्यूमर में नहीं देखा गया के बड़े क्षेत्रों में दिखाया गया है । यह गल कोर अधूरा ट्यूमर प्रतिगमन (चित्रा 3) के मामलों में जीवित ट्यूमर ऊतक द्वारा पार्श्व था । orthotopic ट्यूमर के सफल आरोपण भी प्राप्त किया गया था, और विकास दर में vivo bioluminescence इमेजिंग का उपयोग कर निगरानी की गई थी दिन में ट्यूमर दिखा 10 और 15 दिन (चित्रा 4) आरोपण के बाद. १५० दालों पर गुस्सा भी orthotopic ट्यूमर में प्रभावी साबित (चित्रा 5) कम ट्यूमर मात्रा दिखा । कुल मिलाकर, इन परिणामों के इस मॉडल की क्षमता प्रदर्शित करने के लिए एक असुरक्षित माउस मॉडल में गुस्सा के प्रभाव अनुकरण, जिससे एक मंच के लिए विभिंन क्रोध शर्तों और संयोजन पीसी का इलाज परीक्षण प्रदान करते हैं ।

Figure 1
चित्रा 1 : योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व दिखाता है ट्यूमर आरोपण और गुस्सा का समय पाठ्यक्रम । वर्ग ट्यूमर के लिए, गुस्सा जैसे ही ट्यूमर व्यास में 5-6 मिमी तक पहुंच प्रदर्शन किया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : Luciferase-bioluminescence इमेजिंग ट्यूमर विकास के बाद वर्ग मॉडल में गुस्सा में कमी से पता चलता है । KPC-ल्यूक सेल लाइन constitutively यह संभव वास्तविक समय में गुस्सा के जवाब में ट्यूमर के विकास की निगरानी करने के लिए बनाने luciferase व्यक्त करता है । 14 दिवस bioluminescence इमेजिंग पोस्ट गुस्सा चूहों में से एक में क्रोध के १५० दालों के साथ इलाज के पूर्ण प्रतिगमन से पता चलता है, जबकि अपूर्ण प्रतिगमन गुस्सा के ७५ दालों के साथ देखा गया था जब अनुपचारित नियंत्रण की तुलना में । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : Hematoxylin और eosin ट्यूमर ऊतक के धुंधला ऊतक वास्तुकला पोस्ट गुस्सा में परिवर्तन से पता चलता है । वर्ग गुस्सा को उजागर ट्यूमर मध्य में परिगलन के बड़े क्षेत्रों से पता चला, जीवित ऊतक के क्षेत्रों से घिरा हुआ कुछ मामलों में अपर्याप्त गुस्सा कवरेज का संकेत है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : Bioluminescence इमेजिंग orthotopic ट्यूमर के सफल आरोपण और समय के साथ इसके विकास को दर्शाता है । छवियां एक वाणिज्यिक bioluminescence इमेजिंग उपकरण का उपयोग कर luminescence के साथ लिया गया था 1 मिनट जोखिम पर कब्जा । चूहों के साथ इंजेक्शन थे 30 मिलीग्राम/डी के luciferin समाधान intraperitoneally इमेजिंग से पहले 10 मिनट. चूहों प्रक्रिया के दौरान 2% isoflurane का उपयोग कर anaesthetized रखा गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5 : गुस्सा orthotopic पीसी ट्यूमर में ट्यूमर के विकास में कमी लाती है । (क) orthotopic पीसी बंदरगाह चूहों की Bioluminescecnce छवियों कम luciferase संकेत दिखाया 7 दिनों के बाद शर्म की बात की तुलना में गुस्सा का एक परिणाम के रूप में कम रहते ट्यूमर बोझ सुझाव सर्जरी के लिए । (ख) उत्पाद orthotopic ट्यूमर की मात्रा का मतलब (+ मानक त्रुटि) नियंत्रण चूहों में चूहों बनाम कि गुस्सा गुजरा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

इस अध्ययन में, हम पीसी के लिए एक असुरक्षित माउस मॉडल है कि ट्यूमर के विकास पर गुस्सा के प्रभाव का अध्ययन किया जा सकता है का प्रदर्शन किया है । वर्तमान में, गुस्सा एक गैर थर्मल पृथक तकनीक के रूप में ही उच्च चयनित स्थानीय रूप से उंनत पीसी रोगियों जो ऑपरेटिव थेरेपी के महीनों के बाद दूर रोग प्रगति नहीं है में इस्तेमाल किया जा रहा है । इसके उपयोग इसलिए सीमित किया गया है क्योंकि स्थानीय रूप से उंनत पीसी के साथ सबसे अधिक रोगियों दूर मेटास्टेटिक रोग20का विकास । इस मॉडल के अध्ययन के लिए एक आधार के रूप में सेवा करेंगे विभिंन विस्तारित उपचार मानकों और संयोजन का उपयोग कर पीसी पर गुस्सा के प्रभाव का मूल्यांकन ।

सबसे महत्वपूर्ण बात करने के लिए प्रोटोकॉल के दौरान विचार ट्यूमर जिस पर गुस्सा किया जाता है के आकार है । चूहों मॉडलों के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध जांच उनके इलेक्ट्रोड दूरी (5-10 mm) द्वारा सीमित हैं । इसलिए, ट्यूमर में काफी इलेक्ट्रोड दूरी से बड़ा, अधूरा पृथक जगह लेता है. वर्ग ट्यूमर के लिए, नोचना-trodes पर 2-सुई सरणी इलेक्ट्रोड का उपयोग नोचना-trodes में वर्तमान के प्रवाह के लिए ट्यूमर बढ़ प्रतिरोध के आसपास की त्वचा के रूप में सिफारिश की है. 2-सुई सरणी इलेक्ट्रोड का आकार सीमा एक ही ट्यूमर में विभिन्न गहराई और कोणों पर गुस्सा प्रदर्शन से दूर किया जा सकता; हालांकि, इस दृष्टिकोण यह मुश्किल ट्यूमर का इलाज करने के लिए समान रूप से बनाता है । वैकल्पिक रूप से, बड़ा ट्यूमर के लिए (अप करने के लिए 10 मिमी), एक चीरा ट्यूमर व्यास की तुलना में थोड़ी देर तक एक लंबाई के लिए ट्यूमर के नीचे त्वचा पर बनाया जा सकता है । ट्यूमर तो संदंश का उपयोग कर अधिक त्वचा औंधा द्वारा चीरा के माध्यम से बाह्य हो सकता है । ट्यूमर तो नोचना-trodes, ऊपर वर्णित orthotopic ट्यूमर के समान के साथ इलाज किया जा सकता है । electroporated ट्यूमर तो त्वचा के नीचे फिर से संमिलित किया जा सकता है, और त्वचा एक बाधित सिलाई के रूप में एक 4-0 गैर अवशोषित टांका के साथ टांका । हालांकि, चीरा के प्रभाव गुस्सा के प्रभाव को मिल सकता है, और हम जब ट्यूमर दो सुई सरणी इलेक्ट्रोड (~ 5-6 मिमी) के काम की दूरी के भीतर कर रहे हैं सबसे अच्छा मानकीकरण प्रदान करता है कि गुस्सा प्रदर्शन पाया है.

दृष्टिकोण की परवाह किए बिना, दालों की संख्या ट्यूमर प्रकार के आधार पर empirically निर्धारित किया जाना चाहिए. प्रकाशित अध्ययन इस वोल्टेज17पर १५०-३०० दालों के बीच का उपयोग किया है । हालांकि, हम एक प्रारंभिक खुराक में दालों की इष्टतम संख्या-प्रतिक्रिया प्रयोग निर्धारित किया है । वहाँ मॉडल वोल्टेज और इलेक्ट्रोड दूरी के आधार पर पूरा पृथक के क्षेत्र की भविष्यवाणी करने के लिए कर रहे हैं, लेकिन ट्यूमर प्रकार बहुत नाड़ी और फाइब्रोसिस में भिन्न हो सकते हैं, जो21electroporation के लिए प्रतिक्रिया को प्रभावित कर सकते हैं.

10 दालों के प्रत्येक सेट में 10 से अलग किया गया था क्रम में हीटिंग प्रभाव है कि अगर बहुत अधिक दालें भी जल्दी से दिया जाता है से बचने के लिए । अधिक उपचार थर्मल पृथक में परिणाम कर सकते हैं, जो गैर थर्मल गुस्सा के प्रभाव का सही लक्षण वर्णन को रोकने सकता है । 10 s अंतराल भी हमें अक्सर की पुष्टि करने के लिए इलेक्ट्रोड सही स्थिति के बाद से मांसपेशियों के संकुचन इलेक्ट्रोड विस्थापन पैदा कर सकते हैं की अनुमति देता है. हमारे IACUC अभी तक छोटे जानवरों में लकवाग्रस्त एजेंटों के उपयोग की अनुमति नहीं है, जो बहुत गुस्सा के दौरान मांसपेशियों के संकुचन को कम कर सकते हैं । orthotopic ट्यूमर के मामले में, नोचना-trodes हमें कसकर ट्यूमर पकड़ और सुई इलेक्ट्रोड की तुलना में एक बड़ा इलेक्ट्रोड सतह क्षेत्र के लिए अनुमति देता है.

हालांकि गुस्सा वर्तमान में केवल नैदानिक सेटिंग में एक पंचमी विभक्ति प्रक्रिया के रूप में प्रयोग किया जाता है, सामान्य में electroporation विभिन्न दवाओं और oligonucleotides के वितरण के लिए तंत्रिका और मांसपेशी सक्रियण से लेकर आवेदनों की एक व्यापक स्पेक्ट्रम है. ध्यान से pathophysiological के दौरान होने वाले परिवर्तनों का विश्लेषण करके और बाद गुस्सा इस मॉडल का उपयोग कर, यह पीसी के लिए अनगिनत चिकित्सीय रणनीतियों का विकास संभव है ।

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Disclosures

लेखक कोई प्रासंगिक वित्तीय प्रकटीकरण है ।

Acknowledgments

RRW एक सहयोगी शोधों अनुसंधान सैन डिएगो C3 Padres द्वारा वित्त पोषित अनुदान से इस काम के लिए समर्थन प्राप्त हुआ है कारण (#PTC2017) पेडल ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ECM 830 square wave electroporator Harvard Apparatus BTX # 45-0002 ( 58018-004 )
2 needle array electrode Harvard Apparatus 45-0167
Safety foot switch Harvard Apparatus 45-0211
Platinum Tweezer-trode Harvard Apparatus  45-0486
DMEM-F12 media ThermoFisher Scientific 11320-033
Fetal Bovine Serum ThermoFisher Scientific 10437028
Trypsin ThermoFisher Scientific 25200056
Matrigel Corning  354230
Isoflurane Sigma-Aldrich, Inc. 792632
Lacrilube Fisher Scientific  19090646
Buprenorphine Fisher Scientific  NC1292810
D-luciferrin Perkin Elmer 122799
IVIS  Spectrum In Vivo Imaging System Perkin Elmer 124262
Mouse strain C57BL/6J The Jackson Laboratory  000664/Black 6
Cell line (KPC-Luc 4580) J.J. Yeh Lab at University of North Carolina
BD Precisionglide syringe needles Sigma-Aldrich, Inc. Z192406
Alcohol Swab(70% isopropyl alcohol ) BD 326895
Digital calipers ThermoFisher Scientific 14-648-17
Disposable Scalpels, Sterile VWR 21909
Cotton Tipped Applicators VWR 89198
Suture Needle, 45 cm, Size 6-0 Harvard Apparatus 72-3308
Suture Needle, 45 cm, Size 4-0 Harvard Apparatus 72-3314
Povidone-iodine 10% BD 29900-404
Disposable Warming Pad  KENT SCIENTIFIC CORP. TP-3E
Mouse Hair Clipper KENT SCIENTIFIC CORP. CL8787
Surgical Drape Harvard Apparatus 59-7421
Phosphate-buffered Saline ThermoFisher Scientific 10010023

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References

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Shankara Narayanan, J. S., Ray, P., Naqvi, I., White, R. A Syngeneic Pancreatic Cancer Mouse Model to Study the Effects of Irreversible Electroporation. J. Vis. Exp. (136), e57265, doi:10.3791/57265 (2018).

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