Summary
Eletroporação irreversível (IRE) é uma técnica de ablação não térmicos utilizada para o tratamento do câncer de pâncreas localmente avançado. Sendo uma técnica relativamente nova, os efeitos da ira sobre o crescimento do tumor são mal compreendidos. Nós desenvolvemos um modelo de mouse syngeneic que facilita a estudar os efeitos da ira sobre câncer pancreático.
Abstract
Câncer pancreático (PC), uma doença que mata cerca de 40.000 pacientes a cada ano nos Estados Unidos, tem iludidas com sucesso várias abordagens terapêuticas, incluindo as estratégias de imunoterapia promissoras. Eletroporação irreversível (IRE) é uma técnica de ablação não térmicos que induz a morte de células de tumor sem destruição de estruturas colágenas adjacentes, permitindo, assim, o procedimento a ser realizado nos tumores muito perto dos vasos sanguíneos. Ao contrário de técnicas de ablação térmica, IRE resulta na morte de células apoptóticas gradual, juntamente com necrose imediata ablação induzida e está atualmente em uso clínico para pacientes selecionados com PC localmente avançado. Um ablativo, procedimento específico não-alvo como IRE pode induzir uma infinidade de respostas no microambiente do tumor. Poucos estudos abordaram-se os efeitos da ira sobre o crescimento do tumor em outros tipos de tumor, mas nenhum têm-se centrado no PC. Desenvolvemos um modelo de syngeneic do mouse do PC no qual subcutâneo (SQ) e ortotópico tumores podem ser tratadas com sucesso com ira em um ambiente altamente controlado, facilitando o processo de post vários estudos longitudinais. Este modelo animal serve como um sistema robusto para estudar os efeitos da ira e maneiras de melhorar a eficácia clínica da ira.
Introduction
Adenocarcinoma ductal pancreático (PC) é projetada para se tornar a segunda causa principal de mortes por câncer nos Estados Unidos em torno de 20201. A grande maioria dos pacientes diagnosticados com PC acabará por morrer de doença metastática distante2. O microambiente de PC é notoriamente imunossupressor e chemoresistant. Seu estroma desmoplásico contém uma escassez das células T efetoras (anti-tumorais) e uma proeminência de leucócitos imunossupressoras, incluindo macrófagos tumor-associado (TAMs), mieloide supressor derivada de células (MDSCs) e pilhas de T reguladora (Tregs)3 . Estas fundamentam a necessidade de desenvolver estratégias multimodais que neutralizar estes efeitos do microambiente.
IRA foi desenvolvida como um método não-térmica de ablação de tumor. Ao contrário de técnicas de ablação térmica, IRE não causa necrose coagulativa rápida, mas em vez disso resulta em gradual apoptose celular morte4. Importante para tumores pancreáticos, a ira não é vulnerável aos efeitos de "dissipador de calor" e pode ser realizada ao lado de vasos sanguíneos5. Esta tecnologia tem 510 autorização do FDA6 e atualmente está sendo usada clinicamente, para pacientes selecionados com localmente avançado ou no limite ressecável câncer pancreático. A maior série publicados de IRE para PC7, a sobrevida mediana dos pacientes submetidos à ira foi aproximadamente dobro a sobrevivência dos pacientes tratados com quimioterapia moderna sozinha sem ressecção8,9.
Vários estudos têm demonstrado que a ablação térmica induz uma resposta imune sistêmica em outros tipos de tumor (revisto em Chu et al 10). ablação por radiofrequência (RFA) em tumor animal modelos conduzem ao aumento de células T, se infiltra11,12, incluindo um aumento nas células ativadas assassinas naturais (NK) em hepatocelular câncer pacientes13, 14e uma diminuição de Tregs imunossupressoras em de pacientes de câncer de pulmão15. Um número muito menor de estudos examinaram imunológico, microenvironmental e respostas de lesão para IRE16. IRA foi mostrada para estimular uma resposta imune sistêmica em modelos do rato imunocompetentes em que o crescimento dos enxertos de células renais (contralateral) secundário foi reduzido ou impedido pela ira de um tumor primário duas semanas anteriores17. Eles também observaram que camundongos imunocompetentes necessários menos tensão para regressão completa do que ratos imunodeprimidos. Isso tem sido a hipótese que ira pode resultar na apresentação de antigénios melhorado em comparação com a necrose coagulativa da ablação térmica, mas isto não tem sido estudado especificamente.
Desenvolvemos um modelo de syngeneic do mouse do PC da linha de celular de KPC-Luc 4580 (presente do J.J. Yeh na Universidade da Carolina do Norte), que foi derivado de um tumor que se desenvolveu em um macho LSL-KrasG12D / +; LSL-Trp53R172H / +; PDX1Cre / +; LSL-ROSA26 Luc / + mouse, para estudar os efeitos locais e sistêmicos de IRE18,19. Esta linha de celular do luciferase-expressando é imunogênica e também tumorigênico em imunocompetentes camundongos C57BL/6, quando injetado SQ ou orthotopically e confiantemente produz metástases hepáticas quando injetado o baço. Podemos ter utilizado um gerador de pulso de onda quadrada programável para entregar 100 µs pulsos de eletricidade em uma relação de tensão/distância de 1.500 V/cm, usando uma sonda de matriz de dois-agulha (separados por 5 mm) ou platina pinça-eletrodos para tumores SQ ou ortotópico, respectivamente, em ratos para modelar os efeitos da ira em um animal pequeno.
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Protocol
Todas as experiências com animais realizada seguinte que este protocolo deve ser aprovado pelos respectivos institucional Cuidado Animal e Comitê de uso (IACUC). Todos os procedimentos descritos aqui foram aprovados pelo IACUC UCSD.
1. adquirir animais destinatários
Nota: A linha de celular KPC-Luc 4580 estabeleceu-se de um tumor decorrente de um LSL-KrasG12D / +; LSL-Trp53R172H / +; PDX1Cre / +; LSL-ROSA26 Luc / + mouse (KPC), que é um modelo geneticamente modificado do PC em um fundo de C57BL/6. A vantagem desta linha da célula é que constitutivamente expressa habilitação do luciferase tumor monitoramento em modelos ortotópico. No entanto, outras linhas de células podem também ser utilizadas desde que sejam compatíveis com o fundo genético dos ratos destinatários.
- Determine os grupos experimentais e o número de animais por grupo antecipadamente.
- Escolher a idade (6 - 10 - semana velhos ratos recomendados) e sexo dos animais sendo usado de acordo com a hipótese e a linha celular usado.
2. cultura células
- Dulbecco uso modificada do meio eagle (DMEM): mistura de nutrientes F12 mídia (50: 50) contendo 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% penicilina-estreptomicina antibiótico (mídia de crescimento completo) para cultivar células 4580 KPC-Luc.
- Se congelado, descongele as células 4 dias antes da implantação do tumor.
- Crescem as células a 37 ° C com 5% de CO2 e 95% umidade sob condições assépticas.
- Trypsinize as células com 0,25% tripsina por 5 min a 37 ° C, antes que eles atinjam > 80% confluência e neutralizar a tripsina adicionando duas vezes o volume de mídia de crescimento completo.
Nota: Estas células não estabelecer tumores eficientemente em ratos se utilizam-se na confluência de 100% ou se eles são passados para mais de 12 vezes. Portanto, é aconselhável congelar as células em passagens anteriores sob confluência ideal. - Contar as células usando um hemocytometer e proceder a indução de tumor se números adequados estão presentes (0,5 - 1 x 106 células/rato). Se não, expandir as células para uma passagem mais até números de celular adequada são obtidos.
3. indução de tumores SQ
- Preparar o material necessário: P1000 e P100 pipetas e pontas, seringa de 1 mL, 25G agulhas, matriz da membrana basal (BMM), tubos de centrifuga de mídia basal de DMEM, 1,5 mL. Manter todos os materiais estéreis e frios (4 ° C) até o final do procedimento. Também manter zaragatoas de álcool e cortar cabelo pronto para o uso de animais.
- Trypsinize (conforme passo 2.4) e contar as células e ressuspendê-los em uma concentração de 2-4 x 107 células/mL de DMEM frio.
- Adicionar um volume igual de 100% BMM tornar-se uma suspensão de células final em 50% BMM. O volume final deverá ascender a 50 µ l de suspensão de células para cada mouse necessário. Prepare-se 10% em excesso para acomodar o espaço morto da seringa e para quaisquer erros de pipetagem.
- Alíquota a suspensão em 550 volumes µ l em tubos de centrífuga de 1,5 mL colocado no gelo.
- Conter os animais (6 semana de idade camundongos C57BL/6 machos) usando uma retenção ou manualmente.
Nota: Como alternativa, os ratos podem ser anestesiados com 2,5% de isoflurano em gás oxigênio, a uma taxa de fluxo de 2 L/min, usando um vaporizador de precisão. - Raspe o local da injeção, que é preferencialmente um flanco acima uma perna, usando uma tesoura. Usando um algodão embebido em álcool, limpe o local da injeção duas vezes.
- Desenhar a 250 µ l de suspensão de células em uma concentração final de 1-2 x 107 células/mL em uma seringa de 1 mL fria e remover quaisquer bolhas de ar, deslocando o pistão subir e descer. Coloque uma agulha 25g a seringa e certifique-se de preencher o espaço dentro da agulha.
- Insira cuidadosamente a agulha sob a pele em um ângulo de 30° para o corpo perto dos flancos, certificando-se que a agulha não perfurar a cavidade peritoneal ou a musculatura dos membros.
- Achate a agulha paralela ao corpo e achatar rugas na pele. Injecte lentamente 50 µ l de suspensão de células. Segure a agulha no local da injeção para 10 s para permitir que o BMM solidificar para evitar fugas.
- Lentamente, retire a agulha, mantendo-o paralelo sem nenhum movimento para os lados. Gentilmente Limpe o local da injeção com um algodão embebido em álcool e solte o mouse para seu alojamento.
Nota: Se o mouse foi anestesiado durante o procedimento, monitore o animal até que ele recupere seus braço endireitante reflexos. - Monitore o crescimento do tumor regularmente usando compassos de calibre até atingir 5 mm de diâmetro.
4. indução de tumores ortotópico
- Prepare o material necessário. Autoclave a cirúrgica ferramentas tais como tesouras, bisturis, drivers de agulha e apontou e a pinça com ponta plana. Manter útil suturas estéreis (6-0 absorvível e não absorvível 4-0), cotonetes de álcool, cortar cabelo, creme depilatório, lubrificante do olho, gaze de algodão, solução de iodo povidona 10%, cirúrgicos, almofadas de aquecimento, buprenorfina e agentes anestésicos.
- Eutanásia em um rato do doador (de preferência do mesmo fundo necessário para o modelo ortotópico) carregando um tumor SQ KPC utilizando uma câmara de enchimento lento CO2 . Excisar o tumor SQ cuidadosamente sob condições estéreis de um capuz de BSL-2 usando Pinças esterilizadas e micro-tesouras logo antes da implantação ortotópico. Durante a excisão do tumor, tome cuidado para não perfurar a cavidade peritoneal e lavar o tumor imediatamente com 2 trocas de PBS estéril.
- Usando bisturis esterilizados, picar o tumor extirpado em pedaços de3 mm 1, coloque-os em um prato de Petri contendo estéril DMEM basais criogênicos e armazenar no gelo até a implantação.
- Administre o destinatário mouse 0,05 - 1 mg/kg a buprenorfina analgésico SQ, 30 min antes da cirurgia.
- Anestesia os destinatários ratos com 2-3% de isoflurano em oxigênio (2 L/min), usando um vaporizador de precisão (ou outros agentes anestésicos). Manter os ratos em um 37 ° C almofada para a totalidade do processo de aquecimento. Aplique lubrificante dos olhos para evitar a dessecação. Testar a profundidade da anestesia por falta de surpreendentes reflexo inicialmente e confirmar a anestesia cirúrgica avião pela falta de reflexo pedal para uma pitada de dedo suave. Manter a anestesia durante todo o procedimento cirúrgico.
- Coloque o mouse em suas costas e transformá-lo suavemente para o lado direito para que o lado esquerdo do abdômen é exposto. Remover o cabelo abdominal do mouse usando o creme depilatório e limpar com gaze para garantir que nenhum cabelo gratuito entra a incisão de post do abdômen. Prepare a esquerda do abdômen para a cirurgia usando 3 ciclos de iodopovidona 10% seguido de toalhetes com álcool para desinfectar a pele.
- Usando um bisturi estéril, faça uma incisão transversal ou oblíqua de 1,5 cm na pele, 1 cm à esquerda da linha média, abaixo da caixa torácica, ligeiramente medial para o baço. Em seguida, estenda a incisão através da musculatura abdominal, espelhando a incisão superficial sobrejacente.
- Localize o baço usando plana com ponta fórceps e exteriorizá-lo suavemente da cavidade abdominal. Retrair o baço usando um aplicador de algodão estéril e encontrar a cauda do pâncreas anexado à parte inferior do baço.
- Usando a pinça com ponta plana, retraia a cauda do pâncreas lateralmente.
- Apanhar um tumor finamente picada do mouse doador com a ponta de uma agulha de sutura estéril fino (6-0) e posicioná-lo usando Pinças esterilizadas.
- Enquanto suavemente, retraindo o corpo/cauda do pâncreas lateralmente, insira a agulha de sutura que contém o fragmento de tumor na cauda do pâncreas. Passe a sutura lentamente através do tecido, mantendo o tumor em contato com a cauda do pâncreas. Aplica uma ou duas suturas adicionais, dependendo da orientação do fragmento em relação ao tecido.
- Retire completamente a agulha do tecido e manter o pâncreas/baço exteriorizado por um adicional de 60 s ao inspecionar para quaisquer sinais de hemorragia ou vazamento. Em seguida, internalizá-los suavemente na cavidade abdominal usando fórceps rombudo.
- Feche a musculatura abdominal usando uma sutura de 6-0 com qualquer um ponto contínuo ou interrompido e fechar a pele sobrejacente usando um 3-0 para a sutura interrompida não absorvível de 6-0. Descontinuar a anestesia neste ponto.
- Permitir que o mouse para recuperar em sua jaula para casa com livre acesso à comida e água. Coloque a gaiola em uma almofada de aquecimento para facilitar a recuperação. Monitorar os sinais vitais como a respiração, perfusão etc., durante o processo de recuperação.
- Confirme os sinais do reflexo de endireitamento uma vez que o mouse se recupera, e então retorno a gaiola pode à moradia regular.
- Administrar a buprenorfina 0,05 - 0,1 mg/kg 8-12 h após a cirurgia e a cada 8-12 h após o procedimento conforme necessário para os sinais de dor.
- Monitorar o crescimento do tumor usando uma bioluminescência na vivo , sistema de imagem (consulte a Tabela de materiais).
- Acompanhar o crescimento do tumor por imagem começando no dia 4 após implantação ortotópico e executar a imagem duas vezes por semana.
- No dia da imagem latente, administrar (injeção intraperitoneal) 30 mg/kg para uma anestesiados D-luciferina (2-3% de oxigênio (2 L/min) de isoflurano) destinatário rato 10 min antes da imagem latente.
- Imagem para atividade de luciferase usando a configuração de luminescência sem qualquer filtro de emissão para um mínimo de 5 s exposição em uma imagem de luminescência, com fase aquecida grátis de autofluorescência e mantendo a anestesia para os ratos.
5. a ira dos tumores SQ
- Preparar o material necessário: quadrado de onda electroporator, interruptor de pé de segurança, eletrodos (matriz de agulha contra pinça-pisasse) e adaptadores. Manter estéril suturas (não absorvível 4-0), compressas de álcool, cortar cabelo, creme depilatório, lubrificante de olho, gaze de algodão, buprenorfina e anestésicos também nas proximidades.
- Esterilizar a pinça ou agulha eletrodos de matriz usando a esterilização por gás. Não é recomendada a esterilização em autoclave. Use um esterilizador de grânulo de vidro para esterilizar os eletrodos entre animais.
- Administre a buprenorfina 0,05 - 0,1 mg/Kg para os ratos de tumor-rolamento 30 min antes do procedimento.
- Siga os passos 4.4-4.5 para induzir a anestesia em camundongos com sucesso uma vez que o implante de tumor SQ atinge 5 mm de diâmetro.
- Coloque o mouse anestesiado de lado para acessar o tumor SQ no flanco. Remova os pelos com tesoura e pele limpa usando um algodão embebido em álcool.
- Para tumores SQ, use eletrodos de agulha 2 matriz. Elevar a pele diretamente sob o site tumor usando fórceps e inserir os eletrodos através da pele, paralelo ao organismo certificar-se de que eles não penetram na cavidade peritoneal. Uma vez através da pele, posicione os eletrodos de tal forma que eles suporte o tumor.
- Programa do electroporator para entregar 100 µs de pulsos em uma frequência de 1 Hz a 1.500 V/cm, para um total de 150 pulsos. Entrega os pulsos usando o pedal. Separe cada conjunto de 10 pulsos por 10 s, a fim de permitir a dissipação de calor e confirmar a posição correta dos eletrodos.
Nota: Sem o uso de agentes paralisantes, ratos experimentará contrações musculares com ira que pode causar o deslocamento dos eletrodos a manualmente. - Remova os eletrodos após a dose completa, que não deverá exceder 200 s. registro entregue a tensão real, que é exibido sobre o electroporator. Permitir que os ratos se recuperar após IRE como por etapas 4.14-4.16.
6. ira dos tumores ortotópico
Nota: A ira de tumores ortotópico envolve uma segunda cirurgia de sobrevivência no mouse mesmo exigindo aprovação especial de IACUC local antes de começar.
- Preparar os materiais necessários: autoclave os instrumentos cirúrgicos, tais como tesouras, bisturis, drivers de agulha, apontou o fórceps e liso com ponta fórceps. Lembre-se também o seguinte nas proximidades: suturas estéreis (6-0 absorvível e não absorvível 4-0), amostras de álcool, cortar cabelo, creme depilatório, lubrificante do olho, gaze de algodão, 10% solução de iodo povidona, cirúrgicos, almofadas de aquecimento, electroporator de onda quadrada, interruptor de pé de segurança, eletrodos e seus adaptadores, buprenorfina e anestésicos.
- Avaliar os ratos para o crescimento do tumor ortotópico na vivo de imagem (consulte a etapa 4.17) através da injeção de 30 mg/kg de D-luciferina intraperitonealmente.
Nota: Os tumores ortotópico são ideais para IRE tratamento 8 a 10 dias após a implantação, quando os tumores são claramente visíveis e ainda confinados ao pâncreas como pode ser visto nas imagens da luminescência Luciferase (Ver os Resultados do representante). - Siga os passos 4.4-4.9, para localizar o tumor implantado. Se o tumor não é fácil de localizar, use fórceps nariz brusco para mover o estômago e baço suavemente para identificar o tumor.
- Exteriorizar o tumor com a pinça de nariz brusco e capturar o tumor firmemente com os eléctrodos de platina da pinça-pisasse. Entrega os pulsos electroporation como programado na etapa 5.7 usando o electroporator de onda quadrada em conjuntos de 10 pulsos controlados pelo interruptor de pé.
- Manter o tumor exteriorizado para pelo menos 60 post s IRE para monitorar sinais de hemorragia. Inserir o tumor volta na cavidade abdominal e fechar a incisão, como descritos anteriormente (passos 4.13-4.16) e monitorar o mouse até que se recupere.
- Monitore os efeitos da ira no crescimento do tumor utilizando na vivo do luciferase imagens conforme passo 4.17.
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Representative Results
Seguimos o procedimento descrito acima e gerado SQ tumores na semana de 5-6 velho tipo selvagem C57BL/6 ratos inoculados com 1 x 106 células com 50% BMM. Quando o tamanho do tumor chegou a 5-6 mm de diâmetro, alguns dos ratos foram sacrificados, os tumores foram extirpados e implantaram orthotopically em um destinatário camundongos C57BL/6. IRA foi realizada 10 dias após a implantação, conforme mostrado na linha do tempo na Figura 1. IRE realizou-se nos restantes ratos com tumores SQ.
Em SQ tumores, a duração de tensão e pulso IRE foram mantidos constantes em 1.500 V/cm e 100 µs, respectivamente, mas o número de pulsos variados. A Figura 2 mostra que os tumores SQ em uns poucos ratos regrediram completamente após 150 impulsos da ira, mas não tão bem com 75 pulsos. No total, 4 de 9 camundongos mostraram regressão completa do tumor após 150 impulsos da ira. Análise histológica do tumor tecido 1 semana post ira mostrou grandes regiões de necrose de tumor central que não foram vistos no controle de tumores não tratados. Este núcleo necrótico foi ladeado por tecido vivo do tumor em casos de regressão de tumor incompleta (Figura 3). Implantação bem-sucedida do tumor ortotópico também foi alcançada, e a taxa de crescimento foi monitorizada utilizando na vivo bioluminescência imagens mostrando tumor no dia 10 e dia 15 (Figura 4), após a implantação. IRA em 150 pulsos também provou ser eficaz em ortotópico tumores (Figura 5) mostrando reduzidos volumes de tumor. Em geral, estes resultados demonstram a capacidade deste modelo para simular efeitos de IRE em um modelo do rato imunocompetentes, proporcionando uma plataforma para testar várias condições de ira e combinações para tratar o PC.
Figura 1 : Representação esquemática mostra a curso de tempo de implantação de tumor e IRE. Para tumores SQ, IRE é realizada quando o tumor atinge 5 a 6 mm de diâmetro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : As imagens de luciferase-bioluminescência mostram uma redução no post de crescimento do tumor IRE no modelo SQ. Linha de celular KPC-Luc constitutivamente expressa do luciferase tornando-o viável para monitorar o crescimento do tumor em resposta a ira em tempo real. Dia 14 bioluminescência de imagem post que ira mostra a regressão completa do tumor em um dos ratos tratados com 150 pulsos de IRE, Considerando que a regressão incompleta foi visto com 75 pulsos de ira quando comparado com o controle não tratado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Hematoxilina e eosina coloração do tecido do tumor mostra as alterações na arquitetura do tecido post IRE. Tumores SQ expostos a ira mostraram grandes regiões de necrose central, rodeado por regiões de tecido vivo indicando inadequada cobertura IRE, em alguns casos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : As imagens de bioluminescência mostram a implantação bem sucedida do tumor ortotópico e seu crescimento ao longo do tempo. Imagens foram tiradas usando uma comercial bioluminescência instrumento de imagem com a luminescência capturada na exposição de 1 min. Os ratos foram injetados com 30 mg/kg de solução D-luciferina intraperitonealmente 10 min antes de imagem. Os ratos foram mantidos anestesiado usando 2% de isoflurano durante o procedimento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Ira induz redução de crescimento do tumor em tumores ortotópico PC. (A) Bioluminescecnce imagens de ratos abrigando ortotópico PC mostrou sinal de luciferase reduzida 7 dias pós-ira em comparação com o sham a cirurgia sugerindo que reduziu o peso do tumor ao vivo como resultado da ira. (B) volume médio de extirpado ortotópico tumores (+ erro padrão) nos ratos controle vs ratos submetidos a ira. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Neste estudo, demonstramos um modelo de rato imunocompetentes para PC que pode ser usado para estudar os efeitos da ira sobre o crescimento do tumor. Atualmente, o Ira está sendo usada como uma técnica de ablação térmica não apenas em pacientes altamente selecionados de PC localmente avançados que não têm progressão da doença distante depois de meses de terapia pré-operatória. Seu uso, portanto, tem sido limitado, porque a maioria dos pacientes com PC localmente avançado desenvolver doença metastática distante20. Este modelo vai servir como uma base para estudos para avaliar os efeitos da ira no PC usando vários parâmetros de tratamento prolongado e combinações.
A coisa mais importante a considerar durante o protocolo é o tamanho do tumor na qual ira é executada. As sondas comercialmente disponíveis para modelos de ratos são limitadas pela sua distância do eletrodo (5-10 mm). Daí, em tumores significativamente maiores do que a distância do eletrodo, ablação incompleta se realiza. Para tumores SQ, recomenda-se o uso de eletrodos de agulha 2 matriz com pinça-eletrodos à medida que a pele ao redor do tumor aumenta a resistência ao fluxo da corrente na pinça-eletrodos. A limitação de tamanho dos eléctrodos de matriz 2-agulha pode ser superada, realizando a ira em vários ângulos e profundidades no mesmo tumor; no entanto, essa abordagem torna difícil tratar tumores uniformemente. Como alternativa, para tumores maiores (até 10 mm), uma incisão pode ser feita sobre a pele abaixo do tumor para um comprimento ligeiramente maior que o diâmetro do tumor. O tumor pode então ser exteriorizado através da incisão, invertendo-se a pele sobrejacente usando fórceps. O tumor pode ser tratado em seguida com pinça-eletrodos, semelhantes os tumores ortotópico descritos acima. O tumor electroporated, em seguida, pode ser reinserido sob a pele e a pele suturada com uma sutura não absorvível de 4-0 como um ponto de interrupção. No entanto, os efeitos da incisão podem confundir os efeitos de ira, e achamos que realizando ira quando os tumores estão dentro da distância de trabalho dos eletrodos agulha dois matriz (~ 5-6 mm) fornece a melhor padronização.
Independentemente da abordagem, o número de pulsos precisa ser determinado empiricamente dependendo do tipo de tumor. Estudos publicados utilizaram-se entre 150-300 pulsos nesta tensão17. No entanto, determinamos o número ideal de pulsos em um experimento de dose-resposta preliminar. Existem modelos para prever a zona de ablação completa com base na distância de tensão e eletrodo, mas tipos de tumor podem variar muito na vascularização e fibrose, que pode afetar a resposta à eletroporação21.
Cada conjunto de 10 pulsos foi separado por 10 s para evitar os efeitos de aquecimento que ocorrem se muitos pulsos são entregues muito rapidamente. Excesso de tratamento pode resultar em ablação térmica, que pode impedir a caracterização exata dos efeitos não térmicos IRE. O intervalo de 10 s também nos permite confirmar frequentemente eletrodo posicionamento com precisão, já que as contrações musculares podem causar deslocamento do eletrodo. Nossa IACUC não permitiu ainda o uso de agentes paralisantes em pequenos animais, o que podem reduzir consideravelmente as contrações musculares durante a ira. No caso de tumores ortotópico, a pinça-eletrodos permite-nos firmemente os tumores e contam com uma maior área de superfície de eletrodo em comparação com o eletrodo de agulha.
Embora IRE atualmente é apenas usado como um procedimento ablativo na prática clínica, eletroporação em geral tem um amplo espectro de aplicações variando de ativações de nervos e músculos a entrega de várias drogas e oligonucleotides. Analisando cuidadosamente as mudanças fisiopatológicas que ocorrem durante e após a IRE usando este modelo, é possível desenvolver inúmeras estratégias terapêuticas para PC.
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Disclosures
Os autores têm sem divulgações financeiras relevantes.
Acknowledgments
RAW tem recebido apoio para este trabalho de uma bolsa de Investigação translacional colaborativo financiado pelo C3 San Diego Padres Pedal a causa (#PTC2017).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ECM 830 square wave electroporator | Harvard Apparatus | BTX # 45-0002 ( 58018-004 ) | |
| 2 needle array electrode | Harvard Apparatus | 45-0167 | |
| Safety foot switch | Harvard Apparatus | 45-0211 | |
| Platinum Tweezer-trode | Harvard Apparatus | 45-0486 | |
| DMEM-F12 media | ThermoFisher Scientific | 11320-033 | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific | 10437028 | |
| Trypsin | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich, Inc. | 792632 | |
| Lacrilube | Fisher Scientific | 19090646 | |
| Buprenorphine | Fisher Scientific | NC1292810 | |
| D-luciferrin | Perkin Elmer | 122799 | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | 124262 | |
| Mouse strain C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 000664/Black 6 | |
| Cell line (KPC-Luc 4580) | J.J. Yeh Lab at University of North Carolina | ||
| BD Precisionglide syringe needles | Sigma-Aldrich, Inc. | Z192406 | |
| Alcohol Swab(70% isopropyl alcohol ) | BD | 326895 | |
| Digital calipers | ThermoFisher Scientific | 14-648-17 | |
| Disposable Scalpels, Sterile | VWR | 21909 | |
| Cotton Tipped Applicators | VWR | 89198 | |
| Suture Needle, 45 cm, Size 6-0 | Harvard Apparatus | 72-3308 | |
| Suture Needle, 45 cm, Size 4-0 | Harvard Apparatus | 72-3314 | |
| Povidone-iodine 10% | BD | 29900-404 | |
| Disposable Warming Pad | KENT SCIENTIFIC CORP. | TP-3E | |
| Mouse Hair Clipper | KENT SCIENTIFIC CORP. | CL8787 | |
| Surgical Drape | Harvard Apparatus | 59-7421 | |
| Phosphate-buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 10010023 |
References
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