Summary
Elettroporazione irreversibile (IRE) è una tecnica di ablazione non-termica utilizzata per il trattamento del cancro del pancreas localmente avanzato. Essendo una tecnica relativamente nuova, gli effetti di IRE sulla crescita del tumore sono capiti male. Abbiamo sviluppato un modello syngeneic del topo che facilita lo studio degli effetti dell'IRE su cancro del pancreas.
Abstract
Cancro del pancreas (PC), una malattia che uccide circa 40.000 pazienti ogni anno negli Stati Uniti, ha eluso con successo diversi approcci terapeutici che le strategie immunoterapeutiche promettente. Elettroporazione irreversibile (IRE) è una tecnica di ablazione non termica che induce la morte delle cellule tumorali senza distruzione delle strutture adiacenti collagene, consentendo in tal modo la procedura deve essere eseguita nei tumori molto vicino ai vasi sanguigni. A differenza delle tecniche di ablazione termica, IRE risultati nella morte cellulare apoptotica graduale, insieme a necrosi immediata ablazione indotto ed è attualmente in uso clinico per i pazienti selezionati con PC localmente avanzato. Un ablativo, non bersaglio procedura specifica come IRE può indurre una miriade di risposte nel microambiente tumorale. Pochi studi hanno affrontato gli effetti di IRE sulla crescita del tumore in altri tipi di tumore, ma nessuno si sono concentrati sul PC. Abbiamo sviluppato un modello syngeneic del topo del PC in cui sottocutaneo (SQ) e orthotopic tumori possono essere trattati con successo con IRE in un ambiente altamente controllato, facilitando le varie routine di post di studi longitudinali. Questo modello animale serve come un sistema robusto per studiare gli effetti dell'IRE e modi per migliorare l'efficacia clinica di IRE.
Introduction
L'adenocarcinoma duttale pancreatico (PC) è proiettato a diventare la seconda causa principale delle morti del cancro negli Stati Uniti intorno 20201. La stragrande maggioranza dei pazienti diagnosticati con il PC alla fine muoiono dalla malattia metastatica a distanza2. Il microambiente di PC è notoriamente immunosopressivo e chemioresistente. Relativo stroma desmoplastico contiene una scarsità di cellule T effettrici (anti-tumorale) e una prominenza dei leucociti immunosoppressori, tra cui i macrofagi associati al tumore (TAM), cellule mieloidi soppressore derivate (MDSC) e cellule T regolatorie (Treg)3 . Questi sono alla base della necessità di sviluppare strategie multimodali che neutralizzano questi effetti del microambiente.
IRE è stata sviluppata come un metodo non-termica di ablazione del tumore. A differenza delle tecniche di ablazione termica, IRE non causa necrosi coagulativa rapida ma invece si traduce in graduale apoptotica delle cellule morte4. D'importanza per i tumori pancreatici, IRE non è vulnerabile agli effetti di "dissipatore di calore" e può essere eseguita proprio accanto a vasi sanguigni5. Questa tecnologia ha spazio di 510 (k) dalla FDA6 ed è attualmente utilizzata clinicamente, per i pazienti selezionati con cancro pancreatico resecabile localmente avanzato o borderline. La più grande serie pubblicati di IRE per PC7, la sopravvivenza mediana dei pazienti sottoposti a IRE era approssimativamente doppia la sopravvivenza dei pazienti trattati con chemioterapia moderna da solo senza resezione8,9.
Parecchi studi hanno dimostrato che l'ablazione termica induce una risposta immunitaria sistemica in altri tipi di tumore (rivisto in Chu et al. 10). l'ablazione di radiofrequenza (RFA) in modelli animali del tumore comporta aumentata delle cellule di T si infiltra11,12, compreso un aumento in cellule attivato natural killer (NK) epatocellulare cancro pazienti13, 14e una diminuzione in immunosopressiva Treg nel polmone cancro pazienti15. Un numero molto inferiore di studi hanno esaminato immunitario, microambiente e danno risposte a IRE16. IRE ha dimostrata di stimolare una risposta immunitaria sistemica in modelli di topi immunocompetenti in cui la crescita di osso omoplastico secondario (controlaterale) renale delle cellule è stato ridotto o evitata con IRE di un tumore primario due settimane precedenti17. Essi hanno anche osservato che i topi immunocompetenti richiesto meno tensione per regressione completa che ha fatto topi immunocompromessi. È stato ipotizzato che potrebbe causare IRE presentazione antigenica migliorata rispetto alla necrosi coagulativa di ablazione termica, ma questo non è stato specificamente studiato.
Abbiamo sviluppato un modello syngeneic del topo del PC dalla linea cellulare KPC-Luc 4580 (regalo da J.J. Yeh presso University of North Carolina), che è stato derivato da un tumore sviluppatosi in un maschio LSL-KrasG12D / +; LSL-Trp53R172H / +; PDX1Cre / +; LSL-ROSA26 Luc / + mouse, per studiare gli effetti locali e sistemici di IRE18,19. Questa linea cellulare che esprime luciferasi è immunogenico e anche cancerogeni in topi C57BL/6 immunocompetenti quando iniettato SQ o orthotopically e produce in modo affidabile le metastasi del fegato quando iniettato nella milza. Abbiamo utilizzato un generatore di impulsi programmabile onda quadra per consegnare 100 µs impulsi di energia elettrica ad un rapporto di tensione/distanza di 1.500 V/cm utilizzando una sonda di allineamento di due aghi (separati da 5 mm) o platino pinzette-elettrodi ai tumori SQ o ortotopico, rispettivamente, in topi di modellare gli effetti di IRE in un piccolo animale.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali effettuati seguendo che questo protocollo deve essere approvato dal rispettivo istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC). Tutte le procedure qui descritte sono state approvate da IACUC UCSD.
1. procurarsi animali destinatari
Nota: La linea cellulare 4580 KPC-Luc è stata stabilita da un tumore che presenta in un LSL-KrasG12D / +; LSL-Trp53R172H / +; PDX1Cre / +; LSL-ROSA26 Luc / + mouse (KPC), che è un modello geneticamente costruito del PC su uno sfondo di C57BL/6. Il vantaggio di questa linea cellulare è che esso esprime costitutivamente luciferasi-attivazione del monitoraggio di tumore in Modelli ortotopici. Tuttavia, altre linee cellulari possono anche essere utilizzati, purché siano compatibili con il background genetico dei topi destinatari.
- Determinare in anticipo i gruppi sperimentali e il numero di animali per gruppo.
- Scegli l'età (6 - 10 - settimana-vecchi topi consigliati) e sesso degli animali utilizzati secondo l'ipotesi e la linea cellulare utilizzato.
2. coltura cellule
- Uso Dulbecco s modified medium (DMEM) di eagle: miscela nutriente F12 (50: 50) supporti contenenti 10% siero bovino fetale (FBS) e 1% antibiotico penicillina-streptomicina (media di sviluppo completo) per far crescere cellule 4580 KPC-Luc.
- Se congelato, scongelare le cellule 4 giorni prima dell'impianto del tumore.
- Crescere le cellule a 37 ° C con 5% CO2% e 95% di umidità in condizioni asettiche.
- Tripsinizzano le cellule con 0,25% tripsina per 5 min a 37 ° C prima che raggiungano > confluency di 80% e neutralizzare la tripsina aggiungendo due volte il volume dei mezzi di crescita completa.
Nota: Queste cellule non stabilire i tumori in modo efficiente in topi se vengono utilizzati al 100% confluency o se essi sono attraversate per più di 12 volte. Quindi, si consiglia di congelare le cellule alle precedenti passaggi sotto confluency di ottimale. - Contare le celle utilizzando un emocitometro e procedere per induzione del tumore in se un numero sufficiente è presente (0,5 - 1 x 106 cellule/mouse). In caso contrario, espandere le cellule per un passaggio più fino a numeri di cellulare adeguata sono ottenuti.
3. induzione di tumori SQ
- Preparare i materiali richiesti: P1000 e P100 pipette e puntali, siringa da 1 mL, 25G aghi, matrice della membrana basale (BMM), media basale di DMEM, 1,5 mL provette da centrifuga. Mantenere tutto il materiale sterile e freddo (4 ° C) fino alla fine della procedura. Anche tenere tosatrici e tamponi imbevuti di alcool pronto per l'uso di animali.
- Tripsinizzano (secondo passaggio 2.4) e contare le celle e risospendere li ad una concentrazione di 2-4 x 107 cellule/mL di DMEM freddo.
- Aggiungere un volume equivalente di 100% BMM fare una sospensione cellulare finale in 50% BMM. Il volume finale dovrebbe ammontare a 50 µ l di sospensione cellulare per ogni mouse richiesto. Preparare 10% in eccesso per ospitare lo spazio morto nella siringa e per eventuali errori di pipettaggio.
- Aliquotare la sospensione in 550 volumi µ l in provette da 1,5 mL Centrifuga messo in ghiaccio.
- Trattenere gli animali (6 - settimana-vecchio maschi topi C57BL/6) utilizzando un dispositivo di ritenuta o manualmente.
Nota: In alternativa, topi possono essere anestetizzati con isoflurano 2,5% in gas di ossigeno ad un flusso di 2 L/min utilizzando un vaporizzatore di precisione. - Il sito di iniezione, che è preferibilmente su un fianco sopra una gamba, utilizzando un clipper la barba. Pulire con un batuffolo imbevuto di alcool, nel sito di iniezione due volte.
- Disegnare 250 µ l di sospensione cellulare ad una concentrazione finale di 1-2 x 107 cellule/mL in siringa 1 mL fredda e rimuovere eventuali bolle d'aria muovendo il pistone su e giù. Inserire un ago 25G nella siringa e assicurarsi di riempire lo spazio all'interno dell'ago.
- Inserire delicatamente l'ago sotto la pelle verso il corpo vicino ai fianchi, assicurandosi che l'ago non perforare la cavità peritoneale o la muscolatura degli arti con un'angolazione di 30°.
- Appiattire l'ago parallelo al corpo e appiattire le rughe sulla pelle. Iniettare lentamente 50 µ l di sospensione cellulare. Tenere l'ago al sito di iniezione per 10 s per consentire il BMM a solidificare per evitare eventuali perdite.
- Estrarre lentamente l'ago tenendolo parallelo senza alcun movimento laterale. Pulire il sito di iniezione con un batuffolo imbevuto di alcool delicatamente e rilasciare il mouse nella sua sede.
Nota: Se il mouse è stato anestetizzato durante la procedura, monitorare l'animale fino a quando si riacquista i suoi riflessi di raddrizzamento. - Monitorare la crescita del tumore usando regolarmente pinze fino a 5 mm di diametro.
4. induzione di tumori di Orthotopic
- Preparare i materiali richiesti. Autoclave la chirurgica strumenti come forbici, bisturi, aghi driver e punta e pinze a punta piatta. Mantenere utile suture sterili (6-0 assorbibili e non assorbibili 4-0), tamponi imbevuti di alcool, tosatrici, crema depilatoria, lubrificante occhio, garza di cotone, soluzione di iodio povidone 10%, teli chirurgici, termofori, buprenorfina e agenti anestetici.
- Eutanasia di un mouse di donatore (preferibilmente dello stesso sfondo richiesto per il modello ortotopico) che trasportano un tumore SQ KPC utilizzando una camera di riempimento lento CO2 . Asportare il tumore SQ attentamente in condizioni sterili in una cappa di BSL-2 usando pinze sterili e microforbici poco prima dell'impianto ortotopico. Durante l'asportazione del tumore fare attenzione a non forare la cavità peritoneale e lavare il tumore immediatamente con 2 scambi di PBS sterile.
- Utilizzando il bisturi sterile, tritare il tumore asportato in 1 mm3 pezzi, metterli su una piastra Petri contenente freddo sterile DMEM media basale e conservare il ghiaccio fino al momento dell'impianto.
- Amministrare il destinatario mouse 0.05 - 1 mg/kg buprenorfina analgesico SQ, 30 min prima della chirurgia.
- Anestetizzare i topi destinatari con isoflurano 2-3% in ossigeno (2 L/min) utilizzando un vaporizzatore di precisione (o altri agenti anestetici). Tenere il topi su un 37 ° C riscaldamento pad per l'interezza della procedura. Applicare il lubrificante per gli occhi per evitare il disseccamento. Prova la profondità dell'anestesia da mancanza di sorprendente riflesso inizialmente e confermare l'anestesia chirurgica aereo dalla mancanza del pedale riflesso a un pizzico di delicata punta. Mantenere l'anestesia durante l'intera procedura chirurgica.
- Posizionare il mouse sul dorso e girare delicatamente al suo lato destro in modo che il lato sinistro dell'addome è esposto. Rimuovere i capelli addominali del mouse usando la crema depilatoria e pulire con una garza per garantire che capelli gratis non entra l'incisione di post addome. Preparare l'addome di sinistra per chirurgia usando 3 cicli di iodio povidone 10% seguita da salviettine imbevute di alcool per disinfettare la pelle.
- Usando un bisturi sterile, praticare un'incisione trasversa o obliqua di 1.5 cm nella pelle, 1 cm a sinistra della linea mediana, sotto la gabbia toracica, leggermente mediale alla milza. Quindi, estendere l'incisione attraverso la muscolatura addominale, l'incisione superficiale sovrastante di mirroring.
- Individuare la milza usando piatta con punta forcipe e delicatamente esternare e dalla cavità addominale. Ritrarre la milza utilizzando un applicatore di cotone sterile e trovare la coda del pancreas attaccato al fondo della milza.
- Utilizzando le pinze a punta piatta, ritrarre lateralmente la coda del pancreas.
- Prendere un tumore finemente macinate pezzo dal mouse donatore con la punta di un ago di sutura sterile di belle (6-0) e la posizione utilizzando pinze sterili.
- Mentre delicatamente di retrazione lateralmente il coda/corpo del pancreas, inserire l'ago di sutura contenente il frammento di tumore nella coda del pancreas. Passare la sutura lentamente attraverso il tessuto, che tiene il tumore a contatto con la coda del pancreas. Applicare una o due suture supplementari a seconda dell'orientamento del frammento rispetto il tessuto.
- Rimuovere completamente l'ago dal tessuto e mantenere il pancreas/milza esteriorizzata per un supplemento di 60 s durante l'ispezione per eventuali segni di emorragia o di perdita. Quindi, di interiorizzare delicatamente nella cavità addominale utilizzando forcipe smussato.
- Chiudere la muscolatura addominale utilizzando una sutura riassorbibile 6-0 sia con una cucitura continua o interrotta e la pelle sovrastante utilizzando un 3-0 a 6-0 suturare interrotti non assorbibili. Interrompere l'anestesia a questo punto.
- Consentire il mouse per recuperare nella sua gabbia a casa con libero accesso al cibo e acqua. Posizionare la gabbia su un rilievo di riscaldamento per facilitare il recupero. Monitorare i segni vitali quali la respirazione, aspersione ecc., durante il processo di recupero.
- Confermare i segni del riflesso di raddrizzamento una volta recupera il mouse, e poi tornare la gabbia può regolare alloggiamento.
- Amministrare la buprenorfina 0,05 - 0,1 mg/kg 8-12 h dopo l'intervento chirurgico e ogni 8-12 h dopo la procedura se necessario per i segni di dolore.
- Monitorare la crescita del tumore usando un bioluminescenza in vivo imaging system (Vedi la Tabella materiali).
- Seguire la crescita del tumore da imaging a partire il giorno 4 dopo l'impianto ortotopico ed eseguire due volte a settimana di imaging.
- Il giorno dell'imaging, amministrare (iniezione intraperitoneale) 30 mg/kg D-luciferina per un anestetizzati (2-3% isoflurane in ossigeno (2 L/min)) destinatario mouse 10 min prima di formazione immagine.
- Immagine per l'attività luciferasica utilizzando l'impostazione di luminescenza senza alcun filtro di emissione per un minimo di 5 s esposizione in un imager di luminescenza con piatto riscaldato gratuito auto-fluorescenza e pur mantenendo l'anestesia per i topi.
5. IRE dei tumori SQ
- Preparare i materiali richiesti: quadrato onda electroporator, interruttore di sicurezza a pedale, elettrodi (matrice dell'ago contro pinzette-trode) e adattatori. Mantenere sterile suture (non assorbibile 4-0), tamponi imbevuti di alcool, tosatrici, crema depilatoria, lubrificante di occhio, garza di cotone, buprenorfina e anestetici nelle vicinanze.
- Sterilizzare la pinzetta o aghi elettrodi di matrice utilizzando la sterilizzazione a gas. Sterilizzazione in autoclave non è raccomandato. Utilizzare uno sterilizzatore del branello di vetro per sterilizzare gli elettrodi fra gli animali.
- Amministrare la buprenorfina 0,05 - 0,1 mg/Kg per i topi del tumore-cuscinetto 30 min prima della procedura.
- Procedura 4.4-4.5 per con successo inducono anestesia in topi una volta che l'impianto SQ tumore raggiunge 5 mm di diametro.
- Posizionare il mouse anestetizzato su un lato per accedere il tumore SQ sul fianco. Rimuovere i capelli utilizzando clippers e pulire la pelle usando un batuffolo imbevuto di alcool.
- Per i tumori SQ, utilizzare matrice 2 aghi elettrodi. Elevare la pelle direttamente sotto il sito del tumore usando il forcipe e inserire gli elettrodi attraverso la pelle parallela al corpo assicurandosi che non penetrano nella cavità peritoneale. Una volta attraverso la pelle, posizionare gli elettrodi in modo tale che essi staffa il tumore.
- Programma electroporator a consegnare 100 µs impulsi ad una frequenza di 1 Hz a 1.500 V/cm per un totale di 150 impulsi. Consegnare gli impulsi utilizzando il comando a pedale. Separare ogni set di 10 impulsi di 10 s, al fine di consentire la dissipazione di calore e confermare la corretta posizione degli elettrodi.
Nota: Senza l'uso di agenti paralitici, topi verificherà le contrazioni muscolari con IRE che possono causare lo spostamento degli elettrodi se non manualmente fissata. - Rimuovere gli elettrodi dopo il dosaggio completo, che non devono superare i 200 Record s. consegnata la tensione effettiva, che viene visualizzato sulla electroporator. Consentire i topi recuperare dopo IRE secondo passi 4,14-4,16.
6. IRE di Orthotopic tumori
Nota: IRE di orthotopic tumori coinvolge un secondo ambulatorio di sopravvivenza sul mouse stesso che richiede un'autorizzazione speciale da IACUC locale prima di iniziare.
- Preparare i materiali richiesti: autoclave gli strumenti chirurgici come forbici, bisturi, aghi driver, puntato forcipe e piatta con punta forcipe. Tenere i seguenti nelle vicinanze pure: suture sterili (6-0 assorbibili e non assorbibili 4-0), tamponi imbevuti di alcool, tosatrici, crema depilatoria, occhio lubrificante, garza di cotone, 10% soluzione di iodio povidone, teli chirurgici, termofori, onda quadra electroporator, interruttore di sicurezza a pedale, elettrodi e loro adattatori, buprenorfina e anestetici.
- Valutare i topi per la crescita del tumore di orthotopic da in vivo imaging (Vedi punto 4.17) iniettando 30 mg/kg di D-luciferina intraperitonealmente.
Nota: I tumori di orthotopic sono ideali per IRE trattamento 8-10 giorni dopo l'impianto quando i tumori sono chiaramente visibili e ancora confinato al pancreas può essere visto sulle immagini di luminescenza di Luciferase (Vedi i Risultati rappresentante). - Procedura 4.4-4.9, per individuare il tumore impiantato. Se il tumore non è facile da individuare, utilizzare pinze dal naso smussate per spostare lo stomaco e la milza delicatamente per identificare il tumore.
- Esternare il tumore con il forcipe dal naso smussato e catturare il tumore strettamente con gli elettrodi di platino di pinzette-trode. Consegnare gli impulsi di elettroporazione come programmato nel passaggio 5.7 utilizzando il electroporator onda quadra in set di 10 impulsi controllati dall'interruttore a pedale.
- Mantenere il tumore esteriorizzato per almeno 60 post s IRE per monitorare eventuali segni di emorragia. Reinserire il tumore nella cavità addominale e chiudere l'incisione come descritti (passaggi precedenti 4,13-4,16) e monitorare il mouse fino a quando si recupera.
- Monitorare gli effetti delle IRE sulla crescita del tumore usando la formazione immagine in vivo luciferasi secondo passo 4,17.
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Representative Results
Abbiamo seguito la procedura descritta sopra e generato tumori SQ sul 5-6 settimana vecchio tipo selvatico C57BL/6 topi inoculati con 1 x 106 cellule con 50% BMM. Quando le dimensioni del tumore ha raggiunto 5-6 mm di diametro, alcuni dei topi sono stati sacrificati, i loro tumori sono stati asportati e impiantato orthotopically in un destinatario topi C57BL/6. IRE è stata effettuata 10 giorni dopo l'impianto come illustrato nella timeline nella Figura 1. IRE è stata effettuata sui topi restanti sopportano i tumori SQ.
In SQ tumori, la durata di tensione e impulsi IRE sono stati mantenuti costanti a 1.500 V/cm e 100 µs, rispettivamente, ma variato il numero di impulsi. La figura 2 Mostra che i tumori SQ in alcuni topi completamente regredita dopo 150 impulsi di IRE, ma non anche con 75 impulsi. In totale, 4 su 9 topi ha mostrato la regressione completa del tumore dopo 150 impulsi di IRE. L'analisi istologica del tumore del tessuto 1 settimana post IRE ha mostrata grandi regioni di necrosi del tumore centrale che non sono stati veduti nel controllare i tumori non trattati. Questo nucleo necrotico è stato affiancato dal tessuto del tumore dal vivo nei casi di regressione del tumore incompleta (Figura 3). Riuscito impianto di orthotopic del tumore inoltre è stato raggiunto, e il tasso di crescita è stato controllato facendo uso di in vivo imaging bioluminescenza mostrando tumore al giorno 10 e 15 (Figura 4) dopo l'impianto. IRE a 150 impulsi ha anche dimostrato di essere efficace in orthotopic tumori (Figura 5) che mostrano ridotti volumi del tumore. Nel complesso, questi risultati dimostrano la capacità di questo modello per simulare effetti di IRE in un modello del mouse immunocompetenti, fornendo una piattaforma per testare varie condizioni IRE e combinazioni per il trattamento di PC.
Figura 1 : Rappresentazione schematica spettacoli il corso di tempo dell'impianto del tumore e IRE. Per i tumori SQ, IRE viene eseguita non appena il tumore raggiunge 5-6 mm di diametro. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Formazione immagine luciferase-bioluminescenza Mostra una riduzione nel post di crescita del tumore IRE modello SQ. Linea cellulare KPC-Luc esprime costitutivamente luciferasi rendendo fattibile per monitorare la crescita del tumore in risposta a IRE in tempo reale. Giorno 14 bioluminescenza imaging post che ire Mostra la regressione completa del tumore in uno dei topi trattati con 150 impulsi di IRE, mentre incompleta regressione è stata veduta con 75 impulsi di IRE rispetto al controllo non trattato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Ematossilina ed eosina di tessuto tumorale dimostra i cambiamenti nell'architettura del tessuto post IRE. Tumori SQ esposti a IRE hanno mostrato grandi regioni di necrosi centrale, circondata da aree di tessuto vivo che indica insufficiente copertura IRE in alcuni casi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Bioluminescenza imaging Mostra il riuscito impianto di orthotopic del tumore e la sua crescita nel tempo. Immagini sono state scattate con una bioluminescenza commerciale strumento di imaging con la luminescenza catturata a 1 min di esposizione. I topi sono stati iniettati intraperitonealmente con 30 mg/kg di soluzione D-luciferina 10 min prima di formazione immagine. Sono stati mantenuti topi anestetizzati utilizzando 2% isoflurane durante la procedura. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 : IRE induce riduzione della crescita del tumore nei tumori di orthotopic PC. Bioluminescecnce (A) rispetto alle immagini di topi che harboring orthotopic del PC ha mostrato ridotta luciferasi segnale 7 giorni post-IRE sham chirurgia suggerendo ridotto carico diretta del tumore a seguito di IRE. (B) il volume medio di asportato orthotopic tumori (+ errore standard) nei topi di controllo contro i topi che hanno subito IRE. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
In questo studio, abbiamo dimostrato un modello di topo immunocompetenti per PC che può essere utilizzato per studiare gli effetti dell'IRE sulla crescita del tumore. Attualmente, IRE è utilizzata come una tecnica di ablazione non termico solo in altamente selezionati pazienti localmente avanzati del PC che non dispongono di progressione di malattia a distanza dopo mesi di terapia preoperatoria. Suo uso è stato limitato quindi perché la maggior parte dei pazienti con localmente avanzato PC sviluppare malattia metastatica a distanza20. Questo modello servirà come base per studi per valutare gli effetti di IRE sul PC utilizzando diversi parametri di trattamento esteso e combinazioni.
La cosa più importante da considerare durante il protocollo è la dimensione del tumore in cui viene eseguita l'IRE. Le sonde disponibili in commercio per i modelli di topi sono limitate dalla loro distanza elettrodi (5-10 mm). Quindi, nei tumori significativamente maggiori della distanza di elettrodo, ablazione incompleta si svolge. Per i tumori SQ, l'uso degli elettrodi 2 aghi matrice sopra pinzette-elettrodi è raccomandato come la pelle che circonda il tumore aumenta la resistenza al flusso di corrente in pinzette-elettrodi. Il limite di dimensione degli elettrodi 2 aghi matrice possa essere superato eseguendo le IRE alle diverse profondità e angoli nel tumore stesso; Tuttavia, questo approccio rende difficile trattare i tumori in modo uniforme. In alternativa, per i tumori più grandi (fino a 10 mm), un'incisione può essere fatta sulla pelle sotto il tumore ad una lunghezza leggermente più lungo il diametro del tumore. Il tumore può quindi essere esternalizzato attraverso l'incisione invertendo la pelle sovrastante usando il forcipe. Il tumore quindi può essere trattato con pinzette-elettrodi, simili ai tumori orthotopic descritti sopra. Il tumore individulamente può quindi essere reinserito sotto la pelle e la pelle suturata con una sutura non assorbibile 4-0 come un punto di interruzione. Tuttavia, gli effetti dell'incisione possono confondere gli effetti dell'IRE, e abbiamo trovato che l'esecuzione di IRE quando i tumori sono entro la distanza di lavoro degli elettrodi matrice di due aghi (~ 5-6 mm) fornisce la migliore standardizzazione.
Indipendentemente dall'approccio, il numero di impulsi deve essere determinata empiricamente a seconda del tipo di tumore. Gli studi pubblicati hanno utilizzato tra gli impulsi di 150-300 a questa tensione17. Tuttavia, abbiamo determinato il numero ottimale di impulsi in un esperimento preliminare dose-risposta. Ci sono modelli per predire la zona di ablazione completa basata sulla distanza di tensione ed elettrodo, ma tipi di tumore può variare notevolmente in vascularity e fibrosi, che possono influenzare la risposta a elettroporazione21.
Ogni set di 10 impulsi era separata da 10 s per evitare gli effetti di riscaldamento che si verificano se troppi impulsi vengono consegnati troppo in fretta. Sovra-trattamento può causare l'ablazione termica, che può impedire l'accurata caratterizzazione degli effetti di non-termica IRE. L'intervallo di s 10 ci permette anche di verificare frequentemente posizionamento elettrodi con precisione poiché le contrazioni muscolari possono causare lo spostamento dell'elettrodo. Nostra IACUC non ha ancora consentito l'uso di agenti paralitici in piccoli animali, che possono notevolmente ridurre le contrazioni muscolari durante IRE. In caso di tumori ortotopico, pinzetta-elettrodi permette di tenere saldamente i tumori e hanno una maggiore superficie di elettrodo rispetto elettrodo ad ago.
Anche se IRE è attualmente utilizzata come una procedura ablativa in ambito clinico, solo elettroporazione in generale ha un ampio spettro di applicazioni che vanno dalle attivazioni del nervo e del muscolo alla consegna di vari farmaci e oligonucleotidi. Analizzando attentamente i cambiamenti patofisiologici che si verificano durante e dopo IRE utilizzando questo modello, è possibile sviluppare innumerevoli strategie terapeutiche per PC.
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Disclosures
Gli autori non hanno alcuna informazioni finanziarie rilevanti.
Acknowledgments
RRW ha ricevuto sostegno per questo lavoro da un assegno di ricerca traslazionale collaborativo finanziato dal C3 San Diego Padres pedale la causa (#PTC2017).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ECM 830 square wave electroporator | Harvard Apparatus | BTX # 45-0002 ( 58018-004 ) | |
| 2 needle array electrode | Harvard Apparatus | 45-0167 | |
| Safety foot switch | Harvard Apparatus | 45-0211 | |
| Platinum Tweezer-trode | Harvard Apparatus | 45-0486 | |
| DMEM-F12 media | ThermoFisher Scientific | 11320-033 | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific | 10437028 | |
| Trypsin | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich, Inc. | 792632 | |
| Lacrilube | Fisher Scientific | 19090646 | |
| Buprenorphine | Fisher Scientific | NC1292810 | |
| D-luciferrin | Perkin Elmer | 122799 | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | 124262 | |
| Mouse strain C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 000664/Black 6 | |
| Cell line (KPC-Luc 4580) | J.J. Yeh Lab at University of North Carolina | ||
| BD Precisionglide syringe needles | Sigma-Aldrich, Inc. | Z192406 | |
| Alcohol Swab(70% isopropyl alcohol ) | BD | 326895 | |
| Digital calipers | ThermoFisher Scientific | 14-648-17 | |
| Disposable Scalpels, Sterile | VWR | 21909 | |
| Cotton Tipped Applicators | VWR | 89198 | |
| Suture Needle, 45 cm, Size 6-0 | Harvard Apparatus | 72-3308 | |
| Suture Needle, 45 cm, Size 4-0 | Harvard Apparatus | 72-3314 | |
| Povidone-iodine 10% | BD | 29900-404 | |
| Disposable Warming Pad | KENT SCIENTIFIC CORP. | TP-3E | |
| Mouse Hair Clipper | KENT SCIENTIFIC CORP. | CL8787 | |
| Surgical Drape | Harvard Apparatus | 59-7421 | |
| Phosphate-buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 10010023 |
References
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