Summary
אלקטרופורציה בלתי הפיך (חמתו) היא טכניקה-thermal אבלציה המשמשת לטיפול של סרטן לבלב מקומי מתקדם. להיות טכניקה חדשה יחסית, ההשפעות של חמתו על הגידול הם הבינו כהלכה. פיתחנו מודל העכבר syngeneic המאפשרת לימוד השפעת חמתו על סרטן הלבלב.
Abstract
סרטן הלבלב (PC), מחלה אשר הורג כ 40,000 חולים כל שנה בארצות הברית, הוא התחמק בהצלחה מספר גישות טיפוליות כולל את האסטרטגיות immunotherapeutic מבטיח. אלקטרופורציה בלתי הפיך (חמתו) היא טכניקה-thermal אבלציה שגורם מוות של תאים סרטניים ללא הרס של מבנים סמוכים סילוק, ובכך מאפשר את ההליך שיבוצע בגידולים קרוב מאוד אל כלי הדם. בניגוד בטכניקות אבלציה תרמי, חמתו גורמת מוות של תאים אפופטוטיים להיפגע הדרגתית, יחד עם נמק אבלציה מיידית המושרה, נמצא כעת בשימוש קליני למטופלים שנבחרו עם מחשב מקומי מתקדם. פולשני, ללא-יעד הליך מסוים כמו חמתו יכול לגרום מספר עצום של תגובות ב microenvironment הגידול. מעט מחקרים עסקו השפעת חמתו על הגידול בסוגי סרטן אחרים, אבל אף אחד לא התמקדו PC. פיתחנו מודל syngeneic עכבר של מחשב תת עורית (SQ), orthotopic גידולים יכולים להיות מטופלים בהצלחה עם חמתו באווירה מבוקרת מאוד, להקל על הליך פוסט האורך מחקרים שונים. מודל זה בעל חיים משמש מערכת איתנה כדי לבחון את השפעות חמתו, דרכים לשפר את היעילות הקלינית של חמתו.
Introduction
אדנוקרצינומה ductal הלבלב (PC) צפוי להיות הגורם המוביל השני של מקרי מוות מסרטן בארה ב סביב 20201. הרוב המכריע של חולים שאובחנו עם המחשב ימותו בסופו של דבר בשל מחלה גרורתית מרוחקת2. Microenvironment PC הוא לשמצה לדיכוי המערכת החיסונית ואת chemoresistant. משתית desmoplastic שלה מכיל את המחסור בתאי T אפקטור (אנטי הגידול) חשיבותו של לויקוציטים לדיכוי המערכת החיסונית, כולל סרטניים הקשורים מקרופאגים (תאמי), משתיק קול נגזר מיאלואידית תאים (MDSCs) ו- T רגולטורי תאים (Tregs)3 . אלה מושתתות את הצורך לפתח אסטרטגיות עם מודאלים מרובים לנטרל השפעות אלו של microenvironment.
חמתו פותחה כשיטה הלא-thermal סרטן אבלציה. בניגוד בטכניקות אבלציה תרמי, חמתו אינו גורם לנמק coagulative מהירה אבל במקום תוצאות אפופטוטיים להיפגע הדרגתית לתא המוות4. חשוב עבור גידולים בלבלב, חמתו, אינה חשופה להשפעות "מפזר החום", ניתן לבצע ליד כלי הדם5. כיום משמש קלינית, למטופלים שנבחרו עם מקומי מתקדם או גבולית resectable סרטן הלבלב, ויש 510(k) לאישור ה-FDA6 טכנולוגיה זו. בסדרת הגדול ביותר שפורסם חמתו עבור PC7, חציון ההישרדות של חולים שעברו חמתו היה בערך כפול ההישרדות של חולים שטופלו מודרני כימותרפיה לבד ללא כריתה8,9.
מספר מחקרים הראו שאבלציה תרמית זה גורם לתגובה החיסונית מערכתית בסוגים אחרים הגידול (שבתוך צ'ו. et al. 10)-Radiofrequency אבלציה (RFA) בגידול בעלי חיים מודלים הפניות לתא T מוגברת מחלחל11,12, כולל גידול תאים הרוצח מופעל הטבעיים (NK) hepatocellular סרטן המטופלים13, בת 14. ירידה Tregs לדיכוי המערכת החיסונית חולי סרטן ריאות15. מספר קטן יותר של מחקרים בחנו מערכת החיסון, microenvironmental, ותגובות פציעה חמתו16. חמתו הוכח לעורר תגובה חיסונית מערכתית במודלים של העכבר immunocompetent שבו הצמיחה של תאי הכליה (contralateral) משני allografts הייתה מצומצמת או למניעה על ידי חמתו של גידול ראשוני שבועיים לפני17. הם גם ציין כי עכברים immunocompetent נדרש פחות מתח עבור רגרסיה מלאה מאשר עכברים immunocompromised. זה היה שיערו כי חמתו עלולה לגרום במצגת אנטיגן משופרת לעומת לנמק coagulative של אבלציה תרמית, אבל זה לא נחקרה באופן ספציפי.
פיתחנו מודל syngeneic העכבר של המחשב האישי משורת תא 4580 KPC-לוק (מתנה ג'יי ג'יי Yeh ב אוניברסיטת צפון קרוליינה), אשר נבעה גידול שהתפתח במהלך LSL-קראס זכרG12D / +; LSL-Trp53R172H / +; PDX1Cre / +; LSL-ROSA26 לוק / + העכבר, לחקור את ההשפעות המקומי ומערכתית של חמתו18,19. זו שורת התאים לבטא לוציפראז הוא immunogenic גם tumorigenic בעכברים C57BL/6 immunocompetent כאשר מוזרק קמ ר או orthotopically ומייצרת באופן אמין גרורות בכבד כאשר הוא מוזרק הטחול. אנחנו נעזרו גנרטור הדופק ניתן לתיכנות גל מרובע כדי לספק 100-µs פולסים של חשמל ביחס מתח/מרחק של 1,500 V/ס מ באמצעות בדיקה מערך שני-מחט (מופרדות על ידי 5 מ מ) או פלטינה פינצטה-trodes קמ ר או orthotopic גידולים, בהתאמה, ב עכברים לדגמן את ההשפעות של חמתו של חיים קטן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ניסויים בבעלי חיים כל לבצע הפעולות הבאות שפרוטוקול זה תאושר על ידי בהתאמה אכפת לי חיה מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC). כל ההליכים המתוארים כאן אושרו על ידי IACUC UCSD.
1. רכישת חיות הנמען
הערה: שורת התאים 4580 KPC-לוק הוקמה מגידול וביצועו LSL-קראסG12D / +; LSL-Trp53R172H / +; PDX1Cre / +; LSL-ROSA26 לוק / + העכבר (KPC), אשר הוא מודל הנדסה גנטית של PC על רקע C57BL/6. היתרון של הקו הסלולרי הוא והוא צורונים מבטא לוציפראז-הפעלת פיקוח על הגידול במודלים orthotopic. עם זאת, שורות תאים אחרים עשוי לשמש גם כל עוד הם תואמים הרקע הגנטי של העכברים הנמען.
- לקבוע מראש את קבוצות הניסוי ואת המספר של בעלי חיים לכל קבוצה.
- בחר את הגיל (6 - 10 - בן שבועיים עכברים מומלץ) ומשמשת מין החיות בשימוש על פי ההשערה לבין הקו הסלולרי.
2. התרבות תאים
- שימוש Dulbecco המתואמת של הנשר בינוני (DMEM): תערובת מזין F12 מדיה (50: 50) המכיל 10% סרום שור עוברית (FBS) ו 1% סטרפטומיצין פניצילין אנטיביוטיקה (צמיחה מלאה מדיה) כדי לגדל תאים 4580 KPC-לוק.
- אם קפוא, להפשיר את התאים 4 ימים לפני ההשתלה הגידול.
- לגדל את התאים ב 37 ° C עם 5% CO לחות2 ו- 95% בתנאים אספטי.
- Trypsinize התאים עם 0.25% טריפסין למשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס לפני שהם מגיעים > 80% confluency ולנטרל את טריפסין על-ידי הוספת פעמיים את עוצמת הקול של צמיחה מלאה מדיה.
הערה: תאים אלה אינם קובעים גידולים ביעילות בעכברים אם הם משמשים ב- 100% confluency או אם הם נמצאים passaged עבור יותר מ-12 שעות. לפיכך, מומלץ להקפיא את התאים על המעברים קודמות confluency אופטימלית. - לספור את התאים באמצעות hemocytometer והמשך הגידול אינדוקציה אם נאותה מספרים קיימים (0.5 - 1 x 106 תאים/עכבר...). אם לא, הרחב את התאים עבור קטע נוסף עד מספרי הטלפון הנייד נאותה מתקבלים.
3. אינדוקציה של גידולים קמ ר
- להכין את החומרים הדרושים: P1000 P100 פיפטות וטיפים, מזרק 1-mL, 25 גרם ומחטים, קרום המרתף מטריקס (BMM), DMEM מדיה הבזליים, 1.5-mL צנטריפוגה צינורות. לשמור כל חומר סטרילי וקר (4 ° C) עד הסוף של ההליך. גם על קוצץ שיער, מטליות אלכוהול מוכנים לשימוש בבעלי חיים.
- Trypsinize (לפי שלב 2.4) לספור את התאים ו resuspend אותם על ריכוז של 2-4 x 107 תאים למ"ל של DMEM קר.
- הוסף אמצעי שווה של 100% BMM כדי להפוך השעיה התא האחרון ב- 50% BMM. עוצמת הקול הסופי צריך סכום 50 µL של התא השעיה על העכבר בכל הנדרש. הכינו 10% עודף כדי להכיל את שטח מת במזרק ועל שגיאות pipetting.
- להציב המתלים כרכים µL 550 מ ל 1.5 צנטריפוגה צינורות aliquot בקרח.
- לרסן את החיות (עכברים C57BL/6 זכר 6 - בן שבועיים) באמצעות restrainer או באופן ידני.
הערה: לחלופין, עכברים יכול להיות מרדימים עם 2.5% איזופלוריין גז חמצן בספיקה של 2 ל'/דקה באמצעות מכשיר אידוי של דיוק. - לגלח את האתר של הזרקה, אשר הוא עדיף על חיילינו מעל רגל, משתמש בטלוויזיה. בעזרת ספוגית אלכוהול, ניקוי האתר של הזרקת פעמיים.
- לצייר µL 250 תאים השעיה-ריכוז סופי של 1-2 x 107 תאים/מ ל מזרק קר 1-mL ולהסיר כל בועות אוויר על-ידי הזזת את הבוכנה למעלה ולמטה. מחט 25 גרם לצרף המזרק, הקפד למלא את החלל בתוך המחט.
- הכנס היטב את המחט מתחת לעור בזווית של 30 מעלות לגוף ליד לאגפים, מוודא שהמחט פירס לא חלל הצפק או את מערכת השרירים של הגפיים.
- לרדד את המחט מקבילה לגוף, ולשטח קמטים על העור. לאט לאט להחדיר 50 µL תא השעיה. . תחזיקי את המחט באתר של הזרקת 10 s כדי לאפשר את BMM לגבש כדי למנוע דליפה כלשהי.
- לסגת לאט את המחט שומרים. על זה מקביל ללא כל תנועה הצידה. בעדינות לנקות את האתר של הזרקת עם ספוגית אלכוהול ולשחרר את העכבר לדיור שלה.
הערה: אם העכבר היה מרדימים במהלך ההליך, לפקח על החיה עד זה חוזר רפלקסים שקמה בעצמה אחרי שמפילים שלה. - נטר את צמיחת הגידול באופן קבוע באמצעות מחוגה עד שהוא מגיע 5 מ מ קוטר.
4. אינדוקציה של גידולים Orthotopic
- להכין את החומרים הדרושים. אוטוקלב כלי כירורגי כמו מספריים, אזמלים, המחט נהגים, והצביע ומלקחיים שקצהו שטוח. שמור בהישג יד התפרים סטרילי (שנספג 6-0 ולא נספגים 4-0), מטליות אלכוהול, קוצץ שיער, קרם depilatory, העין סיכה, גאזה כותנה, 10% povidone יוד פתרון, וילונות כירורגי, כריות חימום, הבופרנורפין ו סוכנים הרדמה.
- המתת חסד עכבר התורם (רצוי של רקע אותו נדרש עבור דגם orthotopic) נושא גידול SQ KPC באמצעות תא מילוי איטי CO2 . לסלק את הגידול SQ בקפידה בתנאים סטריליים בשכונה BSL-2 באמצעות מלקחיים סטרילי ולא microscissors זמן קצר לפני orthotopic-השרשה. במהלך הגידול כריתה לטפל לא כדי לנקב חלל הצפק. ולשטוף את הגידול באופן מיידי עם 2 חילופי PBS סטרילי.
- באמצעות ואזמלי מנתחים סטרילי, מינצ הגידול נכרת לחתיכות3 1 מ מ למקם אותם על צלחת פטרי המכילות קר סטרילי DMEM מדיה הבזליים, לאחסן בקירור עד ההשרשה.
- לנהל את העכבר הנמען 0.05 - 1 מ"ג/ק"ג. הבופרנורפין כאבים גואנגצ'אנג, 30 דקות לפני הניתוח.
- עזים ומתנגד עכברים הנמען עם 2-3% איזופלוריין חמצן (2 ל'/דקה) באמצעות מכשיר אידוי של דיוק (או סוכנים אחרים הרדמה). תמשיך עכברים 37 ° C חימום pad עבור מכלול של ההליך. חומר סיכה חלות על העיניים כדי למנוע לייבוש. מבחן עומק הרדמה על ידי חוסר המזעזעות רפלקס בתחילה, ואשר המטוס כירורגית בהרדמה היעדרה של רפלקס פדלים קמצוץ הבוהן עדין. לשמור את ההרדמה במהלך כל תהליך כירורגי.
- הנח את העכבר על גבו, בעדינות להפוך את זה על הצד השמאלי שלו, כך נחשף בצד שמאל של הבטן. להסיר את שיער בטן של העכבר באמצעות קרם depilatory ולנקות עם גזה כדי להבטיח שאין שיער חינם מזין את החתך פוסט של הבטן. להכין את הבטן השמאלית ניתוח באמצעות 3 מחזורים של 10% povidone יוד ואחריו מגבונים אלכוהוליים לחטא את העור.
- באמצעות אזמל סטרילי, לבצע חתך רוחבי או עקיפה 1.5 ס מ של העור, 1 ס"מ משמאל האמצע, מתחת בית החזה, המדיאלי מעט את הטחול. לאחר מכן, להרחיב את החתך דרך מערכת השרירים בבטן, שיקוף החתך שטחית שמעליה.
- לאתר הטחול משתמש שטוח משופעת מלקחיים, בעדינות להחצין את זה של חלל הבטן. . משכי הטחול באמצעות של המוליך כותנה סטרילי, למצוא בזנב הלבלב מצורף בתחתית של הטחול.
- בעזרת מלקחיים שקצהו שטוח, תמשוך בזנב הלבלב רוחבית.
- לאסוף פיסת גידול טחון דק אחד מן העכבר התורם עם קצה מחט סטרילית פיין (6-0) הפתולוגיים ומקם אותה בעזרת המלקחיים סטרילי.
- בעוד בעדינות היציבה בגוף/הזנב הלבלב רוחבית, הכנס את המחט של התפר המכיל מקטע הגידול לזנב של הלבלב. עוברים את התפר באיטיות דרך הרקמות, מחזיק את הגידול בקשר עם זנב הלבלב. להחיל אחד או שני תפרים נוספים בהתאם התמצאות החלקיק ביחס הרקמה.
- הסר את המחט לחלוטין מן הרקמה ולשמור את הלבלב/טחול המוחצנים של 60 נוספים s תוך פיקוח עבור סימנים של דימום או דליפה. לאחר מכן, להפנים אותם בעדינות לתוך חלל הבטן בעזרת מלקחיים בוטה.
- לסגור מערכת השרירים בבטן באמצעות גם בתפר שנספג 6-0 תפר רציף או מופרע וסגור צמוד העור באמצעות 3-0 עד 6-0 קטעה תפרים נספגים. להפסיק את ההרדמה בשלב זה.
- לאפשר את העכבר כדי לשחזר בכלוב בבית שלה עם גישה חופשית מזון ומים. מניחים את הכלוב על כרית החימום כדי להקל על שחזור. לפקח על סימנים חיוניים כגון נשימה, זלוף וכו ', במהלך תהליך ההחלמה.
- לאשר את סימני בטעותו רפלקס ברגע משחזרת את העכבר, ויכול אז החזרה לכלוב לדיור קבוע.
- לנהל הבופרנורפין 0.05 - 0.1 מ"ג/ק"ג 8-12 שעות לאחר הניתוח, ו- h כל 8-12 לאחר ההליך כנדרש סימנים של כאב.
- לפקח על הגידול באמצעות ביולומינסנציה של ויוו מערכת הדמיה (ראה את הטבלה של חומרים).
- בעקבות הגידול על ידי הדמיה מתחיל ביום 4 לאחר orthotopic-השרשה, ולבצע הדמיה פעמיים בשבוע.
- ביום הדמיה, לנהל (הזרקת בקרום הבטן) 30 מ"ג/ק"ג של D-luciferin כדי anesthetized העכבר הנמען (2-3% איזופלוריין חמצן (2 ל'/דקה)) 10 דקות לפני הדמיה.
- תמונת לפעילות לוציפראז באמצעות הגדרת הפריה חוץ גופית ללא מסננים כלשהם פליטה למשך תקופה מינימלית של חשיפה של 5 ב imager הפריה חוץ גופית עם הבמה מחוממת חינם אוטומטי-זריחה, תוך שמירה על ההרדמה על העכברים.
5. חמתו של גידולים קמ ר
- להכין את החומרים הדרושים: כיכר electroporator גל, מפסק רגל בטיחות, אלקטרודות (מערך המחט לעומת פינצטה-מפעילה), מתאמים. לשמור על התפרים סטרילי (המוזרק 4-0), מטליות אלכוהול, קוצץ שיער, קרם depilatory, חומר סיכה העין, גאזה כותנה, הבופרנורפין ו הרדמה גם בקרבת מקום.
- לחטא את פינצטה או מחט מערך אלקטרודות באמצעות גז עיקור. Autoclaving אינו מומלץ. השתמש מעקר חרוז זכוכית כדי לעקר את האלקטרודות בין בעלי חיים.
- לנהל הבופרנורפין 0.05 - 0.1 מ"ג/ק"ג כדי העכברים נושאות 30 דקות לפני ההליך.
- בצע את שלבים 4.4-4.5 לזירוז בהצלחה הרדמה בעכברים, ברגע השתל הגידול SQ מגיע בקוטר 5 מ מ.
- הנח את העכבר anesthetized על הצד כדי לגשת הגידול SQ לאגף. להסיר את השיער בעזרת קוצץ ועור נקי בעזרת ספוגית אלכוהול.
- לשימוש גידולים מ ר, שני מחטים מערך אלקטרודות. לרומם את העור ישירות תחת אתר גידול באמצעות מלקחיים והכנס האלקטרודות דרך העור מקבילה לגוף מוודא שהם לא לחדור חלל הצפק. פעם אחת דרך העור, מיקום האלקטרודות באופן כזה שהם סוגר את הגידול.
- לתכנת את electroporator כדי לספק 100 µs פולסים בתדר של 1 הרץ על 1,500 V ס עבור סכום כולל של 150 פולסים. לספק את פולסים באמצעות דוושת רגל. להפריד כל ערכה של פולסים 10 על-ידי 10 s, על מנת לאפשר פיזור חום, לאשר את המיקום הנכון של האלקטרודות.
הערה: ללא שימוש סוכני משתק, עכברים יחוו התכווצות שרירים עם חמתו שיכולים לגרום תזוזה של האלקטרודות. אלא אם כן מאובטח באופן ידני. - הסר את האלקטרודות לאחר מינון מלא, אשר לא יעלה על הרשומה ס' 200 המתח בפועל תימסר, אשר מוצג על electroporator. לאפשר העכברים להתאושש בעקבות חמתו לפי השלבים 4.14-4.16.
6. חמתו של גידולים Orthotopic
הערה: חמתו של גידולים orthotopic כרוך ניתוח הישרדות נוסף על העכבר אותו וכך מצריכים אישור מיוחד IACUC המקומית לפני תחילת.
- להכין חומרים הדרושים: אוטוקלב כלים כירורגיים כמו מספריים, כמו מה, אזמל, המחט נהגים, הצביע מלקחיים, והודיע במול מלקחיים. זכור בקרבת מקום גם כן: תפרים סטרילי (שנספג 6-0 ולא נספגים 4-0), מטליות אלכוהול, קוצץ שיער, קרם depilatory, חומר סיכה העין, גאזה כותנה, 10% povidone יוד הפתרון, וילונות כירורגי, כריות חימום, גל מרובע electroporator, מפסק רגל בטיחות, אלקטרודות שלהם מתאמים, הבופרנורפין ו הרדמה.
- להעריך את העכברים עבור orthotopic הגידול על ידי הדמיה ויוו (ראה שלב 4.17) על ידי הזרקת 30 מ"ג/ק"ג של D-Luciferin intraperitoneally.
הערה: הגידולים orthotopic הינם אידיאליים עבור חמתו הטיפול 8-10 ימים שלאחר ההשתלה כאשר הגידולים הם בבירור, עדיין סגורים על הלבלב כפי שניתן לראות בתמונות הפריה חוץ גופית לוציפראז (ראה את התוצאות נציג). - בצע שלבים 4.4-4.9, כדי לאתר את הגידול מושתל. אם הגידול לא קל לאתר, להשתמש מלקחיים לרודולף בוטה כדי להזיז את הקיבה והטחול בעדינות כדי לזהות את הגידול.
- להחצין את הגידול עם מלקחיים לרודולף בוטה וללכוד את הגידול בחוזקה אלקטרודות הפלטינה של פינצטה-מפעילה. לספק את פולסים אלקטרופורציה כפי מתוכנת בשלב 5.7 באמצעות electroporator את גל מרובע בסדרות של 10 פולסים נשלט על-ידי המתג רגל.
- שמור את הגידול מוחצן s 60 לפחות פוסט חמתו לעקוב אחר סימנים של דימום. הוסף את הגידול בחזרה לתוך חלל הבטן סגירת החתך שתואר קודם (צעדים 4.13-4.16), לפקח על העכבר עד זה יחלים.
- נטר את ההשפעות של חמתו על הגידול באמצעות ויוו לוציפראז הדמיה לפי שלב 4.17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
עקבנו אחר ההליך המתואר לעיל, ועורר גידולים SQ בשבוע 5-6 זקן פראי סוג C57BL/6 עכברים מחוסן עם עונה 1 פרק 106 תאים עם 50% BMM. כאשר גודל הגידול 5-6 מ מ קוטר, כמה מן העכברים היו מורדמים, גידולים שלהם היו טוחנות, מושתל orthotopically בעכברים C57BL/6 הנמען. חמתו היה שבוצעו 10 ימים שלאחר ההשתלה, כפי שמוצג על ציר הזמן על איור 1. חמתו בוצעה על העכברים הנותרים הנושאת גידולים SQ.
ב ר גידולים, חמתו של מתח חשמלי הדופק המשך הוחזקו קבוע ב- 1,500 V/ס מ ו 100 µs, בהתאמה, אך מספר פולסים מגוונות. איור 2 מציג את הגידולים SQ בעכברים כמה נסוג לחלוטין לאחר 150 פעימות חמתו אך לא טוב עם פולסים 75. בסך הכל, 4 מתוך 9 עכברים הראה רגרסיה הגידול מלאה לאחר 150 פעימות של חמתו. ניתוח היסטולוגית של גידול רקמות 1 שבוע פוסט חמתו הראה גדול אזורים של נמק במרכז הגידול לא נראו לשלוט גידולים שלא טופלו. הגרעין נמק היה ולצדו רקמת הגידול חיים במקרים של רגרסיה הגידול לא שלם (איור 3). השתלה מוצלחת של orthotopic הגידול הושג גם, קצב הגידול היה פיקוח באמצעות ויוו הדמיה ביולומינסנציה מראה גידול בכל יום 10 וביום 15 (איור 4) לאחר ההשתלה. חמתו על פולסים 150 הוכיח גם יעילים orthotopic גידולים (איור 5) מציג מופחתת הגידול כרכים. באופן כללי, תוצאות אלו ממחישות את היכולת של הדגם הזה כדי לדמות את ההשפעה של חמתו במודל עכבר immunocompetent, ובכך מספק פלטפורמה כדי לבדוק תנאים חמתו ושילובים שונים לטיפול PC.
איור 1 : מראה הסמלית הזמן קורס של הגידול השרשה, IRE. עבור גידולים SQ, חמתו מבוצעת ברגע הגידול מגיע ל- 5-6 מ מ קוטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : הדמיה לוציפראז-ביולומינסנציה מראה ירידה בפוסט צמיחה חמתו של גידול במודל קמ ר. שורת התאים KPC-לוק מבטא צורונים לוציפראז הפיכתה ריאלי כדי לפקח על הגידול בתגובה חמתו בזמן אמת. יום 14 ביולומינסנציה הדמיה פוסט שחמתו מציג אחד מהעכברים בנסיגה מלאה של הגידול מטופלים עם 150 רעמי חמתו, ואילו רגרסיה לא שלם נראתה עם 75 רעמי חמתו בהשוואה הפקד אינו מטופל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : Hematoxylin ואאוזין צביעה של רקמת הגידול מראה השינויים לגבי מבנה רקמות פוסט IRE. גידולים SQ נחשפים חמתו הראה אזורים גדולים של נמק מרכזי, המוקף אזורים של רקמה חיה המציין לקוי חמתו כיסוי במקרים מסוימים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : הדמיה ביולומינסנציה מראה השתלה מוצלחת של orthotopic הגידול והצמיחה שלו לאורך זמן. התמונות צולמו באמצעות ביולומינסנציה מסחרי של הדמיה מכשיר עם הפריה חוץ גופית שנתפסו חשיפה 1 דקות. העכברים הוזרקו 30 מ"ג/ק"ג של D-luciferin פתרון intraperitoneally 10 דקות לפני הדמיה. עכברים הוחזקו מרדימים באמצעות 2% איזופלוריין במהלך ההליך. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 : חמתו גורם הגידול הפחתת צמיחת גידולים orthotopic PC- Bioluminescecnce (א) תמונות של עכברים מחסה orthotopic PC הראה אות לוציפראז מופחתת 7 ימים שלאחר חמתו לעומת שאם הניתוח רומז מופחתת נטל הגידול בשידור חי כתוצאה חמתו. (B) כלומר נפח נכרת orthotopic גידולים (+ שגיאה סטנדרטית) בעכברים שליטה לעומת עכברים שעברו חמתו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במחקר זה, הראו מודל immunocompetent עכבר למחשב זה יכול לשמש כדי לחקור את ההשפעות של חמתו על הגידול. כיום, חמתו משמש כמו טכניקה-thermal אבלציה רק בחולים שנבחרו מאוד מקומי מתקדם PC אין התקדמות המחלה מרוחק לאחר חודשים של טיפול לפני הניתוח. השימוש ולכן הוגבלה כי רוב החולים עם מחשב מקומי מתקדם לפתח מחלה גרורתית מרוחקת20. מודל זה ישמש כבסיס ללימודי להעריך את ההשפעות של חמתו על PC באמצעות טיפול מורחבת פרמטרים ושילובים שונים.
הדבר הכי חשוב שיש לקחת בחשבון במהלך הפרוטוקול הוא הגודל של הגידול שבו מתבצע חמתו. הגששים זמינים מסחרית עבור מודלים של עכברים מוגבלים על ידי אלקטרודה מרחק (5-10 מ מ). לפיכך, בגידולים גדולים משמעותית מאשר המרחק אלקטרודה, אבלציה לא שלם מתקיים. גידולים SQ, מומלץ השימוש של שני מחטים מערך אלקטרודות על פינצטה-trodes כמו העור שמסביב הגידול מגבירה את ההתנגדות לזרימה של הנוכחית בפינצטה-trodes. המגבלה בגודל של שני מחטים מערך האלקטרודות ניתן להתגבר על ידי ביצוע את חמתו על המעמקים וזוויות שונות בגידול אותו; עם זאת, גישה זו מקשה לטיפול בגידולים בצורה אחידה. לחלופין, עבור גידולים גדולים יותר (עד 10 מ מ), חתך יכול להתבצע על העור מתחת הגידול כדי אורך מעט יותר מאשר הקוטר הגידול. הגידול יכול אז להיות externalized דרך החתך על-ידי היפוך צמוד העור באמצעות מלקחיים. הגידול ואז יכולים להיות מטופלים עם פינצטה-trodes, הדומה הגידולים orthotopic שתוארו לעיל. הגידול electroporated יכול מכן להכניס מחדש תחת העור, העור sutured 4-0 בתפר נספגים כמו תפר קטוע. עם זאת, ההשפעות של החתך עשויים לבלבל את ההשפעות של חמתו, מצאנו את ביצוע חמתו כאשר הגידולים הם במרחק קצר לעבוד האלקטרודות מערך שני-מחט (~ 5-6 מ"מ) מספק את התקינה הטוב ביותר.
ללא קשר הגישה, מספר פולסים צריך להיקבע מדעית בהתאם לסוג הגידול. מחקרים שפורסמו מסויימת בין 150-300 פולסים בגיל הזה מתח17. עם זאת, אנחנו נקבע המספר האופטימלי של פולסים בניסוי ראשוני מנה-תגובה. ישנם דגמים לחזות את האזור של אבלציה מלאה המבוססת על מרחק אלקטרודה של מתח חשמלי, אך סוגי גידולים יכולים להשתנות במידה רבה vascularity, פיברוזיס, העשויים להשפיע על התגובה אלקטרופורציה21.
כל קבוצה של 10 פולסים הופרד על ידי 10 s על מנת למנוע את ההשפעות חימום להתרחש אם רבים מדי פולסים מועברות מהר מדי. טיפול יתר עלולה לגרום אבלציה תרמי, אשר עשוי למנוע אפיון מדויק של ההשפעות של הלא-thermal חמתו. המרווח s 10 גם מאפשר לנו לאשר לעתים קרובות אלקטרודה מיקום מדויק מאז התכווצות שרירים עלולה לגרום אלקטרודה העקירה. IACUC שלנו יש עדיין אסור השימוש של סוכנים משתק חיות קטנות, אשר יכול לצמצם במידה ניכרת התכווצות שרירים במהלך חמתו. במקרה של גידולים orthotopic, פינצטה-trodes מאפשר לנו להחזיק הגידולים בחוזקה ויש אלקטרודה פני שטח גדול יותר בהשוואה האלקטרודה המחט.
למרות חמתו הוא כעת רק משמש הליך פולשני בהגדרה קלינית, אלקטרופורציה באופן כללי יש קשת רחבה של יישומים ועד הפעלות עצבים ושרירים משלוחים של סמים שונים oligonucleotides. על ידי בקפידה ניתוח השינויים הקשורים pathophysiological המתרחשים במהלך ואחרי חמתו שימוש במודל זה, אפשרי לפתח אסטרטגיות טיפוליות אינספור עבור PC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים יש אין גילויים הכספיים הרלוונטיים.
Acknowledgments
RRW קיבל תמיכה עבור זה לעבוד במענק מחקר שיתופי Translational ממומן על ידי דוושת סן דייגו פאדרס C3 סיבה (#PTC2017).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ECM 830 square wave electroporator | Harvard Apparatus | BTX # 45-0002 ( 58018-004 ) | |
| 2 needle array electrode | Harvard Apparatus | 45-0167 | |
| Safety foot switch | Harvard Apparatus | 45-0211 | |
| Platinum Tweezer-trode | Harvard Apparatus | 45-0486 | |
| DMEM-F12 media | ThermoFisher Scientific | 11320-033 | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific | 10437028 | |
| Trypsin | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich, Inc. | 792632 | |
| Lacrilube | Fisher Scientific | 19090646 | |
| Buprenorphine | Fisher Scientific | NC1292810 | |
| D-luciferrin | Perkin Elmer | 122799 | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | 124262 | |
| Mouse strain C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 000664/Black 6 | |
| Cell line (KPC-Luc 4580) | J.J. Yeh Lab at University of North Carolina | ||
| BD Precisionglide syringe needles | Sigma-Aldrich, Inc. | Z192406 | |
| Alcohol Swab(70% isopropyl alcohol ) | BD | 326895 | |
| Digital calipers | ThermoFisher Scientific | 14-648-17 | |
| Disposable Scalpels, Sterile | VWR | 21909 | |
| Cotton Tipped Applicators | VWR | 89198 | |
| Suture Needle, 45 cm, Size 6-0 | Harvard Apparatus | 72-3308 | |
| Suture Needle, 45 cm, Size 4-0 | Harvard Apparatus | 72-3314 | |
| Povidone-iodine 10% | BD | 29900-404 | |
| Disposable Warming Pad | KENT SCIENTIFIC CORP. | TP-3E | |
| Mouse Hair Clipper | KENT SCIENTIFIC CORP. | CL8787 | |
| Surgical Drape | Harvard Apparatus | 59-7421 | |
| Phosphate-buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 10010023 |
References
- Rahib, L., et al. Projecting cancer incidence and deaths to 2030: the unexpected burden of thyroid, liver, and pancreas cancers in the United States. Cancer Res. 74 (11), 2913-2921 (2014).
- Howlader, N., et al. SEER Cancer Statistic Review, 1975-2013. , http://seer.cancer.gov/csr/1975_2013/ (1975).
- Clark, C. E., et al. Dynamics of the immune reaction to pancreatic cancer from inception to invasion. Cancer Res. 67 (19), 9518-9527 (2007).
- Lee, E. W., Loh, C. T., Kee, S. T. Imaging guided percutaneous irreversible electroporation: ultrasound and immunohistological correlation. Technol Cancer Res Treat. 6 (4), 287-294 (2007).
- Charpentier, K. P. Irreversible electroporation for the ablation of liver tumors: are we there yet? Arch Surg. 147 (11), 1053-1061 (2012).
- Narayanan, G. Irreversible Electroporation. Seminars in Interventional Radiology. 32 (4), 349-355 (2015).
- Martin, R. C. 2nd Treatment of 200 locally advanced (stage III) pancreatic adenocarcinoma patients with irreversible electroporation: safety and efficacy. Ann Surg. 262 (3), 486-494 (2015).
- Belfiore, M. P., et al. Percutaneous CT-guided irreversible electroporation followed by chemotherapy as a novel neoadjuvant protocol in locally advanced pancreatic cancer: Our preliminary experience. Int J Surg. 21 Suppl 1, S34-S39 (2015).
- Belfiore, G., et al. Concurrent chemotherapy alone versus irreversible electroporation followed by chemotherapy on survival in patients with locally advanced pancreatic cancer. Med Oncol. 34 (3), 38 (2017).
- Chu, K. F., Dupuy, D. E. Thermal ablation of tumours: biological mechanisms and advances in therapy. Nat Rev Cancer. 14 (3), 199-208 (2014).
- Wissniowski, T. T., et al. Activation of tumor-specific T lymphocytes by radio-frequency ablation of the VX2 hepatoma in rabbits. Cancer Res. 63 (19), 6496-6500 (2003).
- Eros de Bethlenfalva-Hora, C., et al. Radiofrequency ablation suppresses distant tumour growth in a novel rat model of multifocal hepatocellular carcinoma. Clin Sci (Lond). 126 (3), 243-252 (2014).
- Zerbini, A., et al. Radiofrequency thermal ablation for hepatocellular carcinoma stimulates autologous NK-cell response. Gastroenterology. 138 (5), 1931-1942 (2010).
- Ali, M. Y., et al. Activation of dendritic cells by local ablation of hepatocellular carcinoma. J Hepatol. 43 (5), 817-822 (2005).
- Fietta, A. M., et al. Systemic inflammatory response and downmodulation of peripheral CD25+Foxp3+ T-regulatory cells in patients undergoing radiofrequency thermal ablation for lung cancer. Hum Immunol. 70 (7), 477-486 (2009).
- Jiang, C., Davalos, R. V., Bischof, J. C. A review of basic to clinical studies of irreversible electroporation therapy. IEEE Trans Biomed Eng. 62 (1), 4-20 (2015).
- Neal, R. E. 2nd, et al. Improved local and systemic anti-tumor efficacy for irreversible electroporation in immunocompetent versus immunodeficient mice. PLoS One. 8 (5), e64559 (2013).
- Hingorani, S. R., et al. Trp53R172H and KrasG12D cooperate to promote chromosomal instability and widely metastatic pancreatic ductal adenocarcinoma in mice. Cancer Cell. 7 (5), 469-483 (2005).
- Safran, M., et al. Mouse reporter strain for noninvasive bioluminescent imaging of cells that have undergone Cre-mediated recombination. Mol Imaging. 2 (4), 297-302 (2003).
- Martin, R. C. 2nd, McFarland, K., Ellis, S., Velanovich, V. Irreversible electroporation in locally advanced pancreatic cancer: potential improved overall survival. Ann Surg Oncol. 20 Suppl 3, S443-S449 (2013).
- Neal, R. E., Garcia, P. A., Robertson, J. L., Davalos, R. V. Experimental Characterization and Numerical Modeling of Tissue Electrical Conductivity during Pulsed Electric Fields for Irreversible Electroporation Treatment Planning. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 59 (4), 1076-1085 (2012).
