Summary
Irreversibel elektroporation (IRE) är en icke-termisk ablationsteknik används för behandling av lokalt avancerad pankreascancer. Att vara en relativt ny teknik, är effekterna av IRE på tumörtillväxt dåligt känd. Vi har utvecklat en syngena musmodell som underlättar studera effekterna av IRE på pankreascancer.
Abstract
Pankreascancer (PC), en sjukdom som dödar cirka 40 000 patienter varje år i USA, har framgångsrikt undvikit flera behandlingsmetoder inklusive de lovande immunoterapeutisk strategierna. Irreversibel elektroporation (IRE) är en icke-termisk ablationsteknik som inducerar tumörcelldöd utan förstörelse av intilliggande kollagena strukturer, vilket gör att förfarandet som skall utföras i tumörer mycket nära blodkärl. Till skillnad från termiska ablation tekniker, IRE resulterar i gradvis apoptotisk celldöd, tillsammans med omedelbara ablation inducerad nekros, och är för närvarande i klinisk användning för utvalda patienter med lokalt avancerad PC. En ablativ, icke-målorganismer särskilt förfarande som IRE kan inducera en myriad av svaren i den tumör mikromiljö. Ett fåtal studier har tagit upp effekterna av IRE på tumörtillväxt i andra tumörtyper, men ingen har fokuserat på PC. Vi har utvecklat en syngena musmodell av PC där subkutan (SQ) och ortotop tumörer kan behandlas framgångsrikt med IRE i en mycket kontrollerad miljö, underlätta olika longitudinella studier efter proceduren. Denna djurmodell fungerar som ett robust system för att studera effekterna av IRE och sätt att förbättra den kliniska effekten av IRE.
Introduction
Pankreas duktal adenokarcinom (PC) väntas bli den näst vanligaste orsaken till dödsfall i cancer i USA runt 20201. Majoriteten av patienter som diagnostiserats med PC kommer att så småningom dö från avlägsna metastaserande sjukdom2. Den PC närmiljön är notoriskt immunsuppressiva och chemoresistant. Dess Desmoplastiskt stroma innehåller en brist på effektor (anti-tumör) T-celler och en framträdande av immunsuppressiva leukocyter, inklusive tumör-associerad makrofager (TAMs), myeloisk härledda suppressor celler (MDSCs) och regulatoriska T-celler (Tregs)3 . Dessa ligger bakom behovet av att utveckla multimodala strategier för att motverkar dessa effekter av mikromiljö.
IRE har utvecklats som en icke-termisk metod av tumör ablation. Till skillnad från termiska ablation tekniker, IRE orsaka inte snabba coagulative nekros men istället resulterar i gradvis apoptotiska cell död4. Huvudsakligen för Pankreastumör, IRE är inte sårbara ”kylfläns” effekter och kan utföras intill blodkärlen5. Denna teknik har 510(k) clearance från FDA6 och för närvarande används kliniskt, för utvalda patienter med lokalt avancerad eller borderline resektabel pankreascancer. I den största publicera serien av IRE för PC7var medianvärdet för överlevnad för patienter som genomgår IRE ungefär dubbel överlevnaden hos patienter som behandlats med moderna kemoterapi ensam utan resektion8,9.
Flera studier har visat att termisk ablation inducerar en systemisk immunsvar i andra tumörtyper (recenserade i Chu o.a. 10). radiofrekvent ablation (RFA) i djurens tumör modeller leder till ökad T cell infiltrerar11,12, inklusive en ökning i aktiverade naturliga mördarceller (NK) i Hepatocellulär cancer patienter13, 14, och en minskning av immunsuppressiva Tregs i lung cancer patienter15. Ett mycket mindre antal studier har undersökt immun, microenvironmental, och skada Svaren till IRE16. IRE har visat sig stimulera en systemisk immunsvar i immunkompetenta musmodeller där tillväxten av sekundära (kontralateral) renal cell organtransplantationer var minskas eller förhindras genom IRE av en primär tumör två veckor tidigare17. De påpekade också att immunkompetenta möss krävs mindre spänning för fullständig regression än gjorde immunsupprimerade möss. Det har varit hypotesen att IRE kan resultera i förbättrad antigen-presentation jämfört med den coagulative nekrosen av termiska ablation, men detta har inte specifikt studerats.
Vi har utvecklat en syngena musmodell av PC från KPC-Luc 4580 cell linje (gåva från J.J. Yeh vid University of North Carolina), som härrör från en tumör som utvecklats i en manlig LSL-KrasG12D / +; LSL-Trp53R172H / +; PDX1Cre / +; LSL-ROSA26 Luc / + mus, att studera lokala och systemiska effekter av IRE18,19. Detta luciferas-uttryckande cellinje är immunogena och också tumörframkallande hos immunkompetenta C57BL/6 möss när injiceras SQ eller orthotopically och pålitligt producerar levermetastaser när injiceras i mjälten. Vi har använt en programmerbar fyrkantsvåg pulsgenerator för att leverera 100-µs pulser av el i en spänning eller distans förhållande av 1 500 V/cm med en två-nål array sonden (avgränsade med 5 mm) eller platinum tweezer-derna till SQ eller ortotop tumörer, respektive i möss att modellera effekterna av IRE i ett litet djur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök utförs följande detta protokoll skall godkännas av respektive institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC). Alla förfaranden beskrivs här har godkänts av IACUC UCSD.
1. upphandla mottagarens djur
Obs: KPC-Luc 4580 cell linjen inrättades från en tumör som uppstår i en LSL-KrasG12D / +; LSL-Trp53R172H / +; PDX1Cre / +; LSL-ROSA26 Luc / + mus (KPC), som är en genetiskt modifierad modell av PC på C57BL/6 bakgrund. Fördelen med denna cell linje är att det konstitutivt uttrycker luciferas-aktivera tumör övervakning i ortotop modeller. Andra cellinjer kan dock också användas så länge de är kompatibla med den genetiska bakgrunden av mottagarens möss.
- Bestämma de experimentella grupperna och antalet djur per grupp i förväg.
- Välj ålder (6 - 10 - vecka gamla möss rekommenderas) och sex av de djur som används enligt hypotesen och cellinje används.
2. odla celler
- Användning Dulbecco ändrade eagle medium (DMEM): näringsämne blandning F12 (50: 50) media som innehåller 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin-streptomycin antibiotika (komplett tillväxt medier) för att växa KPC-Luc 4580 celler.
- Om de är frysta, Tina cellerna 4 dagar före tumör implantation.
- Odla cellerna vid 37 ° C med 5% CO2 och 95% luftfuktighet under aseptiska förhållanden.
- Trypsinize cellerna med 0,25% Trypsin för 5 min vid 37 ° C innan de når > 80% konfluens och neutralisera trypsin genom att lägga till två gånger volymen av komplett tillväxt medier.
Obs: Dessa celler kan inte upprätta tumörer effektivt hos möss om de används på 100% konfluens eller om de är anpassade för mer än 12 gånger. Därför är det tillrådligt att frysa cellerna på tidigare passager under optimala konfluens. - Räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer och fortsätt till tumör induktion om adekvat numrerar är närvarande (0,5 - 1 x 106 celler/mus). Om så inte är fallet, expandera cellerna för en mer passage tills adekvat cell nummer erhålls.
3. induktion av SQ tumörer
- Förbered det material som krävs: P1000 och P100 pipetter och tips, 1 mL spruta, 25G injektionsnålar, basalmembranet matris (BMM), DMEM basala media, 1,5 mL Centrifugera rören. Förvara allt material steril och kall (4 ° C) fram till slutet av förfarandet. Också hålla hårklippningsmaskiner och spritkompresser redo för användning av djur.
- Trypsinize (enligt steg 2,4) räkna cellerna och resuspendera dem vid en koncentration på 2-4 x 107 celler/mL kall DMEM.
- Tillsätt en motsvarande volym av 100% BMM göra en slutliga cellsuspension i 50% BMM. Den slutliga volymen bör uppgå till 50 µL cellsuspension för varje mus krävs. Förbereda 10% i överskott att rymma dödvolymen sprutan och för pipettering fel.
- Alikvotens suspensionen i 550 µL volymer i 1,5 mL centrifugrör placeras i isen.
- Hindra djuren (6 - vecka gamla manliga C57BL/6 möss) använder en fasthållning eller manuellt.
Obs: Alternativt till att det kan vara bedövat möss med 2,5% isofluran i syrgas med en flödeshastighet på 2 L/min med en precision spridare. - Raka injektionsstället, som helst på en flank ovan ett ben, använder en clipper. Använder en spritsudd, ren injektionsstället två gånger.
- Rita 250 µL cellsuspension med en slutlig koncentration på 1-2 x 107 celler/mL i en kall 1 mL-spruta och avlägsna eventuella luftbubblor genom att flytta kolven upp och ner. Fäst en 25G nål på sprutan och se till att fylla utrymmet inom nålen.
- Försiktigt in nålen under huden på en 30° vinkel mot kroppen nära flankerna, att se till att nålen inte punkteras i bukhålan eller muskulaturen i armar och ben.
- Plattar nålen parallellt med kroppen, och slätar ut rynkor på huden. Injicera långsamt 50 µL cellsuspension. Håll nålen på injektionsstället för 10 s att tillåta BMM stelna för att förhindra läckage.
- Dra sakta upp nålen att hålla det parallella utan någon sidledes rörelse. Varsamt rengör injektionsstället med en spritkompress och släpp musen för att dess bostäder.
Obs: Om musen var sövda under förfarandet, övervaka djuret tills det återfår sin rätande reflexer. - Övervaka tillväxten av tumören regelbundet använda bromsok tills den når 5 mm i diameter.
4. induktion av ortotop tumörer
- Förbered det material som krävs. Autoklav den kirurgiska verktyg såsom sax, skalpell, nål drivrutiner, och pekade och platt-tipped pincett. Hålla händig sterila suturer (absorberbara 6-0 och icke-absorberbara 4-0), spritkompresser, hårklippningsmaskiner, hårborttagningsprodukter grädde, öga smörjmedel, bomull gasväv, 10% povidon-jodlösning, kirurgiska draperier, värmedynor, buprenorfin och bedövningsmedel.
- Avliva en givare mus (helst av samma bakgrund krävs för ortotop modellen) bära en SQ KPC tumör med en långsam fyllning CO2 -kammare. Punktskatt SQ tumören noggrant under sterila förhållanden i en BSL-2 huva med steril pincett och microscissors strax före ortotop implantation. Under tumor excision ta hand inte att punktera bukhålan och tvätta tumören omedelbart med 2 utbyte av steril fosfatbuffrad Koksaltlösning.
- Använda sterila skalpeller, finhacka exciderad tumören i 1 mm3 bitar, placera dem på en petriskål som innehåller kall sterila DMEM basala media och lagra på is tills implantation.
- Administrera mottagare musen 0,05 - 1 mg/kg buprenorfin smärtstillande SQ, 30 min före operation.
- Söva mottagarens möss med 2-3% isofluran i syre (2 L/min) med en precision spridare (eller andra bedövningsmedel). Hålla möss på en 37 ° C värmedyna under hela förfarandet. Gäller smörjmedel för ögonen för att förhindra uttorkning. Testa djup anestesi av brist på häpnadsväckande reflex initialt och bekräfta kirurgiska planet anestesi av bristen på pedal reflex att en mild tå nypa. Upprätthålla anestesi under hela operationstiden.
- Placera musen på ryggen och vrid den försiktigt till höger så att den vänstra sidan av buken är utsatt. Ta bort den buk hår på musen använda hårborttagningsprodukter kräm och rengör med gasväv att säkerställa ingen gratis hår går in i buken efter snittet. Förbereda vänster buken för kirurgi med 3 cykler av 10% povidon jod följt av desinfektionsservetter för att desinficera huden.
- Med en steril skalpell, göra en 1,5 cm tvärskepps- eller sneda snitt i huden, 1 cm till vänster om mittlinjen, nedanför bröstkorgen, något mediala till mjälten. Sedan förlänga snittet genom buken muskulaturn, spegling överliggande ytliga snitt.
- Leta upp mjälten med platt tippas pincett och försiktigt externalize den från bukhålan. Återkalla mjälte med hjälp av en steril bomull applikator och hitta svansen i bukspottkörteln sitter på undersidan av mjälte.
- Använder platt-tipped pincett, dra in svansen i bukspottkörteln sidled.
- Plocka upp ett fint malet tumören bit från givare musen med en steril suturering nålspetsen för böter (6-0) och placera den med steril pincett.
- Medan försiktigt Upprullningskraften svans/kroppen av bukspottkörteln sidled, stick in nålen av suturen som innehåller tumören fragment i svansen i bukspottkörteln. Passera suturen långsamt genom vävnaden, hålla tumören i kontakt med bukspottskörteln svansen. Applicera en eller två ytterligare suturer beroende på Fragmentets orientering i förhållande till vävnaden.
- Ta bort nålen helt från vävnaden och hålla bukspottkörteln/mjälte externalized för en ytterligare 60 s medan inspektera avseende tecken på blödning eller läcka. Sedan, internalisera dem försiktigt i bukhålan med trubbig pincett.
- Stäng buk muskulaturn med en 6-0 resorberbar sutur med antingen kontinuerliga eller intermittenta söm, och överliggande huden med hjälp av en 3-0 till 6-0 icke-absorberbara avbrutna suturen. Avbryta anestesi på denna punkt.
- Låt musen för att återhämta sig i sitt hem bur med fri tillgång till mat och vatten. Placera buren på en värmedyna att underlätta återhämtning. Övervaka vitala funktioner såsom andning, perfusion etc., under återställningsprocessen.
- Bekräfta tecken på rätande reflex när musen återhämtar sig, och sedan återvända buren kan till ordinarie bostäder.
- Administrerar buprenorfin 0,05 - 0,1 mg/kg 8-12 h efter operationen och varje 8-12 h efter ingreppet som behövs för tecken på smärta.
- Övervaka tumörtillväxt med en in-vivo -Mareld imaging system (se Tabell för material).
- Följ tumörtillväxt av imaging börjar på dag 4 efter ortotop implantation och utföra imaging två gånger i veckan.
- På dagen för imaging, administrera (intraperitoneal injektion) 30 mg/kg D-luciferin till en sövda (2-3% isofluran i syre (2 L/min)) mottagarens mus 10 min före imaging.
- Bild för luciferas aktivitet med inställningen luminiscens utan några utsläpp filter för minst 5 s exponering i en luminiscens imager med auto-fluorescens gratis uppvärmd scen och samtidigt bibehålla anestesi för möss.
5. IRE av SQ tumörer
- Förbered det material som krävs: square wave electroporator, foten säkerhetsbrytare, elektroder (nål array kontra tweezer-trode) och adaptrar. Hålla sterila suturer (icke-absorberbara 4-0), spritkompresser, hårklippningsmaskiner, hårborttagningsprodukter grädde, öga smörjmedel, bomull gasväv, buprenorfin och anestetika också i närheten.
- Sterilisera pincett eller visare array elektroder med Gassterilisering. Autoklavering rekommenderas inte. Använd en glas pärla sterilizer för att sterilisera elektroderna mellan djur.
- Administrera buprenorfin 0,05 - 0,1 mg/Kg till tumör-bärande möss 30 min före ingreppet.
- Följ steg 4.4-4.5 för att framgångsrikt inducera anestesi hos möss när SQ tumör implantatet når 5 mm diameter.
- Placera sövda musen på sidan tillgång till SQ tumören på flanken. Ta bort håret med hjälp av clippers och rena huden med en spritsudd.
- För SQ tumörer, använda 2-nål array elektroder. Lyfta huden direkt under webbplatsen tumören med pincett och infoga elektroderna genom huden parallellt med kroppen att göra säker på att de inte tränga i bukhålan. En gång genom huden, Placera elektroderna på ett sådant sätt att de fäste tumören.
- Programmera electroporator att leverera 100 µs pulser i en frekvens av 1 Hz vid 1 500 V/cm för totalt 150 pulser. Leverera de pulser med fotpedalen. Separera varje uppsättning 10 pulser med 10 s, för att möjliggöra värmeavledning och bekräfta rätt position av elektroderna.
Obs: Utan användning av paralytisk agenter, möss upplever muskelsammandragningar med IRE som kan orsaka förskjutning av elektroderna såvida inte manuellt säkrade. - Ta bort elektroderna efter komplett dosering, som inte bör överstiga 200 s. posten den faktiska spänningen levererade, som visas på electroporator. Låta mössen att återhämta sig efter IRE enligt steg 4.14-4.16.
6. vrede av ortotop tumörer
Obs: IRE av ortotop tumörer innebär en andra överlevnad kirurgi på samma mus vilket kräver särskilt godkännande från lokala IACUC före början.
- Förbereda material behövs: autoklav de kirurgiska verktyg såsom sax, skalpell, nål drivrutiner, spetsiga pincett, och platt tippas pincett. Hålla följande i närheten samt: sterila suturer (absorberbara 6-0 och icke-absorberbara 4-0), spritkompresser, hårklippningsmaskiner, hårborttagningsprodukter grädde, öga smörjmedel, bomull gasväv, 10% povidon-jodlösning, kirurgiska draperier, värmedynor, fyrkantsvåg electroporator, säkerhet fotpedalen, elektroder och deras adaptrar, buprenorfin och bedövningsmedel.
- Bedöma möss för ortotop tumörtillväxt genom in-vivo imaging (se steg 4.17) genom att injicera 30 mg/kg av D-Luciferin intraperitonealt.
Obs: Ortotop tumörer är idealiska för IRE behandling 8-10 dagar post implantation när tumörer är tydligt synliga och fortfarande trånga att bukspottkörteln som kan ses på luciferas luminiscens bilderna (se Representativa resultat). - Följ steg 4,4-4,9, leta upp den implanterade tumören. Om tumören inte är lätt att hitta, använda trubbiga nosed pincett för att flytta magen och mjälten försiktigt för att identifiera tumören.
- Yttre tumören med trubbiga nosed pincett och fånga tumören tätt med den pincett-trode platina elektroder. Leverera elektroporation pulserna som programmeras i steg 5,7 använder den fyrkantsvåg electroporator i uppsättningar av 10 pulser kontrolleras av fotpedalen.
- Hålla tumören externalized för minst 60 s inlägg IRE ska övervakas för tecken på blödning. Infoga tumören tillbaka i bukhålan och nära snittet som beskrivs tidigare (steg 4.13-4.16) och övervaka musen tills det återvinner.
- Övervaka effekterna av IRE på tumörtillväxt med hjälp i vivo luciferas imaging enligt steg 4.17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi följde förfaranden som beskrivs ovan och genererade SQ tumörer på 5-6 vecka gamla vildtyp C57BL/6 möss inokuleras med 1 x 106 celler med 50% BMM. När storleken på tumören nått 5-6 mm i diameter, några av mössen var euthanized, deras tumörer var censurerade och implanteras orthotopically hos en mottagande C57BL/6 möss. IRE var utfört 10 dagar post implantation som visas i figur 1tidslinje. IRE utfördes på återstående möss med SQ tumörer.
SQ tumörer, IRE spänning och puls varaktigheten hölls konstant vid 1 500 V/cm och 100 µs, respektive, men antalet pulser varierade. Figur 2 visar att de SQ tumörerna i några möss regredierat helt efter 150 pulser av IRE men inte lika väl med 75 pulser. Totalt 4 av 9 möss visade fullständig tumörregression efter 150 pulser av IRE. Histologisk analys av tumören vävnad 1 vecka post IRE visade stora regioner av central tumör nekros som sågs ej i styra obehandlad tumörer. Denna nekrotisk kärna flankerades av levande tumörvävnad i fall av ofullständig tumörregression (figur 3). Lyckad implantation av ortotop tumör uppnåddes också, och tillväxttakten övervakades med hjälp av in-vivo Mareld imaging visar tumör på dag 10 och dag 15 (figur 4) efter implantationen. IRE på 150 pulser också visat vara effektiva i ortotop tumörer (figur 5) visar minskad tumör volymer. Sammantaget visar dessa resultaten förmågan hos denna modell att simulera effekterna av IRE i en immunkompetenta musmodell, vilket ger en plattform för att testa olika IRE förhållanden och kombinationer att behandla PC.
Figur 1 : Schematisk framställning visar den tidsförloppet för tumör implantation och IRE. För SQ tumörer utförs IRE så snart som tumören når 5-6 mm i diameter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Luciferas-Mareld imaging visar en minskning i tumör tillväxt inlägg IRE i SQ modell. KPC-Luc cellinje uttrycker konstitutivt luciferas vilket gör det möjligt att övervaka tumörtillväxt svar på IRE i realtid. Dag 14 Mareld imaging post IRE visar fullständig regression av tumör i en av mössen behandlades med 150 pulser av IRE, medan ofullständig regression sågs med 75 pulser av IRE jämfört med obehandlad kontroll. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Hematoxylin och eosin färgning av tumörvävnad visar förändringarna i vävnad arkitekturen post IRE. SQ tumörer utsätts för IRE visade stora regioner av nekros centralt, omgivet av regioner i levande vävnad som indikerar otillräcklig IRE täckning i vissa fall. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Mareld imaging visar lyckad implantation av ortotop tumör och dess tillväxt över tiden. Bilder är tagna med en kommersiell Mareld imaging instrument med den luminiscens tillfångatogs vid 1 min exponering. Möss injicerades med 30 mg/kg D-luciferin lösning intraperitonealt 10 min innan imaging. Möss hölls nedsövd med 2% isofluran under förfarandet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : IRE inducerar tumör tillväxt minskning ortotop PC tumörer. (A) Bioluminescecnce bilder av möss härbärgerat ortotop PC visade minskad luciferas signal 7 dagar efter IRE jämfört med sham kirurgi vilket tyder på minskad levande tumör börda till följd av IRE. (B) genomsnittliga mängden exciderad ortotop tumörer (+ standardfel) i kontroll möss vs möss som genomgick IRE. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna studie har vi visat en immunkompetenta musmodell för PC som kan användas för att studera effekterna av IRE tumör tillväxt. För närvarande, används IRE som en icke-termisk ablationsteknik endast i utvalda lokalt avancerad PC patienter som inte har avlägsna sjukdomsprogression efter månader av preoperativ terapi. Dess användning har därför begränsats eftersom de flesta patienter med lokalt avancerad PC utveckla avlägsen metastaserande sjukdom20. Denna modell kommer att tjäna som underlag för studier för att utvärdera effekterna av IRE på PC använder olika förlängd behandling parametrar och kombinationer.
Det viktigaste att tänka på under protokollet är storleken på tumören som IRE utförs. Kommersiellt tillgängliga sonderna för möss-modeller är begränsade av sin elektrod avstånd (5-10 mm). Därav, i tumörer betydligt större än elektrod avståndet, ofullständig ablation sker. För SQ tumörer rekommenderas användning av 2-nål array elektroder över tweezer-derna som huden runt tumören ökar motståndskraft mot flödet av nuvarande i tweezer-derna. Storleksbegränsning av 2-nål array elektroderna kan övervinnas genom att utföra IRE på olika djup och vinklar i samma tumören; men gör detta synsätt det svårt att behandla tumörer jämnt. Alternativt, för större tumörer (upp till 10 mm), ett snitt kan göras på huden nedanför tumören till en längd som är något längre än tumör diameter. Tumören kan sedan vara externalized via snittet genom att invertera överliggande huden med hjälp av tången. Tumören kan då behandlas med pincett-derna, liknar ortotop tumörer beskrivs ovan. Electroporated tumören kan sedan sättas under huden, och huden sys med en 4-0 icke-resorberbar sutur som en avbruten söm. Men effekterna av snittet kan blanda ihop effekterna av IRE, och vi har funnit att utföra IRE när tumörerna är inom arbetsavstånd av två-nål array elektroderna (~ 5-6 mm) ger bästa standardiseringen.
Oavsett vilken metod måste antalet pulser fastställas empiriskt beroende på tumör. Publicerade studier har utnyttjat mellan 150-300 pulser denna spänning17. Men bestämde vi det optimala antalet pulser i ett experiment som preliminära dos-respons. Det finns modeller för att förutsäga zonen av fullständig ablation baserat på spänning och elektrod avstånd, men tumörtyper kan variera kraftigt i vascularity och fibros, vilket kan påverka svaret på elektroporation21.
Varje uppsättning 10 pulser var separerade med 10 s för att undvika värme effekterna som uppstår om alltför många pulser levereras för snabbt. Överdriven behandling kan leda till termisk ablation, vilket kan förhindra korrekt karakterisering av effekterna av icke-termisk IRE. 10 s intervallet också tillåter oss att ofta bekräfta elektrod placering korrekt eftersom muskelsammandragningar kan orsaka elektrod förskjutning. Våra IACUC har ännu inte tillåtna för användning av paralytisk medel i små djur, som kraftigt kan minska muskelsammandragningar under IRE. Vid ortotop tumörer tillåter den pincett-derna oss att hålla tumörerna hårt och har en större elektrod yta jämfört med nål elektroden.
Även om IRE är för närvarande endast används som en ablativ förfarande i den kliniska inställningen, elektroporation i allmänhet har ett brett spektrum av tillämpningar som sträcker sig från nerv- och muskelfunktion aktiveringar till leverans av olika droger och oligonukleotider. Genom att noggrant analysera de patofysiologiska förändringar som sker under och efter IRE med hjälp av denna modell, är det möjligt att utveckla oräkneliga terapeutiska strategier för PC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga relevanta finansiella upplysningar.
Acknowledgments
RRW har fått stöd för detta arbete från Collaborative translationell forskningsbidrag finansieras av San Diego C3 Padres pedalen den orsaken (#PTC2017).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ECM 830 square wave electroporator | Harvard Apparatus | BTX # 45-0002 ( 58018-004 ) | |
| 2 needle array electrode | Harvard Apparatus | 45-0167 | |
| Safety foot switch | Harvard Apparatus | 45-0211 | |
| Platinum Tweezer-trode | Harvard Apparatus | 45-0486 | |
| DMEM-F12 media | ThermoFisher Scientific | 11320-033 | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific | 10437028 | |
| Trypsin | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich, Inc. | 792632 | |
| Lacrilube | Fisher Scientific | 19090646 | |
| Buprenorphine | Fisher Scientific | NC1292810 | |
| D-luciferrin | Perkin Elmer | 122799 | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | 124262 | |
| Mouse strain C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 000664/Black 6 | |
| Cell line (KPC-Luc 4580) | J.J. Yeh Lab at University of North Carolina | ||
| BD Precisionglide syringe needles | Sigma-Aldrich, Inc. | Z192406 | |
| Alcohol Swab(70% isopropyl alcohol ) | BD | 326895 | |
| Digital calipers | ThermoFisher Scientific | 14-648-17 | |
| Disposable Scalpels, Sterile | VWR | 21909 | |
| Cotton Tipped Applicators | VWR | 89198 | |
| Suture Needle, 45 cm, Size 6-0 | Harvard Apparatus | 72-3308 | |
| Suture Needle, 45 cm, Size 4-0 | Harvard Apparatus | 72-3314 | |
| Povidone-iodine 10% | BD | 29900-404 | |
| Disposable Warming Pad | KENT SCIENTIFIC CORP. | TP-3E | |
| Mouse Hair Clipper | KENT SCIENTIFIC CORP. | CL8787 | |
| Surgical Drape | Harvard Apparatus | 59-7421 | |
| Phosphate-buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 10010023 |
References
- Rahib, L., et al. Projecting cancer incidence and deaths to 2030: the unexpected burden of thyroid, liver, and pancreas cancers in the United States. Cancer Res. 74 (11), 2913-2921 (2014).
- Howlader, N., et al. SEER Cancer Statistic Review, 1975-2013. , http://seer.cancer.gov/csr/1975_2013/ (1975).
- Clark, C. E., et al. Dynamics of the immune reaction to pancreatic cancer from inception to invasion. Cancer Res. 67 (19), 9518-9527 (2007).
- Lee, E. W., Loh, C. T., Kee, S. T. Imaging guided percutaneous irreversible electroporation: ultrasound and immunohistological correlation. Technol Cancer Res Treat. 6 (4), 287-294 (2007).
- Charpentier, K. P. Irreversible electroporation for the ablation of liver tumors: are we there yet? Arch Surg. 147 (11), 1053-1061 (2012).
- Narayanan, G. Irreversible Electroporation. Seminars in Interventional Radiology. 32 (4), 349-355 (2015).
- Martin, R. C. 2nd Treatment of 200 locally advanced (stage III) pancreatic adenocarcinoma patients with irreversible electroporation: safety and efficacy. Ann Surg. 262 (3), 486-494 (2015).
- Belfiore, M. P., et al. Percutaneous CT-guided irreversible electroporation followed by chemotherapy as a novel neoadjuvant protocol in locally advanced pancreatic cancer: Our preliminary experience. Int J Surg. 21 Suppl 1, S34-S39 (2015).
- Belfiore, G., et al. Concurrent chemotherapy alone versus irreversible electroporation followed by chemotherapy on survival in patients with locally advanced pancreatic cancer. Med Oncol. 34 (3), 38 (2017).
- Chu, K. F., Dupuy, D. E. Thermal ablation of tumours: biological mechanisms and advances in therapy. Nat Rev Cancer. 14 (3), 199-208 (2014).
- Wissniowski, T. T., et al. Activation of tumor-specific T lymphocytes by radio-frequency ablation of the VX2 hepatoma in rabbits. Cancer Res. 63 (19), 6496-6500 (2003).
- Eros de Bethlenfalva-Hora, C., et al. Radiofrequency ablation suppresses distant tumour growth in a novel rat model of multifocal hepatocellular carcinoma. Clin Sci (Lond). 126 (3), 243-252 (2014).
- Zerbini, A., et al. Radiofrequency thermal ablation for hepatocellular carcinoma stimulates autologous NK-cell response. Gastroenterology. 138 (5), 1931-1942 (2010).
- Ali, M. Y., et al. Activation of dendritic cells by local ablation of hepatocellular carcinoma. J Hepatol. 43 (5), 817-822 (2005).
- Fietta, A. M., et al. Systemic inflammatory response and downmodulation of peripheral CD25+Foxp3+ T-regulatory cells in patients undergoing radiofrequency thermal ablation for lung cancer. Hum Immunol. 70 (7), 477-486 (2009).
- Jiang, C., Davalos, R. V., Bischof, J. C. A review of basic to clinical studies of irreversible electroporation therapy. IEEE Trans Biomed Eng. 62 (1), 4-20 (2015).
- Neal, R. E. 2nd, et al. Improved local and systemic anti-tumor efficacy for irreversible electroporation in immunocompetent versus immunodeficient mice. PLoS One. 8 (5), e64559 (2013).
- Hingorani, S. R., et al. Trp53R172H and KrasG12D cooperate to promote chromosomal instability and widely metastatic pancreatic ductal adenocarcinoma in mice. Cancer Cell. 7 (5), 469-483 (2005).
- Safran, M., et al. Mouse reporter strain for noninvasive bioluminescent imaging of cells that have undergone Cre-mediated recombination. Mol Imaging. 2 (4), 297-302 (2003).
- Martin, R. C. 2nd, McFarland, K., Ellis, S., Velanovich, V. Irreversible electroporation in locally advanced pancreatic cancer: potential improved overall survival. Ann Surg Oncol. 20 Suppl 3, S443-S449 (2013).
- Neal, R. E., Garcia, P. A., Robertson, J. L., Davalos, R. V. Experimental Characterization and Numerical Modeling of Tissue Electrical Conductivity during Pulsed Electric Fields for Irreversible Electroporation Treatment Planning. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 59 (4), 1076-1085 (2012).
