Summary
돌이킬 수 없는 electroporation (분노) 로컬 고급 췌장암의 치료에 사용 하는 비 열 제거 기술입니다. 비교적 새로운 기술 이기 때문에, 종양 성장에 분노의 효과 제대로 이해 된다. 췌장암에 대 한 분노의 효과 공부 하 고 용이 하 게 syngeneic 마우스 모델을 개발 했습니다.
Abstract
췌장암 (PC), 미국에서 약 40000 환자 년 죽이 질병은 성공적으로 유망한 immunotherapeutic 전략을 포함 한 여러 치료 접근을 피할 수 있습니다. 돌이킬 수 없는 electroporation (분노) 따라서 종양 혈관 가까이 매우에 수행 하는 절차를 사용 하면 인접 한 collagenous 구조의 파괴 없이 종양 세포 죽음을 유도 하는 비 열 제거 기술 이다. 열 제거 기술, 달리 분노 유발 즉시 제거 괴 사, 함께 점진적 apoptotic 세포 죽음에 결과 이며 현재 로컬 고급 PC 선택 된 환자에 대 한 임상 사용. 융 제, 분노 같은 비 대상 특정 절차 종양 microenvironment에 반응의 무수 한을 유도할 수 있다. 몇 가지 연구는 다른 종양 유형, 종양 성장에 분노의 영향을 해결 하지만 아무도 PC에 집중 했다. 우리는 다양 한 경도 연구 포스트 절차를 용이 하 게 높은 통제 속에서 분노와 피하 (SQ)와 orthotopic 종양 대우 될 수 있다 성공적으로 PC의 syngeneic 마우스 모델을 개발 했습니다. 이 동물 모델 분노와 분노의 임상 효능을 개선 하는 방법의 효과 연구 하는 강력한 시스템 역할을 합니다.
Introduction
췌 장 ductal 선 암 (PC) 20201주위 미국에서 암 사망의 두 번째 주요 원인이 될 전망 이다. PC 진단 환자의 대부분은 먼 전이성 질환2에서 결국 죽을 것 이다. PC microenvironment는 악명 높게 면역 및 chemoresistant. 그것의 desmoplastic 기질 포함 이펙터 (안티 종양) T 세포의 부족 및 종양 관련 된 대 식 세포 (Tam)을 포함 한 면역 백혈구의 굴지, 골수성 파생된 억제기 세포 (MDSCs), 및 규제 T 세포 (Tregs)3 . 이 microenvironment의 이러한 효과 중화 하는 복합 전략을 개발할 필요가 기반이 됩니다.
분노는 종양 절제의 비 열 방법으로 개발 되었습니다. 열 제거 기술, 달리 분노 빠른 coagulative 괴 사를 발생 하지 않습니다 있지만 대신 점진적 apoptotic 세포 죽음4에 결과. 중요 한 것은 췌 장 종양에 대 한 분노는 "열 싱크" 효과에 취약 하 고 혈관5옆 바로 수행할 수 있습니다. 이 기술은6 FDA 510(k) 허가 있으며 현재 사용 되 고 임상, 선택한 로컬 고급 또는 경계선 불과하다 췌장암 환자. 가장 큰 출판된 시리즈에서 분노의 PC7대, 분노를 받은 환자의 평균 생존 약 두 번 절제8,9없이 혼자 현대 화학 요법으로 치료 하는 환자의 생존이 했다.
몇몇 학문은 그 열 제거 (검토 추 외 에 다른 종양 유형에서 조직의 면역 반응 유도 설명 했다 10). 고주파 제거 (RFA) 동물 종양 모델 리드 증가 T 세포에에서 침투11,12, 간세포 암 환자13, 활성화 된 자연 킬러 (NK) 세포에 있는 증가 포함 하 여 14, 그리고 면역 Tregs 폐 암 환자15감소. 연구의 많은 더 작은 수는 면역, microenvironmental, 그리고 부상 응답 분노16을 시험 했다. 분노는 보조 (contralateral) 신장 세포 이식의 성장 또는 감소 했다 2 주 기본 종양의 분노를 예방할 immunocompetent 마우스 모델에서 조직의 면역 반응을 자극 하 표시 되었습니다 이전17. 그들은 또한 immunocompetent 쥐 immunocompromised 쥐 보다 완벽 한 회귀에 대 한 더 적은 전압 필요한 관찰. 그것은 분노의 열 제거, coagulative 괴에 비해 향상 된 항 원 프레 젠 테이 션 될 수 있습니다 하지만이 특별히 공부 하지는 가설 되어 있다.
KPC-뤽 4580 셀 선 (제이 예치 노스캐롤라이나 대학에서에서 선물), 남성 LSL Kra 개발한 종양에서 파생 되었다에서 PC의 syngeneic 마우스 모델 개발 했습니다G12D / +; LSL-Trp53R172H / +; PDX1Cre / +; LSL ROSA26 루크 / + 마우스, 분노18,19의 지역 및 조직의 효과 공부 하. 이 luciferase 표현 셀 라인 면역성 이며 또한 immunocompetent C57BL/6 쥐에 tumorigenic SQ orthotopically를 주입 하 고 안정적으로 생산 하는 간 전이 비장에 주입 했을 때. 우리 두 바늘 배열 조사 (5 m m 구분) 또는 광장 또는 orthotopic 종양, 플래티넘 트위터-trodes를 사용 하 여 1500 V/cm의 비 전압/거리에 전기의 100 µs 펄스를 제공 하는 프로그래밍 가능 구형 파 펄스 발생기 활용에서 각각, 작은 동물에 분노의 효과 모델링 하 쥐.
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Protocol
모든 동물 실험 수행 다음이이 프로토콜 각 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인을 받아야 한다. 여기에서 설명한 모든 절차는 IACUC UCSD에 의해 승인 되었습니다.
1. 조달 받는 동물
참고: KPC 뤽 4580 셀 라인 LSL Kra에서 발생 하는 종양에서 설립 되었다G12D / +; LSL-Trp53R172H / +; PDX1Cre / +; LSL ROSA26 루크 / + 마우스 (KPC), C57BL/6 배경에 PC의 유전자 조작된 모델입니다. 이 셀 라인의 장점은 그것 constitutively orthotopic 모델에서 종양 모니터링 luciferase 활성화 표현 한다입니다. 그러나, 다른 셀 라인으로 그들은 받는 사람 쥐의 유전 배경와 호환 사용할 수도 있습니다.
- 사전에 실험 그룹 및 그룹 당 동물의 수를 결정 합니다.
- 나이 (6-10 주 오래 된 마우스 권장)을 선택 하 고 섹스 가설 및 셀 선 사용 되는 동물의 사용.
2. 문화 셀
- 사용 Dulbecco의 독수리 매체 (DMEM)을 수정: 영양소 혼합 F12 (50: 50) 미디어 KPC 뤽 4580 세포 성장 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 및 1% 페니실린 스 항생제 (완전 한 성장 매체).
- 동결, 해빙 세포 종양 이식 전에 4 일.
- 무 균 조건 하에서 5% CO2 와 95% 습도 37 ° C에서 세포 성장.
- 0.25% 셀 trypsinize 37 ° c를 도달 하기 전에 5 분 동안 트립 신 > 80 %confluency 트립 신 완전 한 성장 매체의 볼륨을 두 번 추가 하 여 무력화.
참고: 이러한 셀 할 설정 하지 종양 효율적으로 쥐에 그들은 100 %confluency 사용 하는 경우 또는 그들은 이상 12 회에 대 한 passaged는 경우. 따라서, 그것은 최적의 confluency에서 이전 구절에서 세포를 고정 하는 것이 좋습니다. - hemocytometer를 사용 하 여 셀의 개수 및 적절 한 숫자는 존재 하는 경우 종양 유도를 진행 (0.5-1 x 106 셀/마우스). 그렇지 않은 경우에 적절 한 세포 수는 때까지 한 더 많은 통로 대 한 셀을 확장.
3입니다. 평방 종양의 유도
- 필요한 재료 준비: P1000 및 P100 펫, 팁, 1 mL 주사기 25 G 바늘, 지하실 멤브레인 매트릭스 (BMM) DMEM 기저 미디어, 1.5 mL 튜브 원심. 프로시저의 끝까지 모든 재료 살 균과 감기 (4 ° C)를 유지. 또한 발기를 유지 하 고 알코올 면봉 동물 사용에 대 한 준비.
- Trypsinize (에 의하여 2.4 단계) 하 고 셀, 2 배속 감기 DMEM의 107 셀/mL의 농도에서 그들을 resuspend.
- 100%의 동일한 볼륨을 추가 50%에서 최종 세포 현 탁 액을 만들기 위해 BMM BMM. 마지막 볼륨 세포 현 탁 액 요구 각 마우스의 50 µ L를 도달 해야 한다. 주사기에 pipetting 오류에 대 한 죽은 공간에 맞게 초과에서 10%를 준비 합니다.
- Aliquot 1.5 mL 원심 분리기 튜브에 550 µ L 볼륨에 정지 얼음에 배치.
- 동물 (6 주 오래 된 남성 C57BL/6 쥐)는 restrainer를 사용 하 여 억제 또는 수동으로.
참고: 또는, 쥐 수 수 anaesthetized 2.5 %isoflurane 정밀 기화 기를 사용 하 여 2 L/min의 유량에서 산소 가스에서와 함께. - 면도 선호 다리 위에 측면에 사용 하는 어 선 주사의 사이트. 알코올 면봉을 사용 하 여 두 번 주사의 사이트를 청소.
- 감기 1 mL 주사기에 107 셀/mL x 1-2의 최종 농도에 세포 현 탁 액의 250 µ L 그리고 피스톤을 아래로 이동 하 여 모든 기포를 제거. 주사기에 25g 바늘을 연결 하 고 바늘 내 공간을 채우기 위해 확인 한다.
- 조심 스럽게 옆구리, 복 막 구멍 또는 사지의 근육 바늘 피어스 하지 않습니다 확인 하 고 근처 시체에 30 ° 각도로 피부 밑에 바늘을 삽입 합니다.
- 평행 본문, 바늘을 평평 하 게 피부에 주름을 평평 하 게. 세포 현 탁 액의 50 µ L를 천천히 주사. 10에 대 한 주입의 위치에 바늘을 잡고 어떤 누설을 방지 하기 위해 응고 BMM 있도록 s.
- 천천히 그것을 유지 하는 어떤 측면 운동 없이 병렬 바늘 철회. 부드럽게 알코올 면봉과 주사의 사이트를 청소 하 고 그 주택에 마우스를 놓습니다.
참고: 마우스는 절차 동안 마 취를 하는 경우 그것은 righting 반사를 차릴 때까지 동물을 모니터링 합니다. - 직경에서 5mm를 도달할 때까지 정기적으로 캘리퍼스를 사용 하 여 종양의 성장을 모니터링 합니다.
4입니다. 유도 Orthotopic 종양의
- 필요한 재료를 준비 합니다. 오토 클레이 브는 수술 도구 등 지적 scalpels, 바늘 드라이버가 위 및 평면 밀고 집게. 편리한 무 균 봉합 (흡수 6-0 및 비 흡수 4-0), 알코올 면봉, 헤어 클리퍼 스, depilatory 크림, 눈 윤 활 유, 면화 거 즈, 10 %povidone 요오드 솔루션, 수술 커튼, 난방 패드, buprenorphine, 및 마 취 에이전트 유지.
- (되도록이면 같은 배경 orthotopic 모델에 필요한)의 기증자 마우스를 안락사 느린 채우기 CO2 챔버를 사용 하 여 SQ KPC 종양을 들고. 소독 집게와 곧 orthotopic 이식 전에 microscissors를 사용 하 여 BSL-2 후드에서 무 균 조건 하에서 신중 하 게 평방 종양 삭제하시오 종양 절제 동안 복 막 구멍 찌를 세척 살 균 PBS의 2 교류와 즉시 종양을 주의.
- 살 균 scalpels를 사용 하 여 1 m m3 조각으로 삭제 종양을 말하다, 그들 감기 균 DMEM 기저 미디어를 포함 하는 배양 접시에 놓고 이식까지 얼음에 저장.
- 관리 받는 사람 마우스 0.05-1 mg/kg buprenorphine 진통제 SQ, 수술 전에 30 분.
- 정밀 기화 기 (또는 다른 마 취 에이전트)를 사용 하 여 산소 (2 L/min)에서 2-3 %isoflurane 받는 사람 마우스 anesthetize 프로시저의 전체에 대 한 패드를가 열 하는 37 ° C에 마우스를 유지. 건조를 방지 하기 위해 눈에 윤활제를 적용 합니다. 놀라운 반사 처음의 부족에 의해 마 취의 깊이 테스트 하 고 부드러운 발가락 핀치에 페달 반사의 부족에 의해 외과 비행기 마 취를 확인 합니다. 전체 수술 중 마 취를 유지 합니다.
- 그것의 뒤에 마우스를 놓고 부드럽게 복 부의 왼쪽 노출 되도록 그것의 오른쪽으로 설정 합니다. Depilatory 크림을 사용 하 여 마우스의 복 부를 제거 하 고 무료로 머리카락 복 부 게시물 절 개 입력 되도록 거 즈로 청소. 피부 소독에 알코올 잎사귀 뒤 10 %povidone 요오드의 3 주기를 사용 하 여 수술에 대 한 왼쪽된 복 부를 준비 합니다.
- 살 균 메스를 사용 하 여 만들 1.5 c m 가로 또는 경사 절 개 피부, 흉 곽, 아래 중간의 왼쪽에 1 cm에서에서 비장을 약간 중간. 그런 다음, 복 부 근육, 미러링 overlying 표면 절 개를 통해 절 개를 확장 합니다.
- 평면을 사용 하 여 비장 집게를 밀고 찾아서 부드럽게 복 부 구멍에서 그것을 외부화. 메 마른 면 주걱을 사용 하 여 비장을 철회 하 고 비장의 하단에 부착 된 췌 장의 꼬리를 찾을.
- 평면 밀고 집게를 사용 하 여, 췌 장의 꼬리 옆으로 철회.
- 소독 집게를 사용 하 여 위치를 벌금 (6-0) 살 균 suturing 바늘의 팁과 기증자 마우스에서 하나의 잘게 다진된 종양 조각 들고.
- 동안 부드럽게 췌 장의 꼬리/몸 옆으로 축소, 췌 장의 꼬리에 종양 조각 포함 된 봉합 바늘을 삽입 합니다. 천천히 들고 췌 장 꼬리를 접촉 하 여 종양 조직을 통해 봉합을 전달 합니다. 조직에 관하여 단편의 방향에 따라 하나 또는 두 개의 추가 봉합을 적용 합니다.
- 조직에서 바늘을 완전히 제거 하 고 췌 장/비장 추가 60 externalized 계속 출혈 또는 누출의 어떤 표시 든 지를 검사 하는 동안 s. 무딘 집게를 사용 하 여 복 부 구멍으로 그들을 부드럽게 internalize 다음.
- 복 부 근육으로 6-0 흡수 봉합 사를 사용 하 여 연속 또는 중단 스티치 닫고 overlying 피부는 3-0 6-0 비 흡수 중단된 봉합 사를 사용 하 여 닫습니다. 이 시점에서 마 취를 중단 합니다.
- 마우스와 음식 및 물의 홈 장에 복구를 허용 합니다. 회복을 촉진 하는 생리대에 케이지를 놓습니다. 복구 프로세스 동안 관류 등, 호흡 등 생체 신호를 모니터링 합니다.
- 일단 마우스를 복구, 그리고 다음 반환 케이지 일반 주택 수 있는 반사를 righting의 징후를 확인 합니다.
- Buprenorphine 0.05-0.1 mg/kg를 관리, 수술 후 8-12 h 그리고 고통의 표시를 위해 필요에 따라 절차 후 모든 8-12 h.
- 종양의 성장은 vivo에서 생물 발광 이미징 시스템을 사용 하 여 모니터링 ( 재료의 표참조).
- 이미징 orthotopic 이식 후 4 일에 시작 하 여 종양의 성장에 따라 고 이미징 일주일에 두 번 수행 합니다.
- 화상의 날 (복 주입) 관리 D-소는 마 취에 30 mg/kg (산소 (2 L/min)에서 2-3 %isoflurane) 받는 사람 마우스 이미징 하기 전에 10 분.
- 5 s 노출 자동 형광 무료 열띤된 무대와 쥐에 대 한 마 취 유지 하면서 발광 영상에서의 최소 배출 필터 없이 발광 설정을 사용 하 여 luciferase 활동에 대 한 이미지.
5입니다. SQ 종양의 분노
- 필요한 재료 준비: 정사각형 웨이브 electroporator, 안전 발 스위치, 전극 (족집게 trode 대 바늘 배열), 및 어댑터. 무 균 봉합 (비 흡수 4-0), 알코올 면봉, 헤어 클리퍼 스, depilatory 크림, 눈 윤 활 유, 면화 거 즈, buprenorphine, 및 마 취약 또한 근처.
- 족집게를 소독 하거나 살 균 가스를 사용 하 여 배열 전극 바늘. 압력가 마로 소독을 권장 하지 않습니다. 유리 구슬 소독 기를 사용 하 여 동물 사이의 전극 소독.
- 관리 buprenorphine 0.05-0.1 mg/Kg는 종양 방위 쥐 절차 전에 30 분.
- 단계 4.4-4.5 평방 종양 이식 5 m m 직경에 도달 하면 성공적으로 마우스 마 취를 유도 합니다.
- 측면에 평방 종양에 액세스 하는 측면에 마 취 마우스를 놓습니다. 머리 깍 고 알코올 면봉을 사용 하 여 깨끗 한 피부를 사용 하 여 제거 합니다.
- 평방 종양 2 바늘 배열 전극 사용 하 여. 집게를 사용 하 여 종양 사이트 바로 아래 피부를 상승 하 고 복 막 구멍을 침투 하지 않는 다는 것을 확인 하는 신체에 평행 하 게 피부를 통해 전극을 삽입. 일단 피부를 통해 그들은 종양 대괄호 같은 방법으로 전극 위치.
- 100 µs 펄스 150 펄스의 총 1500 V/cm에서 1 Hz의 주파수에 전달 하기 위해 electroporator 프로그램. 발 페달을 사용 하 여 펄스를 제공 합니다. 10 10 펄스의 각 집합을 별도 s, 방열에 대 한 허용 하 고 전극의 올바른 위치를 확인.
참고: 마비 에이전트를 사용 하지 않고 마우스는 수동으로 확보 하지 않는 한 전극의 변위를 일으킬 수 있는 분노와 근육 수축 발생 합니다. - electroporator에 표시 되는 실제 전압 전달, 200 미 레코드를 초과 하지 않아야 완전 한 주입 후 전극을 제거 합니다. 수 단계 4.14-4.16 당 분노를 다음 복구 하 쥐.
6입니다. Orthotopic 종양의 분노
참고: orthotopic 종양의 분노는 따라서 시작 하기 전에 현지 IACUC에서 특별 한 승인 요구 같은 마우스에 두 번째 생존 수술을 포함 한다.
- 필요한 재료 준비: 압력솥 scalpels,가 위, 바늘 드라이버, 수술 도구 겸 자, 그리고 평면 집게를 밀고. 뿐만 아니라 인근 다음 유지: 무 균 봉합 (흡수 6-0 및 비 흡수 4-0), 알코올 면봉, 헤어 클리퍼 스, depilatory 크림, 눈 윤 활 유, 면화 거 즈, 10 %povidone 요오드 솔루션, 수술 커튼, 난방 패드, 구형 파 electroporator 안전 발 스위치, 전극 및 그들의 어댑터, buprenorphine, 및 마 취약.
- Vivo에서 화상 진 찰에 의해 orthotopic 종양 성장 위한 쥐를 평가 (단계 4.17 참조) intraperitoneally D 소의 30 mg/kg을 주입 하 여.
참고: orthotopic 종양 종양 췌 장에 Luciferase 발광 이미지 ( 대표 결과참조)에서 볼 수 명확 하 게 표시 하 고 여전히 제한 된 때 분노 치료 8 ~ 10 일 포스트 주입에 이상적입니다. - 단계 4.4-4.9, 이식된 종양을 찾으려고 합니다. 종양 쉽게 찾을 하지 않으면 무딘 코 집게를 사용 하 여 위장과 비장 종양 식별을 부드럽게 이동.
- 무딘 코 집게와 종양을 외부화 하 고 족집게 trode의 백 금 전극으로 단단히 종양. 단계 10 펄스 발 스위치에 의해 제어의 세트에서 구형 파 electroporator를 사용 하 여 5.7에서에서 프로그래밍 electroporation 펄스를 제공 합니다.
- 적어도 60 s 게시물 출혈의 어떤 표시 든 지에 대 한 모니터링을 분노 externalized 종양을 유지. 기술된 이전 (단계 4.13-4.16)로 절 개 종양 복 부 구멍에 다시 삽입 닫고 복구 될 때까지 마우스를 모니터링 합니다.
- 단계 4.17에 의하여 luciferase 이미징 vivo에서 를 사용 하 여 종양의 성장에 분노의 효과 모니터링 합니다.
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Representative Results
우리는 절차를 따라 위에서 설명한 고 5-6 주 오래 된 야생 타입 C57BL/6 쥐 50 %1 x 106 세포 주사에 평방 종양 생성 BMM. 종양 크기 직경에서 5-6 m m에 도달 하면 쥐의 몇 가지 했다 안락사, 그들의 종양 excised 했다 orthotopically 받는 사람 C57BL/6 쥐에 이식. 그림 1에 타임 라인에 같이 분노 수행된 10 일 게시물을 이식 했다. 분노는 베어링 평방 종양 나머지 쥐에서 수행 되었다.
SQ에 종양, 분노 전압 및 펄스 기간 했다 일정 하 게 유지 1500 V/cm 및 100 µs, 각각, 하지만 펄스 수 변화. 그림 2 는 몇 가지 생쥐에서 평방 종양 150 펄스 분노 하지만 뿐만 아니라 75 펄스 후 완전히 역행을 보여준다. 총에서 4 개의 9 마우스 분노의 150 펄스 후 완전 한 종양 회귀를 보여주었다. 종양 조직 1 주 게시물 분노 했다 큰 지구 중앙 종양 괴 사의 하지에 보인의 조직학 분석 치료 종양 제어 합니다. 이 괴 코어 불완전 한 종양 회귀 (그림 3)의 경우 라이브 종양 조직에 의해 측면 했다. 성공적인 이식 orthotopic 종양의 달성도, 그리고 성장 율 생물 발광 영상 vivo에서 이식 후 종양 10 일과 하루 15 (그림 4)에서 보기를 사용 하 여 모니터링 했다. 150 펄스에서 분노는 또한 종양 볼륨 감소 보여주는 orthotopic 종양 (그림 5)에 효과가 입증 했다. 이 결과 분노의 효과 시뮬레이션 하는이 모델의 기능을 설명 하는 전반적으로, immunocompetent 마우스 모델에서 다양 한 분노 조건 및 PC를 치료 하는 조합을 테스트 플랫폼을 제공 함으로써.
그림 1 : 표현식 쇼는 종양 이식 및 IRE.의 시간 과정 평방 종양에 대 한 분노는 즉시 종양에 도달 5-6 밀리미터 직경에서으로 수행 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : Luciferase 생물 발광 영상 평방 모델에서 종양 성장 게시물 분노 감소 보여줍니다. KPC-뤽 셀 라인 constitutively luciferase 종양 성장을 실시간으로 분노에 대 한 응답을 모니터링 가능한 만드는 표현 합니다. 반면 불완전 한 회귀 치료 컨트롤에 비해 분노의 75 펄스와 보였다 하루 14 생물 발광 영상 게시물 분노에서는 종양의 완전 한 회귀 쥐 중 하나 분노의 150 펄스 처리. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : Hematoxylin 및 종양 직물의 얼룩이 지 오신 보여줍니다 조직 아키텍처에서 변경 게시 IRE. 분노에 노출 평방 종양 보였다 괴의 큰 지구 중앙, 어떤 경우에 부적절 한 분노 범위를 나타내는 살아있는 조직의 영역으로 둘러싸인. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 생물 발광 영상 orthotopic 종양 및 시간이 지남에 성장 성공적인 이식 보여줍니다. 이미지 1 분 노출에서 캡처한 발광으로 악기를 이미징 상업 생물 발광을 사용 하 여 찍은 사진. 쥐 했다 주입 30 mg/kg의 D 소 솔루션으로 intraperitoneally 이미징 하기 전에 10 분. 마우스 유지 했다 anaesthetized 절차 동안 2 %isoflurane 사용 하 여. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : 분노 orthotopic PC 종양에서 종양 성장 감소를 유도 한다. (A) Bioluminescecnce orthotopic PC 보였다 감소 luciferase 신호 7 일 후 분노를 은닉 하는 쥐의 이미지 가짜 분노의 결과로 라이브 종양 부담 감소를 제안 하는 수술에 비해. (B) 삭제 orthotopic 종양 (+의 표준 오류) 마우스는 분노를 받았다 대 통제 쥐에 있는 평균 볼륨. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이 연구에서 우리가 종양 성장에 분노의 효과 연구 하는 데 사용할 수 있는 PC에 대 한 immunocompetent 마우스 모델을 증명 하고있다. 현재, 분노 먼 질병의 수술 치료의 달 후에 진행 하지 않은 매우 선택한 로컬 고급 PC 환자에만 비 열 제거 기법으로 사용 됩니다. 그것의 사용 그러므로 제한 되었습니다 로컬 고급 PC 가진 대부분의 환자는 먼 전이성 질환20를 개발 하기 때문에. 이 모델은 다양 한 확장된 치료 매개 변수 및 조합을 사용 하 여 PC에 분노의 효과 평가 하는 연구를 기반으로 될 것입니다.
프로토콜 중 고려해 야 할 가장 중요 한 것은 분노를 수행 하는 종양의 크기. 쥐 모델에 대 한 상업적으로 이용 가능한 프로브는 그들의 전극 거리 (5-10 m m)에 의해 제한 됩니다. 따라서,에서 전극 거리 보다 훨씬 더 큰 종양, 불완전 절제가 일어난다. 평방 종양에 대 한 트위터-trodes 이상의 2 바늘 배열 전극의 사용은 피부 종양을 둘러싼 트위터 trodes에 현재의 흐름에 저항을 증가 권장. 2 바늘 배열 전극의 크기 제한 같은 종양;에 다양 한 깊이 각도에서 분노를 수행 하 여 극복할 수 있습니다. 그러나,이 이렇게 어렵게 균일 하 게 종양을 치료 합니다. 또는, 더 큰 종양에 대 한 (최대 10 m m), 절 개 종양 아래 피부에 종양 직경 보다 약간 더 긴 길이 만들 수 있습니다. 다음 반전 overlying 피부 집게를 사용 하 여 종양 절 개를 통해 externalized 수 있습니다. 종양은 트위터-trodes, 위에서 설명한 orthotopic 종양과 유사한 다음 치료 수 있습니다. Electroporated 종양 피부, 및 중단 된 스티치로 4-0 비 흡수 성 봉합 사로 봉합 하는 피부는 다시 삽입할 수 있습니다. 그러나, 절 개 효과, 분노의 효과 혼동 수 있습니다 그리고 우리는 수행 발견 했다 종양 2 바늘 배열 전극의 작동 거리 안에 들어오면 분노 (~ 5-6 m m) 최고의 표준화를 제공 합니다.
접근에 펄스 수를 종양 유형에 따라 실험적으로 결정 될 필요가 있다. 게시 된 연구는이 전압17에서 150-300 펄스 사이 활용 됩니다. 그러나, 우리는 예비 복용량 응답 실험에서 펄스의 최적의 수 결정. 전압 및 전극 거리에 따라 완전 한 절제의 영역을 예측 하는 모델은 하지만 종양 종류 크게 vascularity 및 섬유 증, electroporation21응답에 영향을 미칠 수 있습니다 다를 수 있습니다.
10 펄스의 각 세트는 10 분리 되었다 너무 많은 펄스 너무 빨리 배달 되는 경우 발생 하는 난방 효과 피하기 위해 s. -치료 비 열 분노의 효과의 정확한 특성화 수 있는 열 제거 될 수 있습니다. 10 s 간격 또한 자주 전극 근육 수축이 전극 변위를 일으킬 수 있기 때문에 정확 하 게 위치 확인 하 수 있습니다. 우리의 IACUC는 아직 사용할 수 없습니다 마비 에이전트를 사용 하 여 근육 수축 분노 하는 동안 크게 줄일 수 있습니다 작은 동물. Orthotopic 종양의 경우 트위터 trodes 종양을 단단히 잡고 있고 바늘 전극에 비해 더 큰 전극 표면 영역을 수 있습니다.
분노는 현재 임상 설정에서 절제 절차로 사용 되는, electroporation 일반적 신경 및 근육 활성화에서 다양 한 약물과 oligonucleotides의 배달에 이르기까지 응용 프로그램의 광범위 한 스펙트럼 있다. 분노가이 모델을 사용 하는 동안에 발생 하는 병 태 생리 변화를 신중 하 게 분석 하 여 PC에 대 한 수많은 치료 전략을 개발 가능 하다.
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Disclosures
저자는 아무 관련 재정 공개를 있다.
Acknowledgments
이 공동 번역 상 연구 보조금 샌디에고 C3 박찬호 페달에 의해 자금 원인 (#PTC2017) 작동 RRW 지원을 받고 있다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ECM 830 square wave electroporator | Harvard Apparatus | BTX # 45-0002 ( 58018-004 ) | |
| 2 needle array electrode | Harvard Apparatus | 45-0167 | |
| Safety foot switch | Harvard Apparatus | 45-0211 | |
| Platinum Tweezer-trode | Harvard Apparatus | 45-0486 | |
| DMEM-F12 media | ThermoFisher Scientific | 11320-033 | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific | 10437028 | |
| Trypsin | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich, Inc. | 792632 | |
| Lacrilube | Fisher Scientific | 19090646 | |
| Buprenorphine | Fisher Scientific | NC1292810 | |
| D-luciferrin | Perkin Elmer | 122799 | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | 124262 | |
| Mouse strain C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 000664/Black 6 | |
| Cell line (KPC-Luc 4580) | J.J. Yeh Lab at University of North Carolina | ||
| BD Precisionglide syringe needles | Sigma-Aldrich, Inc. | Z192406 | |
| Alcohol Swab(70% isopropyl alcohol ) | BD | 326895 | |
| Digital calipers | ThermoFisher Scientific | 14-648-17 | |
| Disposable Scalpels, Sterile | VWR | 21909 | |
| Cotton Tipped Applicators | VWR | 89198 | |
| Suture Needle, 45 cm, Size 6-0 | Harvard Apparatus | 72-3308 | |
| Suture Needle, 45 cm, Size 4-0 | Harvard Apparatus | 72-3314 | |
| Povidone-iodine 10% | BD | 29900-404 | |
| Disposable Warming Pad | KENT SCIENTIFIC CORP. | TP-3E | |
| Mouse Hair Clipper | KENT SCIENTIFIC CORP. | CL8787 | |
| Surgical Drape | Harvard Apparatus | 59-7421 | |
| Phosphate-buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 10010023 |
References
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