Summary
Необратимой электропорации (IRE) является не термальная абляция метод, используемый для лечения местнораспространенного рака поджелудочной железы. Будучи относительно новой техники, плохо понимают последствия IRE на рост опухоли. Мы разработали модель сингенных мышь, которая облегчает изучение последствий IRE на рак поджелудочной железы.
Abstract
Рак поджелудочной железы (PC), болезнь, которая убивает около 40,000 пациентов каждый год в США, успешно уклоняется несколько терапевтические подходы, включая перспективные иммунотерапевтических стратегии. Необратимой электропорации (IRE) — это метод-термальная абляция, что вызывает гибель клеток опухоли без разрушения прилегающих коллагеновых структур, таким образом позволяя процедуры должны быть выполнены в очень близко к кровеносных сосудов опухоли. В отличие от методов тепловой абляции IRE приводит к гибели клеток постепенно apoptotic, наряду с непосредственной абляции индуцированной некроза и в настоящее время клинических используется для отдельных больных местнораспространенным ПК. Абляционного непромысловых конкретные процедуры как гнев может вызвать множество ответов в микроокружения опухоли. Несколько исследований были рассмотрены последствия IRE на рост опухоли в других типов опухолей, но ни одна были сосредоточены на ПК. Мы разработали сингенных мыши модель компьютера, в котором подкожно (SQ) и ортотопическая опухоли может быть успешно обращались с IRE в высоко контролируемых условиях, содействия различные процедуры post продольных исследований. Это животное модель служит надежной системы для изучения последствий IRE и путей улучшения клинической эффективности IRE.
Introduction
Протока поджелудочной железы аденокарцинома (PC) прогнозируется стать второй по значимости причиной смерти от рака в США вокруг 20201. Подавляющее большинство пациентов диагностированных с ПК в конечном итоге умирают от отдаленных метастазов2. PC микроокружения заведомо иммуносупрессивных и хемостойкие. Его desmoplastic стромы содержит нехватка эффектор (анти-опухолевых) Т-клеток и известность иммуносупрессивные лейкоцитов, включая связанный тумором макрофагов (ТАМС), миелоидной производных подавитель клетки (MDSCs), и регулирования T-клеток (Tregs)3 . В их основе лежат необходимость разрабатывать мультимодальной стратегии, позволяющие противодействовать эти эффекты микроокружения.
ГНЕВ был разработан как метод-термальная абляция опухолей. В отличие от методов тепловой абляции IRE не вызывает быстрое коагуляционное некроза, но вместо этого приводит к постепенному apoptotic клеток смерть4. Важно для опухолях поджелудочной железы IRE не подвержены воздействию «радиатор» и может быть выполнена рядом5кровеносные сосуды. Эта технология имеет 510(k) Распродажа от FDA6 и в настоящее время используется клинически, для отдельных пациентов с локально advanced или пограничным местнораспространённым раком поджелудочной железы. В крупнейших опубликованные серии IRE для PC7медиана выживаемости больных, перенесших IRE был приблизительно двойного выживания пациентов с современной химиотерапии без резекции8,9.
Несколько исследований показали, что тепловой абляции индуцирует системный иммунный ответ в других типах тумора (обзор в Чу et al. 10). радиочастотная абляция (РСР) в животных опухоли модели приводит к увеличению Т-клеток инфильтраты11,12, включая увеличение активированного природных убийца (НК) клетки в гепатоцеллюлярным раком пациентов13, 14и уменьшение иммуносупрессивной Tregs в больных раком легких15. Меньшее количество исследований изучили иммунной, microenvironmental и травмы ответы на IRE16. IRE было показано, чтобы стимулировать системный иммунный ответ в иммунокомпетентных мыши модели, в которых рост вторичных (контралатеральной) почечно-клеточной аллотрансплантантов был уменьшена или предотвращена IRE первичной опухоли две недели ранее17. Они также отметили, что иммунокомпетентных мышей требуется меньше напряжения для полной регрессии, чем у мышей. Предположили, что гнев может привести к презентации антигена улучшение, по сравнению с коагуляционное некроз тепловой абляции, но это не было специально изучал.
Мы разработали модель мышь сингенных ПК от линии клеток КЗК-Люк 4580 (подарок от J.J. Yeh в университете Северной Каролины), который был получен от опухоли, который разработан в мужской LSL-красG12D / +; LSL-Trp53R172H / +; PDX1Cre / +; LSL-ROSA26 Люк / + мыши, для изучения местных и системных эффектов IRE18,19. Эта линия клетки Люцифераза выражая иммуногенность и также онкогенной иммунокомпетентных мышей C57BL/6, когда вводят кв.км или orthotopically и надежно производит метастазов в печени, когда вводят в селезенке. Мы использовали генератор импульсов программируемый квадратные волны доставить 100 МКС импульсов электроэнергии в соотношении напряжения/расстояние 1500 V/см с помощью массива двух игла зонда (разделенных 5 мм) или Платиновый пинцет электрода кв.км или ортотопическая опухоли, соответственно, в мыши для моделирования последствий IRE в мелких животных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Всех животных эксперименты следующее, что этот протокол должны быть утверждены соответствующие институциональные животное уход и использование Комитет (IACUC). Все описанные здесь процедуры были одобрены IACUC UCSD.
1. приобретение получателей животных
Примечание: 4580 КЗК-Люк клеточная линия была создана из опухоли, возникающие в LSL-красG12D / +; LSL-Trp53R172H / +; PDX1Cre / +; LSL-ROSA26 Люк / + мышь (ККЗ), который представляет собой генетически модель PC на фоне C57BL/6. Преимуществом этой клеточной линии является, что она конститутивно выражает Люцифераза включение опухоли мониторинга в ортотопическая модели. Однако другие клеточные линии могут также использоваться до тех пор, как они совместимы с генетический фон получателя мышей.
- Заранее определите экспериментальных групп и количество животных для каждой группы.
- Выберите возраст (6 - 10 - неделя старый мышей рекомендуется) и секс животных, используются согласно гипотезе и клеточная линия используется.
2. Культура клетки
- Использование Дульбекко модифицированная орел среднего (DMEM): питательные смеси F12 (50: 50) средства массовой информации, содержащие 10% плода бычьим сывороточным (ФБС) и антибиотика пенициллина и стрептомицина 1% (полный рост СМИ) расти КЗК-Люк 4580 клетки.
- Если заморожен, оттепель клетки за 4 дня до имплантации опухоли.
- Рост клеток при 37 ° C с 5% CO2 и 95% влажности в асептических условиях.
- Trypsinize клетки с 0,25% трипсина 5 минут при 37 ° C, прежде чем они достигнут > 80% confluency и нейтрализовать трипсина, добавив два раза объем полного роста средств массовой информации.
Примечание: Эти клетки не устанавливают опухоли эффективно у мышей, если они используются на 100% confluency, или если они являются пассированной для более чем в 12 раз. Следовательно желательно заморозить клетки на предыдущих проходов под оптимальной confluency. - Подсчитать ячейки, используя Горяева и приступить к индукции опухоли, при наличии достаточного числа (0.5 - 1 х 106 клеток/мышь). Если нет, то расширить клетки за один проход еще до получения число адекватных клеток.
3. индукция кв опухолей
- Подготовить необходимые материалы: P1000 и P100 пипетки и советы, 1 мл шприц, 25G иглы, базальной мембраны матрица (BMM), DMEM базальной СМИ, 1,5 мл центрифуга трубы. Храните все материалы стерильные и холодной (4 ° C) до окончания процедуры. Также держать стрижки и алкоголя тампоны для использования животных.
- Trypsinize (согласно шаг 2.4) и подсчитать количество ячеек, Ресуспензируйте их в концентрации 2-4 x 107 клеток/мл холодного DMEM.
- Добавить равное количество 100% BMM сделать окончательный клеток подвеска в 50% BMM. Окончательный объем должен составлять 50 мкл суспензии клеток для каждой мыши требуется. Подготовка 10% сверх для размещения Мертвое пространство в шприц и дозирования ошибки.
- Аликвота подвеска в 550 томов мкл в 1,5 мл пробирок помещены во льду.
- Сдерживать животных (6 - старый неделю самцов мышей C57BL/6) с помощью Бокс оглушения или вручную.
Примечание: в качестве альтернативы, мышей может беспокоить с 2,5% изофлюрановая в газообразный кислород при скорости потока 2 Л/мин с помощью точности испарителем. - Бриться сайт инъекция, которая предпочтительно на фланге выше ногу, используя клипер. С помощью спиртом, очистите сайт инъекции дважды.
- Нарисуйте 250 мкл суспензии клеток в конечной концентрации 1-2 x 107 кл/мл в 1-мл холодной шприц и удалить все пузырьки воздуха, перемещая поршень вверх и вниз. Прикрепить 25G иглой шприца и убедитесь в том заполнить пространство внутри иглу.
- Осторожно вставьте иглу под кожу под углом 30° к телу возле бочки, убедившись, что игла не проколоть брюшной полости или мускулатуры конечностей.
- Придавить иглы параллельно телу и сгладить морщины на коже. Медленно вводить 50 мкл суспензии клеток. Удерживая иглу в месте инъекции для 10 s чтобы позволить BMM закрепить для предотвращения любой утечки.
- Медленно снять иглу, сохраняя параллельных без бокового движения. Осторожно очистите месте инъекции с спиртом и отпустите кнопку мыши для своего жилья.
Примечание: Если мышь была под наркозом во время процедуры, контролировать животное до тех пор, пока он восстанавливает ее восстанавливающих рефлексов. - Контролировать рост опухоли, регулярно при помощи штангенциркуля, пока он не достигнет 5 мм в диаметре.
4. индукция ортотопическая опухоли
- Подготовьте необходимые материалы. Автоклав хирургические инструменты такие как ножницы, скальпели, игла водителей и указал и плоским наконечником щипцы. Держите удобно стерильная швами (рассасывающиеся 6-0 и не рассасывающиеся 4-0), алкоголь тампоны, машинки для стрижки волос, депиляционный крем, глаза смазкой, хлопчатобумажной марли, 10% повидон-йод раствор, хирургические шторы, грелки, бупренорфина и анестетиков.
- Усыпить доноров мышь (желательно тот же фон, необходимых для модели ортотопическая) ношение SQ КЗК опухоли с помощью камеры медленно заливки CO2 . Акцизный кв опухоли тщательно в стерильных условиях в капюшоне BSL-2 с помощью стерильных щипцы и microscissors незадолго до имплантации ортотопическая. Во время иссечение опухоли заботиться не пункции брюшной полости и мыть опухоль сразу с 2 обмена стерильных PBS.
- С помощью стерильных скальпели, фарш подакцизным опухоли на 1 мм3 куски, разместить их на чашку Петри, содержащие холодного стерильного DMEM базальной СМИ и хранить на льду до имплантации.
- Администрировать получателей мыши 0,05 - 1 мг/кг бупренорфин анальгетик SQ, 30 мин до операции.
- Анестезировать получателя мышей с изофлюрановая 2-3% кислорода (2 Л/мин) с помощью точности испарителем (или других анестетиков). Держите мышь на 37 ° C, грелку для всей процедуры. Смазать глаза для предотвращения высыхания. Тест глубины анестезии отсутствием поразительные рефлекс первоначально и подтвердите хирургические плоскости анестезии, отсутствием педалей рефлекс щепотку нежные ноги. Поддержание анестезии во время всей хирургической процедуры.
- Поместите курсор мыши на его спине и осторожно поверните его правой стороне, так что подвергается в левой части живота. Удаление брюшной волос мыши, используя для удаления волос крем и чистой марлей, чтобы убедиться, что нет свободных волос входит должность разреза живота. Подготовьте левой части живота хирургии с использованием 3 циклов 10% повидон йод, следуют алкоголя салфетки для дезинфекции кожи.
- С помощью стерильным скальпель, сделайте 1,5 см поперечной или наклонный разрез в коже, 1-см слева от средней линии, ниже грудной клетки, слегка медиальнее селезенки. Затем Расширьте разрез через брюшной мускулатуры, зеркального отображения вышележащих поверхностный надрез.
- Найдите селезенки, с помощью плоского наконечником щипцы и осторожно извлечь его из брюшной полости. Убрать селезенки, используя аппликатор стерильным хлопка и найти хвост поджелудочной железы прилагается к нижней части селезенки.
- С плоским наконечником щипцы, отозвать боков хвост поджелудочной железы.
- Возьмите одну мелко рубленый опухоль кусок от доноров мыши с кончика иглы стерильные сшивающие штраф (6-0) и расположите его с помощью стерильный пинцет.
- В то время как нежно боково втягивания хвост/тела поджелудочной железы, Вставьте иглу шовный материал, содержащий фрагмент опухоли в хвост поджелудочной железы. Передайте шовные медленно через ткани, держа опухоли при контакте с хвоста поджелудочной железы. Примените один или два дополнительных швов в зависимости от ориентации фрагмента относительно ткани.
- Полностью удалите иглу из ткани и держать поджелудочной железы/селезенки экстернализации для дополнительных 60 s при осмотре для каких-либо признаков кровотечения или утечки. Затем усвоить их нежно в брюшную полость с помощью тупого щипцами.
- Закройте брюшной мускулатуры, с помощью 6-0 рассасывающиеся шовные либо с непрерывной или Прерванный строчки и вышележащих кожи с помощью 3-0 6-0 не рассасывающиеся шовные прерван. На данный момент прекратите анестезии.
- Позволяет мыши, чтобы восстановить свои дома клетке с бесплатным доступом к продовольствию и воде. Место клетку на грелку для облегчения восстановления. Мониторинг жизненно важных функций, таких как дыхание, перфузии и т.д., во время процесса восстановления.
- Подтвердите признаки выпрямляющий рефлекс, когда мышь восстанавливает, и затем вернуться клетка может регулярно жилья.
- Администрировать бупренорфин 0,05 - 0,1 мг/кг 8-12 ч после операции и каждые 8-12 ч после процедуры, необходимые для признаки боли.
- Контролировать рост опухоли с помощью биолюминесценции в естественных условиях , визуализации системы (см. Таблицу материалов).
- Следуют изображений, начиная на 4 день после имплантации ортотопическая опухолевого роста и выполнять изображений два раза в неделю.
- В день томографии, администрировать (внутрибрюшной инъекции) 30 мг/кг D-люциферин наркотизированных (2-3% изофлюрановая кислорода (2 Л/мин)) получателя мыши 10 мин до изображений.
- Изображение для Люцифераза активности с помощью параметра свечение без каких-либо выбросов фильтры для минимум 5 s воздействия в люминесценции Тепловизор с авто флуоресценции бесплатный Подогреваемый столик и сохраняя анестезии для мышей.
5. IRE кв опухолей
- Подготовить необходимые материалы: квадратные волны electroporator, ножной выключатель безопасности, электроды (игла массив против пинцет trode) и адаптеры. Держите стерильная швами (не рассасывающиеся 4-0), алкоголь тампоны, машинки для стрижки волос, депиляционный крем, глаза смазкой, хлопчатобумажной марли, бупренорфина и анестетиков неподалеку.
- Стерилизовать пинцет или игольчатые электроды массива с использованием газовой стерилизации. Автоклавирование не рекомендуется. Используйте стеклянный шарик стерилизатор для стерилизации электродов между животными.
- Администрировать бупренорфин 0,05 - 0,1 мг/кг для мышей опухоль подшипник 30 мин перед процедурой.
- Выполните шаги 4.4-4.5 навести анестезии в мышах успешно, после того, как имплантат кв опухоль достигает 5 мм в диаметре.
- Место наркотизированных мышь на его стороне для доступа к кв опухоль на фланге. Удаление волос с помощью Клипперс и чистую кожу с помощью спиртом.
- Для Квадратных опухоли используйте 2-игольная массива электродов. Поднять кожи непосредственно под узел опухоли, с помощью щипцов и вставьте электродов через кожу параллельно телу, убедившись, что они не проникают брюшной полости. Однажды через кожу, расположите электроды таким образом, что они кронштейн опухоли.
- Программа electroporator для доставки 100 МКС импульсов с частотой 1 Гц 1500 V/см в общей сложности 150 импульсов. Доставить импульсов с помощью ножной педали. Отделить каждый набор 10 импульсов на 10 сек, чтобы разрешить для рассеивания тепла и подтвердить правильное положение электродов.
Примечание: Без использования агентов, паралитический, мышей будут испытывать сужения мышцы с IRE, что может вызвать перемещение электродов, если вручную обеспеченных. - Снимите электроды после завершения дозирования, который не должен превышать 200 s. рекорд фактическое напряжение доставки, который отображается на electroporator. Разрешить мышей, чтобы восстановить следующие IRE согласно шаги 4.14-4.16.
6. IRE ортотопическая опухоли
Примечание: IRE опухолей ортотопическая включает в себя вторую операцию выживания на же мыши, таким образом, требует специального разрешения от местных IACUC перед началом.
- Подготовить необходимые материалы: Автоклав хирургические инструменты, такие как ножницы, скальпели, иглы драйверы, указал щипцами и плоские наконечником щипцы. Держите следующие поблизости также: стерильная швами (рассасывающиеся 6-0 и не рассасывающиеся 4-0), алкоголь тампоны, машинки для стрижки волос, депиляционный крем, глаза смазкой, хлопчатобумажной марли, 10% раствор повидон йод, хирургические шторы, грелки, квадратные волны electroporator, ножной выключатель безопасности, электроды и их адаптеров, бупренорфина и анестетиков.
- Оценивать мышей для ортотопическая опухолевого роста, в естественных условиях изображений (см. шаг 4.17) путем введения 30 мг/кг D-люциферин внутрибрюшинно.
Примечание: Ортотопическая опухоли являются идеальными для IRE лечения 8-10 дней поста имплантации при опухоли видны и по-прежнему ограничивается для поджелудочной железы, как видно на изображениях люминесценции Люцифераза (см. Результаты представитель). - Выполните шаги 4.4-4,9, чтобы найти имплантированных опухоли. Если опухоль не легко найти, используйте тупой носом щипцы для перемещения желудок и селезенка мягко выявить опухоль.
- Воплощать опухоли с тупым носом щипцами и захватить опухоль плотно с платиновыми электродами пинцет trode. Доставить электропорации импульсов, как запрограммирован на шаге 5.7, используя квадратные волны electroporator в наборах по 10 импульсов, контролируемых ножной переключатель.
- Держите опухоль экстернализации для по крайней мере 60 s пост IRE для отслеживания любых признаков кровотечения. Контролировать мыши до тех пор, пока он восстанавливает вставить опухоль в брюшной полости и закройте разрез как описано ранее (шаги 4.13-4.16).
- Мониторинг воздействия IRE на рост опухоли, с использованием в vivo Люцифераза визуализации в соответствии с шагом 4.17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы следовали процедуре описано выше и созданный опухоли кв.М на 5-6 неделе старых мышей C57BL/6 дикого типа прививанным с 1 x 106 клеток с 50% BMM. Когда размер опухоли достиг 5-6 мм в диаметре, несколько мышей были умерщвлены, их опухоли были подакцизным, имплантированных orthotopically получателя мышей C57BL/6. IRE был осуществляется 10 дней поста имплантации, как показано на шкале на рисунке 1. IRE была исполнена на остальных мышей, принимая кв опухоли.
В SQ опухоли, IRE напряжения и частоты пульса продолжительности были сдержаны постоянн на 1500 V/см и 100 МКС, соответственно, но количество импульсов разнообразны. Рисунок 2 показывает, что кв опухоли в нескольких мышей полностью регрессировали после 150 импульсов IRE, но не так хорошо с 75 импульсов. В общей сложности 4 из 9 мышей показало регрессии полный опухоли после 150 импульсов IRE. Гистологический анализ опухоль ткани 1 неделя пост IRE показал большие регионов некроза опухолей Центральной которые не были замечены в контроль без лечения опухолей. Это некротические ядро было окружении живой опухолевой ткани в случаях неполного опухоли регрессии (рис. 3). Успешной имплантации ортотопическая опухоли также было достигнуто, и темпы роста контролируется с помощью в vivo биолюминесценции изображений показаны опухоли на день 10 и 15 (рис. 4) день после имплантации. IRE на 150 импульсов также оказалось эффективным в ортотопическая опухоли (рис. 5) показаны снизили объемы опухоли. В целом эти результаты демонстрируют способность этой модели для имитации эффектов IRE в иммунокомпетентных мыши модели, тем самым обеспечивая платформу для тестирования различных условий IRE и комбинации для лечения ПК.
Рисунок 1 : Показывает схематическое изображение время курса опухоли имплантация и IRE. Для Квадратных опухоли IRE выполняется как только опухоль достигает 5-6 мм в диаметре. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Люцифераза биолюминесценции изображений показывает снижение в должность рост опухоли IRE кв модели. ККЗ-Люк клеточной линии конститутивно выражает Люцифераза, что делает его возможным для мониторинга роста опухоли в ответ IRE в режиме реального времени. День 14 биолюминесценции изображений пост IRE показывает полный регресс опухоли в одном из мышей лечение 150 импульсов IRE, тогда как неполные регрессии был замечен с 75 импульсов IRE, когда по сравнению с необработанными управления. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Гематоксилином и эозином опухолевой ткани показывает изменения в ткани архитектуры пост IRE. КВ опухоли, подвергается IRE показал большие регионы некроза централизованно, окружении регионов живой ткани, указывающее недостаточный охват IRE в некоторых случаях. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Биолюминесценции изображений показывает успешной имплантации ортотопическая опухоли и его рост с течением времени. Изображения были взяты с помощью коммерческого биолюминесценции изображений инструмент с люминесценции, захвачен в 1 мин экспозиции. Мышей вводили с 30 мг/кг D-люциферин решения внутрибрюшинно 10 мин до изображений. Мышей держали невосприимчивы с помощью изофлюрановая 2% во время процедуры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 : Гнев вызывает снижение роста опухоли в ортотопическая PC опухоли. (A) Bioluminescecnce изображения мышей, укрывательство ортотопическая PC показал снижение Люцифераза сигнал 7 дней после гнев по сравнению с липовые хирургии предлагая сократить бремя живых опухолевых результате IRE. (B) средний объем подакцизным опухоли ортотопическая (+ стандартная ошибка) управления мышей против мышей, которые прошли IRE. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом исследовании мы продемонстрировали модель иммунокомпетентных мышь для ПК, который может использоваться для изучения последствий IRE на рост опухоли. В настоящее время IRE используется как метод-термальная абляция только в весьма выбранной местнораспространенного PC пациентов, которые не имеют отдаленные болезни после месяцев предоперационной терапии. Его использование, поэтому, был ограниченным, потому что большинство больных местнораспространенным PC развивать отдаленных метастатической болезни20. Эта модель будет служить основой для исследования для оценки воздействия IRE на PC с использованием различных параметров расширенный лечения и комбинаций.
Наиболее важная вещь для рассмотрения в ходе протокол является размер опухоли, на котором выполняется IRE. Коммерчески доступных зондов для моделей мышей ограничены их расстояние между электродами (5-10 мм). Следовательно в опухоли значительно больше, чем расстояние между электродами, неполной абляции происходит. Для кв опухоли рекомендуется использовать 2-игольная массива электродов над пинцет электрода, как кожа, окружающих опухоль увеличивается сопротивление потоку тока в пинцет электрода. Ограничение размера массива 2-игольная электродов могут быть преодолены путем выполнения IRE на различных глубинах и углы в том же опухоли; Однако этот подход делает его трудным для лечения опухолей равномерно. Кроме того, для более больших туморов (до 10 мм), может быть надрез на коже ниже опухоли длиной чуть больше, чем диаметр опухоли. Опухоль может затем экстернализации через разрез, инвертирование вышележащих кожи с помощью щипцов. Затем опухоль можно лечить с помощью пинцет электрода, похож на ортотопическая опухоли, описанных выше. Electroporated опухоль может затем вставлена повторно под кожу и кожа зашивается с 4-0 не рассасывающиеся шовные как Прерванный стежком. Однако эффекты разрез может посрамить эффекты IRE, и мы обнаружили, что выполнение IRE при опухоли в пределах рабочее расстояние 2 игольная массива электродов (~ 5-6 мм) обеспечивает лучший стандартизации.
Независимо от подхода количество импульсов необходимо определить эмпирически в зависимости от типа опухоли. Опубликованные исследования использовали между 150-300 импульсов напряжения17. Однако мы определили оптимальное количество импульсов в эксперименте предварительный доза ответ. Есть модели для прогнозирования зоны полного абляции, основанный на напряжение и электродом расстояние, но типов опухолей может сильно варьироваться в кровоснабжения и фиброз, которые могут повлиять на ответ на электропорации21.
Каждый набор 10 импульсов была отделена от 10 s для того чтобы избежать Отопление эффекты, которые происходят, если слишком много импульсов доставляются слишком быстро. Чрезмерная лечения может привести к тепловой абляции, который может предотвратить Точная характеристика эффектов-тепловой IRE. 10 s интервал также позволяет нам подтвердить часто позиционирование электрода точно так как сужения мышцы может вызвать смещение электрода. Наши IACUC еще не допускается использование паралитический агентов в мелких животных, которые могут значительно уменьшить сокращения мышц во время IRE. В случае ортотопическая опухоли пинцет электрода позволяет нам держать плотно опухоли и имеют большую площадь поверхности электрода по сравнению с игольчатый электрод.
Хотя гнев в настоящее время используется только как процедура абляционного в клинических условиях, электропорация в целом имеет широкий спектр приложений, начиная от нервных и мышечных активаций для доставки различных препаратов и олигонуклеотидов. Тщательно анализируя патофизиологические изменения, происходящие во время и после IRE, с помощью этой модели, можно разработать множество терапевтических стратегий для ПК.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы имеют без соответствующих раскрытия финансовой информации.
Acknowledgments
Президент получил поддержку для это работать от совместных трансляционная исследовательский грант финансируется педаль Падрес Сан-Диего C3 причиной (#PTC2017).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ECM 830 square wave electroporator | Harvard Apparatus | BTX # 45-0002 ( 58018-004 ) | |
| 2 needle array electrode | Harvard Apparatus | 45-0167 | |
| Safety foot switch | Harvard Apparatus | 45-0211 | |
| Platinum Tweezer-trode | Harvard Apparatus | 45-0486 | |
| DMEM-F12 media | ThermoFisher Scientific | 11320-033 | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific | 10437028 | |
| Trypsin | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich, Inc. | 792632 | |
| Lacrilube | Fisher Scientific | 19090646 | |
| Buprenorphine | Fisher Scientific | NC1292810 | |
| D-luciferrin | Perkin Elmer | 122799 | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | 124262 | |
| Mouse strain C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 000664/Black 6 | |
| Cell line (KPC-Luc 4580) | J.J. Yeh Lab at University of North Carolina | ||
| BD Precisionglide syringe needles | Sigma-Aldrich, Inc. | Z192406 | |
| Alcohol Swab(70% isopropyl alcohol ) | BD | 326895 | |
| Digital calipers | ThermoFisher Scientific | 14-648-17 | |
| Disposable Scalpels, Sterile | VWR | 21909 | |
| Cotton Tipped Applicators | VWR | 89198 | |
| Suture Needle, 45 cm, Size 6-0 | Harvard Apparatus | 72-3308 | |
| Suture Needle, 45 cm, Size 4-0 | Harvard Apparatus | 72-3314 | |
| Povidone-iodine 10% | BD | 29900-404 | |
| Disposable Warming Pad | KENT SCIENTIFIC CORP. | TP-3E | |
| Mouse Hair Clipper | KENT SCIENTIFIC CORP. | CL8787 | |
| Surgical Drape | Harvard Apparatus | 59-7421 | |
| Phosphate-buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 10010023 |
References
- Rahib, L., et al. Projecting cancer incidence and deaths to 2030: the unexpected burden of thyroid, liver, and pancreas cancers in the United States. Cancer Res. 74 (11), 2913-2921 (2014).
- Howlader, N., et al. SEER Cancer Statistic Review, 1975-2013. , http://seer.cancer.gov/csr/1975_2013/ (1975).
- Clark, C. E., et al. Dynamics of the immune reaction to pancreatic cancer from inception to invasion. Cancer Res. 67 (19), 9518-9527 (2007).
- Lee, E. W., Loh, C. T., Kee, S. T. Imaging guided percutaneous irreversible electroporation: ultrasound and immunohistological correlation. Technol Cancer Res Treat. 6 (4), 287-294 (2007).
- Charpentier, K. P. Irreversible electroporation for the ablation of liver tumors: are we there yet? Arch Surg. 147 (11), 1053-1061 (2012).
- Narayanan, G. Irreversible Electroporation. Seminars in Interventional Radiology. 32 (4), 349-355 (2015).
- Martin, R. C. 2nd Treatment of 200 locally advanced (stage III) pancreatic adenocarcinoma patients with irreversible electroporation: safety and efficacy. Ann Surg. 262 (3), 486-494 (2015).
- Belfiore, M. P., et al. Percutaneous CT-guided irreversible electroporation followed by chemotherapy as a novel neoadjuvant protocol in locally advanced pancreatic cancer: Our preliminary experience. Int J Surg. 21 Suppl 1, S34-S39 (2015).
- Belfiore, G., et al. Concurrent chemotherapy alone versus irreversible electroporation followed by chemotherapy on survival in patients with locally advanced pancreatic cancer. Med Oncol. 34 (3), 38 (2017).
- Chu, K. F., Dupuy, D. E. Thermal ablation of tumours: biological mechanisms and advances in therapy. Nat Rev Cancer. 14 (3), 199-208 (2014).
- Wissniowski, T. T., et al. Activation of tumor-specific T lymphocytes by radio-frequency ablation of the VX2 hepatoma in rabbits. Cancer Res. 63 (19), 6496-6500 (2003).
- Eros de Bethlenfalva-Hora, C., et al. Radiofrequency ablation suppresses distant tumour growth in a novel rat model of multifocal hepatocellular carcinoma. Clin Sci (Lond). 126 (3), 243-252 (2014).
- Zerbini, A., et al. Radiofrequency thermal ablation for hepatocellular carcinoma stimulates autologous NK-cell response. Gastroenterology. 138 (5), 1931-1942 (2010).
- Ali, M. Y., et al. Activation of dendritic cells by local ablation of hepatocellular carcinoma. J Hepatol. 43 (5), 817-822 (2005).
- Fietta, A. M., et al. Systemic inflammatory response and downmodulation of peripheral CD25+Foxp3+ T-regulatory cells in patients undergoing radiofrequency thermal ablation for lung cancer. Hum Immunol. 70 (7), 477-486 (2009).
- Jiang, C., Davalos, R. V., Bischof, J. C. A review of basic to clinical studies of irreversible electroporation therapy. IEEE Trans Biomed Eng. 62 (1), 4-20 (2015).
- Neal, R. E. 2nd, et al. Improved local and systemic anti-tumor efficacy for irreversible electroporation in immunocompetent versus immunodeficient mice. PLoS One. 8 (5), e64559 (2013).
- Hingorani, S. R., et al. Trp53R172H and KrasG12D cooperate to promote chromosomal instability and widely metastatic pancreatic ductal adenocarcinoma in mice. Cancer Cell. 7 (5), 469-483 (2005).
- Safran, M., et al. Mouse reporter strain for noninvasive bioluminescent imaging of cells that have undergone Cre-mediated recombination. Mol Imaging. 2 (4), 297-302 (2003).
- Martin, R. C. 2nd, McFarland, K., Ellis, S., Velanovich, V. Irreversible electroporation in locally advanced pancreatic cancer: potential improved overall survival. Ann Surg Oncol. 20 Suppl 3, S443-S449 (2013).
- Neal, R. E., Garcia, P. A., Robertson, J. L., Davalos, R. V. Experimental Characterization and Numerical Modeling of Tissue Electrical Conductivity during Pulsed Electric Fields for Irreversible Electroporation Treatment Planning. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 59 (4), 1076-1085 (2012).
