Summary
Irreversibel elektroporation (IRE) er en ikke-termiske ablation teknik, der anvendes til behandling af lokalt fremskreden kræft i bugspytkirtlen. At være en forholdsvis ny teknik, er virkningerne af IRE på tumorvækst dårligt forstået. Vi har udviklet en syngeneic musemodel, der gør det lettere at studere virkningerne af IRE på kræft i bugspytkirtlen.
Abstract
Kræft i bugspytkirtlen (PC), en sygdom, der dræber ca 40.000 patienter hvert år i USA, har med held unddragne flere terapeutiske metoder, herunder de lovende immunterapeutisk strategier. Irreversibel elektroporation (IRE) er en ikke-termiske ablation teknik, der inducerer tumor celledød uden ødelæggelse af tilstødende kollagen strukturer, således at proceduren, der udføres i tumorer meget tæt på blodkarrene. I modsætning til termisk ablation teknikker, IRE resulterer i gradvis apoptotisk celledød, sammen med øjeblikkelig ablation induceret nekrose, og er i øjeblikket i klinisk brug for udvalgte patienter med lokalt Avanceret PC. En ablativ, ikke-målarter specifikke procedure som IRE kan fremkalde et utal af svar i tumor mikromiljø. Et par undersøgelser har behandlet IRE indvirkning på tumorvækst i andre tumortyper, men ingen har fokuseret på PC. Vi har udviklet en syngeneic musen model af PC hvor subkutan (SQ) og orthotopic tumorer held kan behandles med IRE i et stærkt kontrolleret indstilling, at lette forskellige longitudinelle studier post procedure. Dette dyr model fungerer som et robust system til at studere virkningerne af VREDE og metoder til at forbedre den kliniske effekt af IRE.
Introduction
Pancreas duktalt adenokarcinom (PC) forventes for at blive den næststørste årsag til kræftdødsfald i USA omkring 20201. Langt størstedelen af patienter diagnosticeret med PC vil til sidst dø fra fjern metastatisk sygdom2. PC mikromiljø er notorisk immunosuppressive og chemoresistant. Dens desmoplastic stroma indeholder en knaphed på effektor (anti-tumor) T-celler og en fremhævelse af immunosuppressive leukocytter, herunder tumor-associerede makrofager (TAMs), myeloid afledte suppressor celler (MDSCs) og regulerende T-celler (Tregs)3 . Disse ligge til grund for behovet for at udvikle multimodale strategier, der modvirker disse virkninger af mikromiljø.
IRE er blevet udviklet som en ikke-termisk metode til tumor ablation. I modsætning til termisk ablation teknikker, IRE forårsager ikke hurtig coagulative nekrose, men i stedet resulterer i gradvis apoptotiske celle død4. Vigtigere for pancreas tumorer, IRE er ikke sårbar over for "heat sink" effekter og kan udføres lige ved siden af blodkar5. Denne teknologi har 510 clearance fra FDA6 og i øjeblikket bliver brugt klinisk, til udvalgte patienter med lokalt fremskreden eller borderline resektable kræft i bugspytkirtlen. I den største publicerede serie af IRE for PC7var den mediane overlevelse for patienter, der gennemgår IRE ca dobbelt overlevelse af patienter behandlet med moderne kemoterapi alene uden resektion8,9.
Flere undersøgelser har vist, der termisk ablation inducerer et systemisk immunrespons i andre tumortyper (gennemgik i Chu et al. 10). radiofrekvens ablation (RFA) i animalsk tumor modeller fører til øget T celle infiltreret11,12, herunder en stigning i aktiverede natural killer (NK) celler i hepatocellulært kræft patienter13, 14, og et fald i immunosuppressive Tregs i lunge cancer patienter15. Et langt mindre antal studier har undersøgt immun, microenvironmental, og skade svar til IRE16. IRE har vist sig at stimulere en systemisk immunrespons i immunkompetente musemodeller hvor væksten af sekundære (kontralaterale) renal celle allografts blev reduceret eller forhindret af IRE af en primær tumor to uger tidligere17. De bemærkede også at immunkompetente mus kræves mindre spænding for komplet regression end gjorde immunkompromitterede mus. Det har været en hypotese at VREDE kan resultere i forbedrede antigen præsentation i forhold til den coagulative nekrose af termisk ablation, men dette er ikke blevet specifikt undersøgt.
Vi har udviklet en syngeneic musen model af PC fra KPC-Luc 4580 cellelinje (gave fra J.J. Yeh ved University of North Carolina), som var afledt af en tumor, der er udviklet i en mandlig LSL-KrasG12D / +; LSL-Trp53R172H / +; PDX1Cre / +; LSL-ROSA26 Luc / + mus, at studere de lokale og systemiske virkninger af IRE18,19. Denne luciferase-udtrykker cellelinie er immunogen og også tumorfremkaldende hos immunkompetente C57BL/6 mus når injiceres SQ eller orthotopically og pålideligt producerer lever metastaser når injiceres i milten. Vi har udnyttet en programmerbar firkantbølge pulse generator til at levere 100 µs impulser af elektricitet på en spænding/distance forholdet mellem 1.500 V/cm ved hjælp af en to-nål array sonde (adskilt af 5 mm) eller platin pincet-trodes at SQ eller orthotopic tumorer, henholdsvis i mus til at modellere virkningerne af IRE i et lille dyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg udført følgende denne protokol skal godkendes af de respektive institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC). Alle procedurer beskrevet her er blevet godkendt af IACUC UCSD.
1. skaffe modtagerens dyr
Bemærk: KPC-Luc 4580 celle line blev etableret fra en svulst, der opstår i en LSL-KrasG12D / +; LSL-Trp53R172H / +; PDX1Cre / +; LSL-ROSA26 Luc / + mus (KPC), som er en genetisk manipuleret model af PC på en C57BL/6 baggrund. Fordelen ved denne cellelinje er, at det constitutively udtrykker luciferase-enabling tumor kontrol i orthotopic modeller. Andre cellelinjer kan dog også bruges, så længe de er forenelige med den genetiske baggrund for de modtagende mus.
- Bestemme de eksperimentelle grupper og antallet af dyr pr. gruppe på forhånd.
- Vælge alder (6 - 10 - uge gamle mus anbefales) og sex af forsøgsdyr ifølge hypotesen og cellelinie anvendes.
2. kultur celler
- Brug Dulbecco ændrede eagle medium (DMEM): næringsstof blanding F12 (50/50) medier indeholdende 10% føtal bovint serum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin antibiotikum (komplet vækst medier) til at vokse KPC-Luc 4580 celler.
- Hvis de er frosset, tø cellerne 4 dage før tumor implantation.
- Vokse celler ved 37 ° C med 5% CO2 og 95% fugtighed under aseptiske forhold.
- Trypsinize celler med 0,25% Trypsin i 5 min ved 37 ° C før de når > 80% confluency og neutralisere trypsin ved at tilføje dobbelte volumen af komplet vækst medier.
Bemærk: Disse celler ikke etablerer tumorer effektivt i mus hvis de bruges på 100% confluency, eller hvis de er passaged for mere end 12 gange. Derfor er det tilrådeligt at fryse celler på tidligere passager under optimale confluency. - Tælle celler ved hjælp af en hemocytometer og Fortsæt til tumor induktion, hvis tilstrækkelig mange er til stede (0,5 - 1 x 106 celler/mus). Hvis ikke, udvide celler for en mere passage, indtil passende celle numre er opnået.
3. induktion af SQ tumorer
- Forbered de nødvendige materialer: P1000 og P100 pipetter og tips, 1 mL sprøjte, 25G nåle, basalmembranen matrix (BMM), DMEM basal medier, 1,5 mL centrifugeres rør. Holde alle materialer steril og kold (4 ° C) indtil slutningen af proceduren. Også holde hårklippemaskiner og alkohol svaberprøver klar til brug af dyr.
- Trypsinize (ifølge trin 2.4) og tælle cellerne, og pelleten dem ved en koncentration på 2-4 x 107 celler/mL af kolde DMEM.
- Tilføje et lige saa stort volumen af 100% BMM at gøre en sidste cellesuspension i 50% BMM. Den endelige mængden skulle beløbe sig til 50 µL af cellesuspension til hver mus påkrævet. Forberede 10% i overskud til at rumme det døde rum i sprøjten og for pipettering fejl.
- Alikvot suspension 550 µL mængder i 1,5 mL centrifugeglas anbringes i isen.
- Dy dyr (6 - uger gamle mandlige C57BL/6 mus) ved hjælp af en Tilbageholderen eller manuelt.
Bemærk: Alternativt mus kan være anaesthetized med 2,5% isofluran i ilt gas med en væskehastighed på 2 L/min ved hjælp af en præcision vaporizer. - Barbere injektionsstedet, som helst på en flanke over et ben, bruger en clipper. Bruger en spritserviet, rense injektionsstedet to gange.
- Tegne 250 µL af cellesuspension i en endelig koncentration på 1-2 x 107 celler/mL i en 1 mL koldt sprøjte og fjern eventuelle luftbobler ved at flytte stemplet op og ned. Lægger en 25G kanyle på sprøjten og sørg for at fylde plads inden for nålen.
- Omhyggeligt sæt nål under huden på en 30° vinkel på kroppen nær flanker, og sørg for, at nålen ikke punkteres bughulen eller muskulatur af lemmerne.
- Flade nålen parallelt med kroppen, og flade rynker på huden. Langsomt injicere 50 µL af cellesuspension. Hold nålen på injektionsstedet til 10 s at tillade BMM størkne for at forebygge enhver lækage.
- Langsomt trække nålen holder det parallelle uden nogen sideværts bevægelse. Forsigtigt rense injektionsstedet med en spritserviet og slip musen til sin bolig.
Bemærk: Hvis musen var anesthetized under proceduren, overvåge dyret indtil det genvinder sin oprettende reflekser. - Overvåge vækst af tumor regelmæssigt ved hjælp af calipre, indtil den når 5 mm i diameter.
4. induktion af Orthotopic tumorer
- Forbered de nødvendige materialer. Autoklave den kirurgiske værktøjer såsom saks, skalpel, nål drivere, og pegede og flade-tippet pincet. Holde handy sterilt suturmateriale (resorberbare 6-0 og ikke-resorberbare 4-0), alkohol podninger, hårklippemaskiner, depilatory fløde, øje lubricant, bomuld gaze, 10% povidon-jodopløsning, kirurgisk gardiner, varmepuder, buprenorphin og bedøvelsesmiddel agenter.
- Aflive en donor mus (fortrinsvis af den samme baggrund kræves til orthotopic model) transporterer en SQ KPC tumor ved hjælp af en langsom fyld CO2 kammer. Punktafgifter SQ tumor omhyggeligt under sterile forhold i BSL-2 hætte ved hjælp af steril pincet og microscissors kort før orthotopic implantation. Under tumor excision passe på ikke at punktere bughulen og vaske tumor straks med 2 udveksling af steril PBS.
- Ved hjælp af steril skalpel, hakkekød skåret tumor i 1 mm3 stykker, læg dem på en petriskål, der indeholder kold sterile DMEM basal medier og opbevare på is indtil implantation.
- Administrere modtagere musen 0,05 - 1 mg/kg buprenorphin smertestillende SQ, 30 min før kirurgi.
- Bedøver recipient mus med 2-3% isofluran i ilt (2 L/min) ved hjælp af en præcision vaporizer (eller andre bedøvende stoffer). Holde mus på en 37 ° C varme pad under hele proceduren. Anvende smøremiddel til øjne til at forhindre udtørring. Test dybde af anæstesi ved manglende overraskende refleks i første omgang, og bekræft kirurgisk flyet anæstesi ved manglen på pedal refleks til en blid tå knivspids. Opretholde bedøvelse under hele den kirurgiske procedure.
- Placer musen på ryggen og forsigtigt slå det til sin højre side, således at den venstre side af maven er udsat. Fjerne abdominal hår af musen bruger depilatory creme og rense med gaze at sikre ingen gratis hår træder maven post indsnit. Forberede operation ved hjælp af 3 cyklusser af 10% povidon-jod efterfulgt af alkohol klude til at desinficere huden venstre maven.
- Med en steril skalpel, lave en 1,5 cm tværgående eller skrå snit i huden, 1 cm til venstre for midterlinjen, under brystkassen, lidt mediale til milten. Derefter, udvide snit gennem mave muskulaturen, spejling den overliggende overfladiske indsnit.
- Find milten ved hjælp af flad spids pincet og forsigtigt externalize det fra bughulen. Trække milten ved hjælp af en steril bomuld applikator, og finde halen i bugspytkirtlen knyttet til bunden af milten.
- Bruger flade-tippet pincet, trække halen i bugspytkirtlen sideværts.
- Afhente en fint hakket tumor stykke fra donor mus med spidsen af en bøde (6-0) sterile suturing nål og Placer den ved hjælp af steril pincet.
- Mens forsigtigt tilbagetrækningskraften hale og krop i bugspytkirtlen lateralt, indsætte nålen af sutur med tumor fragment i halen i bugspytkirtlen. Pass suturen langsomt gennem væv, holde tumor i kontakt med pancreas halen. Anvende en eller to ekstra suturer afhængigt af det fragment orientering i forhold til væv.
- Fjern nålen helt fra vævet og holde bugspytkirtlen/milten externalized for en yderligere 60 s mens inspektion for tegn på blødning eller lækage. Derefter, internalisere dem forsigtigt ind i bughulen bruger stump pincet.
- Luk abdominal muskulaturen ved hjælp af en 6-0 resorberbar sutur med enten en kontinuert eller afbrudt søm, og luk den overliggende hud ved hjælp af en 3-0 til 6-0 ikke-resorberbare afbrudt sutur. Afbryde anæstesi på dette punkt.
- Tillad musen til at inddrive i sit hjem bur med fri adgang til mad og vand. Sted i buret på en varmepude at lette genvinding. Overvåge vitale tegn såsom vejrtrækning, perfusion etc., under gendannelsesprocessen.
- Bekræfte tegn på oprettende refleks, når musen genopretter, og derefter vende tilbage i buret kan til en almindelig bolig.
- Administrere buprenorphin 0,05 - 0,1 mg/kg 8-12 efter operationen, og hver 8-12 timer efter proceduren, som er nødvendig for tegn på smerte.
- Overvåge tumorvækst ved hjælp af en i vivo bioluminescens imaging system (Se Tabel af materialer).
- Følg tumorvækst af imaging starter på dag 4 efter orthotopic implantation, og udføre imaging to gange om ugen.
- På dagen for billedbehandling, administrere (intraperitoneal injektion) 30 mg/kg D-luciferin til en bedøvede (2-3% isofluran i ilt (2 L/min)) recipient mus 10 min før billeddannelse.
- Billede for luciferase aktivitet ved hjælp af indstillingen luminescence uden nogen emissions filtre for et minimum af 5 s eksponering i en luminescence imager med auto-fluorescens gratis opvarmet scene og samtidig bibeholde anæstesi til mus.
5. IRE af SQ tumorer
- Forbered de nødvendige materialer: firkantet bølge electroporator, sikkerhed fodkontakt, elektroder (nål array versus pincet-trode) og adaptere. Holde sterilt suturmateriale (ikke-resorberbare 4-0), alkohol podninger, hårklippemaskiner, depilatory fløde, øje lubricant, bomuld gaze, buprenorphin og anæstetika også i nærheden.
- Sterilisere pincet eller nål array elektroder bruger gas sterilisation. Autoklavering anbefales ikke. Bruge et glas perle sterilizer for at sterilisere elektroder mellem dyr.
- Administrere buprenorphin 0,05 - 0,1 mg/Kg til tumor-bærende mus 30 min før proceduren.
- Følg trin 4.4-4.5 for at kunne fremkalde anæstesi i mus når SQ tumor implantatet når 5 mm diameter.
- Opstille den bedøvede mus på sin side at få adgang til den SQ tumor på flanken. Fjerne hår ved hjælp af neglesaks og ren hud ved hjælp af en spritserviet.
- SQ tumorer, bruge 2-nål array elektroder. Løfte huden direkte under tumor websted ved hjælp af pincet og indsætte elektroder gennem huden parallelt med kroppen gør sikker på, at de ikke trænge ind i bughulen. En gang gennem huden, Placer elektroderne på en sådan måde, at de beslag tumor.
- Programmet electroporator til at levere 100 µs pulser med en hyppighed på 1 Hz på 1500 V/cm til et samlet beløb af 150 impulser. Levere impulser ved hjælp af fodpedalen. Adskille hvert sæt af 10 pulser af 10 s, for at give mulighed for varmeafledning og bekræfte den korrekte position af elektroderne.
Bemærk: Uden brug af paralytisk agenter, mus vil opleve muskelsammentrækninger med VREDE, der kan forårsage forskydning af elektroderne, medmindre manuelt sikret. - Fjern elektroder efter komplet dosering, der ikke bør overstige 200 s. registrere den faktiske spænding leveres, som vises på electroporator. Tillad mus hen til genoprette følgende IRE pr. trin 4.14-4.16.
6. IRE af Orthotopic tumorer
Bemærk: IRE af orthotopic tumorer indebærer en anden overlevelse kirurgi på den samme mus, hvilket kræver særlig godkendelse fra lokale IACUC før begyndelsen.
- Forberede krævede materialer: autoklave de kirurgiske værktøjer såsom saks, skalpel, nål drivere, pegede pincet, og flad spids pincet. Husk følgende i nærheden samt: sterilt suturmateriale (resorberbare 6-0 og ikke-resorberbare 4-0), alkohol podninger, hårklippemaskiner, depilatory fløde, øje lubricant, bomuld gaze, 10% povidon-jodopløsning, kirurgisk gardiner, varmepuder, firkantet bølge electroporator, sikkerhed fodkontakt, elektroder og deres adaptere, buprenorphin og anæstetika.
- Vurdere mus for orthotopic tumorvækst af i vivo billeddannelse (Se trin 4.17) ved at indsprøjte 30 mg/kg af D-Luciferin intraperitoneal.
Bemærk: Orthotopic tumorer er ideel til IRE behandling 8 til 10 dage post implantation, når tumorer er klart synlig og stadig begrænset til bugspytkirtlen som kan ses på de Luciferase luminescence billeder (Se Repræsentant resultater). - Følg trin 4.4-4,9, for at finde den indopererede tumor. Hvis tumor ikke er let at finde, bruge stump næse pincet til at flytte mave og milt forsigtigt at identificere tumor.
- Externalize tumor med stump næse pincet og fange tumor tæt med pincet-trode platin elektroder. Levere elektroporation bælgfrugter som programmeret i trin 5.7 brug af firkantet bølge electroporator i sæt af 10 impulser kontrolleret af fodkontakten.
- Holde tumor externalized for mindst 60 s indlæg IRE at kontrollere for tegn på blødning. Indsæt tumor tilbage ind i bughulen og lukke snit som beskrevet tidligere (trin 4.13-4.16) og overvåge musen, indtil den genindvinder.
- Overvåge virkningerne af IRE på tumorvækst ved hjælp af i vivo luciferase imaging pr. trin 4.17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi fulgt proceduren beskrevet ovenfor og genereret SQ tumorer på 5-6 ugers gammel vildtype C57BL/6 mus podet med 1 x 106 celler med 50% BMM. Når tumorstørrelse nåede 5-6 mm i diameter, et par af mus blev aflivet, deres tumorer blev skåret ud og implanteret orthotopically i en modtagende C57BL/6 mus. IRE var udført 10 dage post implantation som vist i tidslinjen på figur 1. IRE blev udført på de resterende mus forsynet med SQ tumorer.
SQ tumorer, IRE spænding og puls varighed blev holdt konstant på 1500 V/cm og 100 µs, henholdsvis, men antallet af pulser varierede. Figur 2 viser, at de SQ tumorer i et par mus svandt helt efter 150 pulser af VREDE, men ikke så godt med 75 impulser. I alt 4 ud af 9 mus viste fuldstændig tumorregression efter 150 pulser af IRE. Histologiske analyse af tumor væv 1 uge post IRE viste store regioner i central tumor nekrose, ikke blev set i styre ubehandlet tumorer. Dette nekrotiske kerne var flankeret af levende tumor væv i tilfælde af ufuldstændige tumorregression (figur 3). Vellykket implantation af orthotopic tumor blev også opnået, og vækstraten var overvåges ved hjælp af i vivo bioluminescens imaging viser tumor på dag 10 og dag 15 (figur 4) efter implantation. IRE på 150 pulser viste sig også at være effektive i orthotopic tumorer (figur 5) viser reduceret tumor diskenheder. Samlet, disse resultater viser evne til denne model for at simulere virkningerne af IRE i en immunkompetente musemodel, hvilket giver en platform for at teste forskellige IRE betingelser og kombinationer at behandle PC.
Figur 1 : Skematisk fremstilling viser den tidsforløb af tumor implantation og IRE. For SQ tumorer udføres IRE så snart tumor når 5-6 mm i diameter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Luciferase-bioluminescens imaging viser en reduktion i tumor vækst post IRE i SQ model. KPC-Luc cellelinie udtrykker constitutively luciferase, hvilket gør det muligt at overvåge tumorvækst svar på IRE i realtid. Dag 14 bioluminescens imaging post IRE viser den fuldstændige regression af tumor i et af mus behandlet med 150 pulser af IRE, mens ufuldstændige regression blev set med 75 pulser af IRE sammenlignet med ubehandlet kontrol. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Hæmatoxylin og eosin pletter af tumor væv viser ændringerne i væv arkitektur post IRE. SQ tumorer udsat for IRE viste store regioner i nekrose centralt, omgivet af regioner i levende væv, der angiver utilstrækkelig IRE dækning i nogle tilfælde. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Bioluminescens imaging viser den succesfulde implantation af orthotopic tumor og dens vækst over tid. Billeder blev taget ved hjælp af en kommerciel bioluminescens imaging instrument med luminescens fanget på 1 min eksponering. Musene blev sprøjtet med 30 mg/kg af D-luciferin løsning intraperitoneal 10 min før billeddannelse. Mus blev holdt bedøvet ved hjælp af 2% isofluran under proceduren. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : IRE inducerer tumor vækst reduktion i orthotopic PC tumorer. (A) Bioluminescecnce billeder af mus husly orthotopic PC viste reduceret luciferase signal 7 dage efter IRE sammenlignet med humbug kirurgi tyder på reduceret live tumor byrde som følge af IRE. (B) gennemsnitlige volumen af skåret orthotopic tumorer (standardfejl) in + kontrol mus vs mus, der undergik IRE. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne undersøgelse, har vi vist en immunkompetente musemodel for PC, der kan bruges til at studere virkningerne af IRE på tumorvækst. I øjeblikket, bliver IRE brugt som en ikke-termiske ablation teknik kun i yderst valgte lokalt Avanceret PC patienter, der ikke har Fjern sygdomsprogression efter måneder af præoperativ behandling. Dets anvendelse har derfor været begrænset, fordi de fleste patienter med lokalt Avanceret PC udvikle Fjern metastatisk sygdom20. Denne model vil tjene som grundlag for undersøgelser for at evaluere virkningerne af IRE på PC ved hjælp af forskellige forlænget behandling parametre og kombinationer.
Det mest vigtige ting at overveje under protokollen er størrelsen af tumor som IRE udføres. De kommercielt tilgængelige sonder til mus modeller er begrænset af deres elektrode afstanden (5-10 mm). Derfor, i tumorer betydeligt større end elektrode afstanden, inkomplet ablation finder sted. For SQ tumorer anbefales 2-nål array elektroder over pincet-trodes som huden omkring tumor øger modstand til strømmen af nuværende i pincet-trodes. Begrænsning af 2-nål array elektroder kan overvindes ved at udføre IRE på forskellige dybder og vinkler i samme tumor; denne tilgang gør det imidlertid vanskeligt at behandle tumorer ensartet. Alternativt, for større tumorer (op til 10 mm), et snit kan gøres på huden under tumor til en lidt længere end tumor diameter længde. Tumor kan derefter externalized gennem incisionen af invertere den overliggende hud med pincet. Tumor kan derefter behandles med pincet-trodes, svarende til de orthotopic tumorer beskrevet ovenfor. Electroporated tumor kan derefter blive genindsat under huden, og huden sutureres med en 4-0 ikke-resorberbare sutur som en afbrudt stitch. Men virkningerne af incisionen kan forvirre virkningerne af IRE, og vi har fundet, at udføre IRE når tumorer er inden for 2-nål array elektroder arbejde afstand (~ 5-6 mm) giver den bedste standardisering.
Uanset tilgang skal antallet af pulser bestemmes empirisk afhængigt af tumor. Offentliggjorte undersøgelser har udnyttet mellem 150-300 pulser på denne spænding17. Men vi besluttet det optimale antal pulser i en indledende dosis-respons eksperiment. Der er modeller til at forudsige zonen af komplet ablation baseret på spænding og elektrode afstanden, men tumortyper kan variere meget i vaskularisering og fibrose, der kan påvirke svar på elektroporation21.
Hvert sæt af 10 impulser var adskilt af 10 s for at undgå de varme virkninger, der opstår, hvis alt for mange pulser leveres for hurtigt. Overdreven behandling kan resultere i termisk ablation, som kan forhindre korrekt karakterisering af effekterne af ikke-termiske IRE. 10 s intervallet også giver os ofte bekræfte elektrode placering præcist da muskelsammentrækninger kan forårsage elektrode forskydning. Vores IACUC har ikke endnu tilladt brugen af paralytisk agenter i små dyr, som kan reducere muskelsammentrækninger under IRE. I tilfælde af orthotopic tumorer tillader pincet-trodes os at holde tumorer stramt og har en større elektrode areal i forhold til nål-elektrode.
Selvom IRE er i øjeblikket kun bruges som en ablativ procedure i de kliniske omgivelser, elektroporation generelt har et bredt spektrum af applikationer lige fra nerve og muskel aktiveringer til levering af forskellige stoffer og oligonukleotider. Ved omhyggeligt at analysere de patofysiologiske forandringer under og efter IRE ved hjælp af denne model, er det muligt at udvikle utallige terapeutiske strategier til PC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen relevante finansielle oplysninger.
Acknowledgments
RRW har modtaget støtte for dette arbejde fra Collaborative Translationel forskning tilskud finansieret af San Diego C3 Padres Pedal årsag (#PTC2017).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ECM 830 square wave electroporator | Harvard Apparatus | BTX # 45-0002 ( 58018-004 ) | |
| 2 needle array electrode | Harvard Apparatus | 45-0167 | |
| Safety foot switch | Harvard Apparatus | 45-0211 | |
| Platinum Tweezer-trode | Harvard Apparatus | 45-0486 | |
| DMEM-F12 media | ThermoFisher Scientific | 11320-033 | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific | 10437028 | |
| Trypsin | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich, Inc. | 792632 | |
| Lacrilube | Fisher Scientific | 19090646 | |
| Buprenorphine | Fisher Scientific | NC1292810 | |
| D-luciferrin | Perkin Elmer | 122799 | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | 124262 | |
| Mouse strain C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 000664/Black 6 | |
| Cell line (KPC-Luc 4580) | J.J. Yeh Lab at University of North Carolina | ||
| BD Precisionglide syringe needles | Sigma-Aldrich, Inc. | Z192406 | |
| Alcohol Swab(70% isopropyl alcohol ) | BD | 326895 | |
| Digital calipers | ThermoFisher Scientific | 14-648-17 | |
| Disposable Scalpels, Sterile | VWR | 21909 | |
| Cotton Tipped Applicators | VWR | 89198 | |
| Suture Needle, 45 cm, Size 6-0 | Harvard Apparatus | 72-3308 | |
| Suture Needle, 45 cm, Size 4-0 | Harvard Apparatus | 72-3314 | |
| Povidone-iodine 10% | BD | 29900-404 | |
| Disposable Warming Pad | KENT SCIENTIFIC CORP. | TP-3E | |
| Mouse Hair Clipper | KENT SCIENTIFIC CORP. | CL8787 | |
| Surgical Drape | Harvard Apparatus | 59-7421 | |
| Phosphate-buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 10010023 |
References
- Rahib, L., et al. Projecting cancer incidence and deaths to 2030: the unexpected burden of thyroid, liver, and pancreas cancers in the United States. Cancer Res. 74 (11), 2913-2921 (2014).
- Howlader, N., et al. SEER Cancer Statistic Review, 1975-2013. , http://seer.cancer.gov/csr/1975_2013/ (1975).
- Clark, C. E., et al. Dynamics of the immune reaction to pancreatic cancer from inception to invasion. Cancer Res. 67 (19), 9518-9527 (2007).
- Lee, E. W., Loh, C. T., Kee, S. T. Imaging guided percutaneous irreversible electroporation: ultrasound and immunohistological correlation. Technol Cancer Res Treat. 6 (4), 287-294 (2007).
- Charpentier, K. P. Irreversible electroporation for the ablation of liver tumors: are we there yet? Arch Surg. 147 (11), 1053-1061 (2012).
- Narayanan, G. Irreversible Electroporation. Seminars in Interventional Radiology. 32 (4), 349-355 (2015).
- Martin, R. C. 2nd Treatment of 200 locally advanced (stage III) pancreatic adenocarcinoma patients with irreversible electroporation: safety and efficacy. Ann Surg. 262 (3), 486-494 (2015).
- Belfiore, M. P., et al. Percutaneous CT-guided irreversible electroporation followed by chemotherapy as a novel neoadjuvant protocol in locally advanced pancreatic cancer: Our preliminary experience. Int J Surg. 21 Suppl 1, S34-S39 (2015).
- Belfiore, G., et al. Concurrent chemotherapy alone versus irreversible electroporation followed by chemotherapy on survival in patients with locally advanced pancreatic cancer. Med Oncol. 34 (3), 38 (2017).
- Chu, K. F., Dupuy, D. E. Thermal ablation of tumours: biological mechanisms and advances in therapy. Nat Rev Cancer. 14 (3), 199-208 (2014).
- Wissniowski, T. T., et al. Activation of tumor-specific T lymphocytes by radio-frequency ablation of the VX2 hepatoma in rabbits. Cancer Res. 63 (19), 6496-6500 (2003).
- Eros de Bethlenfalva-Hora, C., et al. Radiofrequency ablation suppresses distant tumour growth in a novel rat model of multifocal hepatocellular carcinoma. Clin Sci (Lond). 126 (3), 243-252 (2014).
- Zerbini, A., et al. Radiofrequency thermal ablation for hepatocellular carcinoma stimulates autologous NK-cell response. Gastroenterology. 138 (5), 1931-1942 (2010).
- Ali, M. Y., et al. Activation of dendritic cells by local ablation of hepatocellular carcinoma. J Hepatol. 43 (5), 817-822 (2005).
- Fietta, A. M., et al. Systemic inflammatory response and downmodulation of peripheral CD25+Foxp3+ T-regulatory cells in patients undergoing radiofrequency thermal ablation for lung cancer. Hum Immunol. 70 (7), 477-486 (2009).
- Jiang, C., Davalos, R. V., Bischof, J. C. A review of basic to clinical studies of irreversible electroporation therapy. IEEE Trans Biomed Eng. 62 (1), 4-20 (2015).
- Neal, R. E. 2nd, et al. Improved local and systemic anti-tumor efficacy for irreversible electroporation in immunocompetent versus immunodeficient mice. PLoS One. 8 (5), e64559 (2013).
- Hingorani, S. R., et al. Trp53R172H and KrasG12D cooperate to promote chromosomal instability and widely metastatic pancreatic ductal adenocarcinoma in mice. Cancer Cell. 7 (5), 469-483 (2005).
- Safran, M., et al. Mouse reporter strain for noninvasive bioluminescent imaging of cells that have undergone Cre-mediated recombination. Mol Imaging. 2 (4), 297-302 (2003).
- Martin, R. C. 2nd, McFarland, K., Ellis, S., Velanovich, V. Irreversible electroporation in locally advanced pancreatic cancer: potential improved overall survival. Ann Surg Oncol. 20 Suppl 3, S443-S449 (2013).
- Neal, R. E., Garcia, P. A., Robertson, J. L., Davalos, R. V. Experimental Characterization and Numerical Modeling of Tissue Electrical Conductivity during Pulsed Electric Fields for Irreversible Electroporation Treatment Planning. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 59 (4), 1076-1085 (2012).
