Summary
Hvor electroporation (irsk) er en ikke-termisk ablasjon teknikk som brukes for behandling av lokalt avansert kreft i bukspyttkjertelen. Å være en relativt ny teknikk, er effekten av IRE på tumor vekst dårlig forstått. Vi har utviklet en syngeneic musemodell som forenkler studere effekten av IRE på kreft i bukspyttkjertelen.
Abstract
Bukspyttkjertelkreft (PC), en sykdom som dreper ca 40 000 pasienter hvert år i USA, har med hell unngått flere terapeutiske metoder inkludert lovende immunterapeutisk strategier. Hvor electroporation (irsk) er en ikke-termisk ablasjon teknikk som induserer svulst celledød uten ødeleggelse av tilstøtende collagenous strukturer, dermed muliggjør prosedyren utføres i svulster nær blodkar. I motsetning til termisk ablasjon teknikker, IRE resulterer i gradvis apoptotisk celledød, sammen med umiddelbar ablasjon forårsaket nekrose, og er i klinisk bruk for pasienter med lokalt avansert PC. En ablative, ikke mål bestemt prosedyre som IRE kan indusere en myriade av svar i svulst microenvironment. Noen studier har adressert effekten av IRE på tumor vekst i andre svulst typer, men ingen har fokusert på PC. Vi har utviklet en syngeneic musemodell av PC subcutaneous (SQ) og orthotopic svulster kan bli vellykket behandlet med IRE i kontrollerte omgivelser, tilrettelegge ulike longitudinelle studier innlegget prosedyren. Denne dyr modellen fungerer som et robust system for å studere virkningene av IRE og måter å forbedre kliniske effekten av IRE.
Introduction
Bukspyttkjertelen ductal adenocarcinoma (PC) er anslått for å bli den nest største årsaken til kreftdødsfall i USA rundt 20201. Det store flertallet av pasientene med diagnosen PC vil til slutt dø fra fjerntliggende metastatisk sykdom2. PC microenvironment er notorisk suppressive og chemoresistant. Dens desmoplastic stroma inneholder en knapphet på effektor (anti-tumor) T celler og primærfaktor på suppressive leukocytter, inkludert svulst-assosiert makrofager (TAMs) myelogen avledede suppressor cellene (MDSCs) og regulatoriske T celler (Tregs)3 . Disse ligge bak behovet å utvikle flere strategier som motvirke effektene av microenvironment.
IRSK er utviklet som en ikke-termisk svulst ablasjon. Termisk ablasjon teknikker, IRE forårsaker ikke rask coagulative nekrose men i stedet fører til gradvis apoptotisk celle død4. Viktigere for bukspyttkjertelen svulster, IRE er ikke utsatt for "varmeleder" effekter og kan utføres ved blodkar5. Denne teknologien har 510(k) klaring fra FDA6 og brukes klinisk for pasienter med lokalt avansert eller borderline resectable bukspyttkjertelkreft. I den største publiserte serien av IRE for PC7var median overlevelse av pasienter som gjennomgår IRE omtrent dobbelt overlevelse av pasienter behandlet med moderne kjemoterapi alene uten resection8,9.
Flere studier har vist at termisk ablasjon induserer en systemisk immunrespons i andre svulst typer (omtalt i Chu et al. 10). radiofrekvens ablasjon (RFA) i dyr svulst modeller fører til økt T celle infiltrerer11,12, inkludert aktivert naturlig killer (NK) celler i hepatocellulært kreft pasienter13, 14, og en nedgang i suppressive Tregs i lunge kreft pasienter15. En mye mindre antall studier har undersøkt immune, microenvironmental, og skaden svar til IRE16. IRSK har vist seg å stimulere en systemisk immunrespons i immunkompetente musen modeller som veksten av sekundær (kontralateral) nyre celle allografts ble redusert eller hindret av IRE av en primære svulst to uker tidligere17. De har også observert at immunkompetente mus kreves mindre spenning for komplett regresjon enn immunsupprimerte mus. Det har vært hypotese at IRE kan føre til forbedret antigen presentasjon sammenlignet med det coagulative nekrose av termisk ablasjon, men dette har ikke vært spesielt studert.
Vi har utviklet en syngeneic musemodell av PC fra KPC-Luc 4580 celle linje (gave fra JJ Yeh ved University of North Carolina), som var avledet fra en svulst som utviklet seg i en mannlig LSL-KrasG12D / +; LSL-Trp53R172H / +; PDX1grobunn / +; LSL-ROSA26 Luc / + mus, å studere de lokale og systemiske effektene av IRE18,19. Luciferase-uttrykke celle linjen er immunogenic og også tumorigenic i immunkompetente C57BL/6-mus når injisert SQ eller orthotopically og pålitelig gir leveren metastaser når injiseres i milten. Vi har benyttet en programmerbar firkantbølge puls generator for å levere 100-µs pulser av strøm i spenning/distanse forholdet 1500 V/cm med en to-nål matrise sonde (atskilt med 5 mm) eller platina tweezer-trodes å kvadrat eller orthotopic svulster, i mus modell effektene av IRE i en liten dyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk utført følgende denne protokollen må godkjennes av respektive institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC). Alle prosedyrene som er beskrevet her er godkjent av IACUC UCSD.
1. skaffe mottaker dyr
Merk: KPC-Luc 4580 celle linjen ble opprettet av en svulst som oppstår i en LSL-KrasG12D / +; LSL-Trp53R172H / +; PDX1grobunn / +; LSL-ROSA26 Luc / + mus (KPC), som er en genmodifisert modell av PC på C57BL/6 bakgrunn. Fordelen med denne cellen linjen er at det constitutively uttrykker luciferase-aktivere svulst overvåking orthotopic modeller. Andre linjer kan imidlertid også brukes så lenge de er kompatible med genetisk bakgrunn av mottakeren mus.
- Bestemme eksperimentelle gruppene og antall dyr per gruppe på forhånd.
- Velg en alder (6 - 10 - uke gamle mus anbefales) og sex av dyrene brukes hypotesen og celle linjen brukes.
2. kultur celler
- Bruk Dulbecco modifiserte eagle medium (DMEM): næringsstoff blanding F12 (50/50) mediet som inneholder 10% fosterets bovin serum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin antibiotika (komplett vekst medier) å vokse KPC-Luc 4580 celler.
- Hvis frosset, tine cellene 4 dager før svulsten implantasjon.
- Vokse cellene på 37 ° C med 5% CO2 og 95% fuktighet under aseptiske forhold.
- Trypsinize cellene med 0,25% Trypsin i 5 min på 37 ° C før de når > 80% confluency og nøytralisere trypsin ved å legge til to ganger volumet fullstendig vekst medier.
Merk: Disse cellene ikke etablere svulster effektivt i mus hvis de brukes på 100% confluency eller hvis de er passaged for mer enn 12 timene. Derfor er det tilrådelig å fryse cellene på tidligere passasjer under optimale confluency. - Telle celler ved hjelp av en hemocytometer og videre til tumor induksjon Hvis tilstrekkelig tall (0,5 - 1 x 106 celler/mus). Hvis ikke, utvide celler for en mer passasje til tilstrekkelig cellen tallene er oppnådd.
3. induksjon av SQ svulster
- Forberede materialer som kreves: P1000 og P100 Pipetter og tips, 1-mL sprøyte, 25G nåler, kjelleren membran matrix (BMM), DMEM basale media, 1.5-mL sentrifuge rør. Holde alle materialer sterile og kalde (4 ° C) til slutten av prosedyren. Også holde hårklippere og alkohol vattpinner dyr brukes.
- Trypsinize (i trinn 2.4) og telle celler, og resuspend dem i en konsentrasjon av 2-4 x 107 celler/mL kaldt DMEM.
- Legge til en lik volum på 100% BMM å gjøre en siste celle suspensjon i 50% BMM. Det siste bindet skal beløpe seg til 50 µL av cellen suspensjon for hver mus kreves. Forberede 10% i overkant å imøtekomme døde plassen i sprøyten og for pipettering feil.
- Aliquot suspensjon i 550 µL volumer i 1,5 mL sentrifuge rør plassert i isen.
- Holde dyrene (6 - uke gamle mannlige C57BL/6 mus) bruker en restrainer eller manuelt.
Merk: Alternativt mus kan være anaesthetized med 2,5% isoflurane i oksygen gass på en flow rate på 2 L/min med en presisjon vaporizer. - Barbere injeksjonsstedet, som helst på en flanke over en etappe, bruker en clipper. Bruker en alkoholholdige vattpinnen, rengjør injeksjonsstedet to ganger.
- Tegn 250 µL av cellen suspensjon i en siste konsentrasjon av 1-2 x 107 celler/mL i en 1-mL kaldt sprøyte og fjern eventuelle luftbobler ved å flytte stempelet opp og ned. Knytte en 25G nål til sprøyten og kontroller for å fylle rommet i nålen.
- Nøye sette inn nålen under huden i 30° vinkel til kroppen nær flankene, sørge for at nålen ikke pierce bukhulen eller muskulatur av lemmer.
- Flat nålen parallelt med kroppen, og flat rynker på huden. Sakte injisere 50 µL av cellen suspensjon. Holde nålen på injeksjonsstedet for 10 å tillate BMM å stivne for å hindre eventuell lekkasje.
- Sakte trekke nålen holder den parallelle uten noen sidelengs bevegelse. Forsiktig rengjøre injeksjonsstedet med en alkoholholdige vattpinnen og slipp musen til kabinettet.
Merk: Hvis musen var anesthetized under prosedyren, overvåke dyret inntil det gjenvinner sin rettende reflekser. - Overvåke veksten av svulsten jevnlig bruker calipers før den når 5 mm i diameter.
4. induksjon av Orthotopic svulster
- Forberede materialer som kreves. Autoclave den kirurgiske verktøy som saks, skalpeller, nål drivere, og pekte og flat-tipped tang. Holde hendig sterile suturer (absorberbare 6-0 og ikke-absorberbare 4-0), alkohol vattpinner, hårklippere, depilatory fløte, øye smøremiddel, bomull gasbind, 10% povidon joden løsning, kirurgisk gardiner, oppvarming pads, buprenorfin og bedøvende agenter.
- Euthanize en donor mus (fortrinnsvis av samme bakgrunnen kreves for orthotopic modellen) bærer en SQ KPC svulst med en langsom fyll CO2 kammer. Avgiftsdirektoratet SQ svulsten nøye under sterile forhold i BSL-2 hette sterilt tang og microscissors kort tid før orthotopic implantasjon. Under svulst excision ta vare ikke å punktere bukhulen og vaske svulsten umiddelbart med 2 utveksling av sterile PBS.
- Bruker sterilt skalpeller, hakke forbrukeravgift svulst i 1 mm3 stykker, plassere dem i en Petriskål inneholder kald sterilt DMEM basale media og lagre på is før implantasjon.
- Administrere mottaker musen 0,05 - 1 mg/kg buprenorfin smertestillende SQ, 30 min før kirurgi.
- Bedøve mottaker mus med 2-3% isoflurane i oksygen (2 L/min) bruker en presisjon vaporizer (eller andre bedøvende agenter). Holde mus på en 37 ° C varmeputen for helheten av prosedyren. Bruke smøremiddel øynene for å hindre uttørking. Test dybden av anestesi av mangel på oppsiktsvekkende refleks først, og bekrefte kirurgisk flyet anestesi for pedal refleks til mild tå knipe. Opprettholde anestesi under hele kirurgiske prosedyren.
- Plasser musen på ryggen og forsiktig slår den til høyre side slik at venstre side av magen er utsatt. Fjern abdominal håret musen bruker depilatory fløte og Rengjør med gasbind å sikre ikke gratis hår kommer inn i magen innlegget snitt. Forberede venstre magen kirurgi med 3 sykluser av 10% povidon jod etterfulgt av alkohol wipes for å desinfisere huden.
- Bruke sterilt skalpell, lage en 1,5 cm tvers eller skrå snitt i huden, 1 cm til venstre for midtlinjen, under brystkasse, litt mediale til milten. Enda mer i snitt gjennom abdominal muskulatur, speiling den overliggende overfladiske snittet.
- Finn milten bruker flat tippet tang og forsiktig externalize det fra bukhulen. Trekke milten bruker en steril bomull applicator, og finne halen av bukspyttkjertelen festet til undersiden av milten.
- Bruker flate-tipped tang, trekke halen av bukspyttkjertelen sidelengs.
- Plukke opp en fint hakket svulst stykke fra donor musen med spissen av en fin (6-0) sterilt suturing nål og plassere den ved hjelp av sterile pinsett.
- Mens forsiktig trekke halen/kroppen i bukspyttkjertelen sidelengs, kan du sette inn nålen av suture som inneholder svulst fragment i halen av bukspyttkjertelen. Passere suture sakte gjennom vev, holde svulst i kontakt med bukspyttkjertelen halen. Bruke en eller to ekstra suturer avhengig av fragmentets retning i forhold til vevet.
- Fjern nålen helt fra vevet og holde bukspyttkjertelen/milten eksternaliserte for en ekstra 60 s mens inspiseres for noen tegn til blødning eller lekkasje. Deretter internalisere dem forsiktig inn i bukhulen bruker sløv tang.
- Lukk abdominal muskulatur med en 6-0 absorberbare Sutur med enten en kontinuerlig eller avbrutt maske, og Lukk overliggende huden med en 3-0 til 6-0 ikke-absorberbare avbrutt Sutur. Avslutte av bedøvelsen på dette punktet.
- La musen for å gjenopprette i buret sitt hjem med fri tilgang til mat og vann. Plass byrået på en varmeputen å lette. Overvåke vitale som puster, perfusjon etc., under gjenopprettingsprosessen.
- Bekreft skilting av rettende refleks når musen gjenoppretter, og gå deretter tilbake byrået kan til vanlige boliger.
- Administrere buprenorfin 0,05 - 0,1 mg/kg 8-12 h etter operasjonen, og hver 8-12 h etter inngrepet behov for underskriver av smerte.
- Overvåke tumor vekst med en i vivo bioluminescens tenkelig system (se Tabell for materiale).
- Følg tumor vekst av imaging starter på dag 4 etter orthotopic implantasjon, og utføre imaging to ganger i uken.
- På dagen for bildebehandling, administrere (intraperitoneal injeksjon) 30 mg/kg D-luciferin til en bedøvet (2-3% isoflurane i oksygen (2 L/min)) mottaker musen 10 min før bildebehandling.
- Bilde for luciferase aktivitet ved å bruke innstillingen luminescence uten utslipp filtre i minst 5 s avsøring inne en luminescence imager med auto-fluorescens gratis oppvarmet scenen og samtidig opprettholde anestesi for mus.
5. gå av SQ svulster
- Forberede materialer som kreves: square wave electroporator, sikkerhet fotbryteren, elektroder (nål matrise versus tweezer-trode) og adaptere. Holde sterile suturer (ikke-absorberbare 4-0), alkohol vattpinner, hårklippere, depilatory fløte, øye smøremiddel, bomull gasbind, buprenorfin og bedøvelse i nærheten.
- Sterilisere tweezer eller p matrise elektroder med gass-sterilisering. Autoklavering anbefales ikke. Bruk et glass bead sterilisere for å sterilisere elektrodene mellom dyr.
- Administrere buprenorfin 0,05 - 0,1 mg/Kg til tumor rentebærende mus 30 min før prosedyren.
- Følg trinnene 4.4-4.5 å lykkes indusere anestesi i mus når SQ svulst implantatet når 5 mm i diameter.
- Plass bedøvet musen på siden til SQ svulst på flanken. Fjerne håret avklipt og rense huden med en alkoholholdige vattpinnen.
- SQ svulster, bruke 2-nål matrise elektroder. Heve huden direkte under svulst området ved hjelp av pinsett og sett elektrodene gjennom huden parallelt med kroppen gjør at de ikke trenge gjennom bukhulen. En gang gjennom huden, plasser elektrodene slik at de braketten svulsten.
- Programmet electroporator å levere 100 µs pulser med en frekvens på 1 Hz ved 1500 V/cm til sammen 150 pulser. Levere pulser med fotpedal. Skill hvert sett av 10 pulser med 10 s, for å tillate varmespredning og bekrefte riktig posisjon av elektrodene.
Merk: Uten bruk av lam agenter, mus vil oppleve muskelsammentrekninger med IRE som kan forårsake forskyvning av elektrodene med mindre manuelt sikret. - Fjerne elektrodene etter fullført dosering, som ikke bør overstige 200 s. posten den faktiske spenningen levert, som vises på electroporator. Tillate at mus til å gjenopprette etter IRE per trinn 4.14-4,16.
6. gå av Orthotopic svulster
Merk: IRE av orthotopic svulster innebærer en andre overleve kirurgi på samme musen dermed krever spesiell godkjenning fra lokale IACUC før du begynner.
- Forbered nødvendig materiale: autoclave kirurgiske verktøy som saks, skalpeller, nål drivere, spiss tang og flat tippet tang. Ha følgende i nærheten samt: sterile suturer (absorberbare 6-0 og ikke-absorberbare 4-0), alkohol vattpinner, hårklippere, depilatory fløte, øye smøremiddel, bomull gasbind, 10% povidon joden løsning, kirurgisk gardiner, oppvarming pads, firkantbølge electroporator, sikkerhet fotbryteren, elektroder og adaptere, buprenorfin og bedøvelse.
- Vurdere mus for orthotopic tumor vekst av i vivo tenkelig (se trinn 4.17) ved å injisere 30 mg/kg av D-Luciferin intraperitoneally.
Merk: Den orthotopic svulst er ideelle for IRE behandling 8 til 10 dager innlegget implantasjon når tumorer er tydelig og fortsatt begrenset til bukspyttkjertelen som kan sees på Luciferase luminescence bilder (se Representant resultater). - Følg trinnene 4.4-4.9, å finne implantert svulsten. Hvis svulsten ikke er lett å finne, bruke sløv nosed tang flytte mage og milt forsiktig å identifisere svulsten.
- Externalize svulst med sløv nosed tang og fange svulsten tett med platina elektrodene på tweezer-trode. Levere electroporation pulser som programmert i trinn 5.7 bruker firkantbølge electroporator sett av 10 pulser kontrollert av fotbryteren.
- Holde svulsten eksternaliserte for minst 60 s innlegg IRE å overvåke noen tegn til blødning. Sett inn svulsten tilbake i bukhulen og stenger incision som beskrevet tidligere (trinn 4.13-4.16) og overvåke musen til gjenoppretter.
- Overvåke effekten av IRE på tumor vekst med i vivo luciferase imaging per trinn 4.17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi fulgte fremgangsmåten beskrevet ovenfor og generert SQ svulster på 5-6 uke gamle wild type C57BL/6 mus inokulert med 1 x 106 celler med 50% BMM. Når tumor størrelse 5-6 mm i diameter, noen av musene ble euthanized, deres tumorer ble fjernet, og implantert orthotopically i en mottaker C57BL/6-mus. IRSK var utført 10 dager innlegget implantasjon som vises i tidslinjen på figur 1. IRSK ble utført på de resterende mus bærer SQ svulster.
SQ svulster, hele IRE spenning og puls ble holdt konstant på 1500 V/cm og 100 µs, henholdsvis, men antall pulser variert. Figur 2 viser at SQ tumorer i noen mus regressed helt etter 150 pulser av IRE, men ikke så godt med 75 pulser. Totalt 4 av 9 mus viste fullstendig tumor regresjon etter 150 pulser av IRE. Histologiske analyse av tumor vev 1 uke innlegget IRE viste store områder av sentrale tumor nekrose som ikke ble sett i styre ubehandlet svulster. Denne nekrotisk kjernen var flankert av live tumor vev i tilfeller av ufullstendige tumor regresjon (Figur 3). Vellykkede implantasjon orthotopic svulst ble også oppnådd, og veksten ble overvåket med i vivo bioluminescens imaging viser svulst på 10 og dagen 15 (Figur 4) etter implantasjon. IRSK på 150 pulser også vist seg å være effektive i orthotopic svulster (figur 5) viser redusert svulst volumer. Samlet sett disse resultatene viser evne til denne modellen for å simulere effektene av irsk i en immunkompetente musemodell, og dermed gir en plattform for å teste ulike IRE forhold og kombinasjoner å behandle PC.
Figur 1 : Skjematisk fremstilling viser den gang løpet av svulst implantasjon og IRE. For SQ svulster utføres IRE snarest svulsten når 5-6 mm i diameter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Luciferase-bioluminescens imaging viser en reduksjon i tumor vekst innlegg IRE i SQ modell. KPC-Luc celle linje uttrykker constitutively luciferase gjør det mulig å overvåke tumorveksten svar IRE i sanntid. Dag 14 bioluminescens imaging innlegget IRE viser komplett regresjon av svulst i en av musene behandlet med 150 pulser av irsk, mens ufullstendig regresjon ble sett 75 pulser av IRE sammenlignet med kontrollen ubehandlet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Hematoxylin og eosin flekker av tumor vev viser endringene i vev arkitekturen post IRE. SQ svulster utsatt for IRE viste store regioner av nekrose sentralt, omgitt av regioner av levende vev som indikerer manglende IRE dekning i noen tilfeller. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Bioluminescens imaging viser den vellykkede implantasjon av orthotopic svulst og dens vekst over tid. Bildene ble tatt med en kommersiell bioluminescens tenkelig maskinen med luminescence fanget på 1 min eksponering. Musene ble injisert med 30 mg/kg av D-luciferin løsning intraperitoneally 10 min før bildebehandling. Mus ble holdt anaesthetized med 2% isoflurane under prosedyren. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : IRE induserer tumor vekst reduksjon i orthotopic PC svulster. (A) Bioluminescecnce bilder av mus skjuler orthotopic PC viste redusert luciferase signal 7 dager etter IRE sammenlignet med humbug kirurgi tyder på redusert live svulst byrden som følge av IRE. (B) mener volum av forbrukeravgift orthotopic svulster (+ standardfeil) i kontroll mus vs mus som gjennomgikk IRE. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne studien har vi vist en immunkompetente musemodell for PC som kan brukes til å studere virkningene av IRE på tumor vekst. Foreløpig brukes IRE som en ikke-termisk ablasjon teknikk bare i svært lokalt avansert PC pasienter som ikke har Fjern sykdomsprogresjon etter måneder med preoperativ terapi. Bruk derfor er begrenset fordi de fleste pasienter med lokalt avansert PC utvikle fjerntliggende metastatisk sykdom20. Denne modellen vil fungere som grunnlag for studier for å vurdere effekten av IRE på PC ved hjelp av ulike utvidet behandling parametere og kombinasjoner.
Det viktigste å vurdere under protokollen er størrelsen på svulst som IRE utføres. Kommersielt tilgjengelige sonder for mus modeller er begrenset av deres elektrode avstand (5-10 mm). Derfor foregår svulster betydelig større enn avstanden elektrode, ufullstendig ablasjon. For SQ svulster anbefales bruk av 2-nål matrise elektroder over tweezer-trodes som huden rundt tumor øker motstanden til flyt av tweezer-trodes. Størrelsesbegrensningen av 2-nål matrise elektrodene kan overvinnes ved å gå på ulike dyp og vinkler i samme svulsten; men gjør denne tilnærmingen det vanskelig å behandle svulster jevnt. Alternativt, for større svulster (opptil 10 mm), et snitt kan gjøres på huden under svulsten til en lengde som er litt lengre enn svulst diameter. Svulsten kan deretter bli eksternaliserte gjennom snittet ved å snu overliggende huden ved hjelp av pinsett. Svulsten kan deretter behandles med tweezer-trodes, ligner orthotopic svulstene beskrevet ovenfor. Electroporated svulsten kan deretter settes under huden og huden sutured med en 4-0 ikke-absorberbare Sutur som en avbrutt maske. Men effekten av innsnitt kan forvirre effekten av IRE, og vi har funnet at å utføre IRE når tumorer er innenfor arbeidsavstand av to-nål matrise elektrodene (~ 5-6 mm) gir den beste standardiseringen.
Uansett tilnærming må antall pulser bestemmes empirisk avhengig svulst. Publiserte studier har utnyttet mellom 150-300 pulser på denne spenningen17. Imidlertid bestemt vi det optimale antallet pulser i en innledende dose-respons-eksperiment. Det finnes modeller forutsi sonen i fullstendig ablasjon basert på spenning og elektroden avstand, men svulst typer kan variere i vascularity og fibrosis, som kan påvirke svaret electroporation21.
Hvert sett med 10 pulser var atskilt med 10 s for å unngå varme effekten som oppstår hvis for mange pulser leveres for fort. Over behandling kan føre til termisk ablasjon, som kan forhindre nøyaktig karakteristikk av virkningen av ikke-termisk IRE. 10 s intervallet også tillater oss å bekrefte ofte elektrode posisjonering nøyaktig siden muskelsammentrekninger kan forårsake elektrode forskyvning. Våre IACUC har ennå ikke tillatt bruk av lam agenter i små dyr som kan sterkt redusere muskelsammentrekninger under IRE. Ved orthotopic svulster tillater tweezer-trodes oss å holde svulstene tett og har en større elektrode overflate område sammenlignet med nål elektroden.
Selv om IRE er bare brukt som en ablative prosedyre i klinisk setting, electroporation generelt har et bredt spekter av programmer, alt fra nerve- og muskelsmerter aktiveringer levering av ulike narkotika og oligonucleotides. Ved nøye analysere patofysiologiske endringene skjer under og etter IRE bruker denne modellen, er det mulig å utvikle utallige strategier for PC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen relevante finansielle opplysninger.
Acknowledgments
RRW har fått støtte for dette arbeid fra et samarbeidsprosjekt translasjonsforskning forskningsstipend finansiert av San Diego C3 Padres pedalen årsak (#PTC2017).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ECM 830 square wave electroporator | Harvard Apparatus | BTX # 45-0002 ( 58018-004 ) | |
| 2 needle array electrode | Harvard Apparatus | 45-0167 | |
| Safety foot switch | Harvard Apparatus | 45-0211 | |
| Platinum Tweezer-trode | Harvard Apparatus | 45-0486 | |
| DMEM-F12 media | ThermoFisher Scientific | 11320-033 | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific | 10437028 | |
| Trypsin | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich, Inc. | 792632 | |
| Lacrilube | Fisher Scientific | 19090646 | |
| Buprenorphine | Fisher Scientific | NC1292810 | |
| D-luciferrin | Perkin Elmer | 122799 | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | 124262 | |
| Mouse strain C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 000664/Black 6 | |
| Cell line (KPC-Luc 4580) | J.J. Yeh Lab at University of North Carolina | ||
| BD Precisionglide syringe needles | Sigma-Aldrich, Inc. | Z192406 | |
| Alcohol Swab(70% isopropyl alcohol ) | BD | 326895 | |
| Digital calipers | ThermoFisher Scientific | 14-648-17 | |
| Disposable Scalpels, Sterile | VWR | 21909 | |
| Cotton Tipped Applicators | VWR | 89198 | |
| Suture Needle, 45 cm, Size 6-0 | Harvard Apparatus | 72-3308 | |
| Suture Needle, 45 cm, Size 4-0 | Harvard Apparatus | 72-3314 | |
| Povidone-iodine 10% | BD | 29900-404 | |
| Disposable Warming Pad | KENT SCIENTIFIC CORP. | TP-3E | |
| Mouse Hair Clipper | KENT SCIENTIFIC CORP. | CL8787 | |
| Surgical Drape | Harvard Apparatus | 59-7421 | |
| Phosphate-buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 10010023 |
References
- Rahib, L., et al. Projecting cancer incidence and deaths to 2030: the unexpected burden of thyroid, liver, and pancreas cancers in the United States. Cancer Res. 74 (11), 2913-2921 (2014).
- Howlader, N., et al. SEER Cancer Statistic Review, 1975-2013. , http://seer.cancer.gov/csr/1975_2013/ (1975).
- Clark, C. E., et al. Dynamics of the immune reaction to pancreatic cancer from inception to invasion. Cancer Res. 67 (19), 9518-9527 (2007).
- Lee, E. W., Loh, C. T., Kee, S. T. Imaging guided percutaneous irreversible electroporation: ultrasound and immunohistological correlation. Technol Cancer Res Treat. 6 (4), 287-294 (2007).
- Charpentier, K. P. Irreversible electroporation for the ablation of liver tumors: are we there yet? Arch Surg. 147 (11), 1053-1061 (2012).
- Narayanan, G. Irreversible Electroporation. Seminars in Interventional Radiology. 32 (4), 349-355 (2015).
- Martin, R. C. 2nd Treatment of 200 locally advanced (stage III) pancreatic adenocarcinoma patients with irreversible electroporation: safety and efficacy. Ann Surg. 262 (3), 486-494 (2015).
- Belfiore, M. P., et al. Percutaneous CT-guided irreversible electroporation followed by chemotherapy as a novel neoadjuvant protocol in locally advanced pancreatic cancer: Our preliminary experience. Int J Surg. 21 Suppl 1, S34-S39 (2015).
- Belfiore, G., et al. Concurrent chemotherapy alone versus irreversible electroporation followed by chemotherapy on survival in patients with locally advanced pancreatic cancer. Med Oncol. 34 (3), 38 (2017).
- Chu, K. F., Dupuy, D. E. Thermal ablation of tumours: biological mechanisms and advances in therapy. Nat Rev Cancer. 14 (3), 199-208 (2014).
- Wissniowski, T. T., et al. Activation of tumor-specific T lymphocytes by radio-frequency ablation of the VX2 hepatoma in rabbits. Cancer Res. 63 (19), 6496-6500 (2003).
- Eros de Bethlenfalva-Hora, C., et al. Radiofrequency ablation suppresses distant tumour growth in a novel rat model of multifocal hepatocellular carcinoma. Clin Sci (Lond). 126 (3), 243-252 (2014).
- Zerbini, A., et al. Radiofrequency thermal ablation for hepatocellular carcinoma stimulates autologous NK-cell response. Gastroenterology. 138 (5), 1931-1942 (2010).
- Ali, M. Y., et al. Activation of dendritic cells by local ablation of hepatocellular carcinoma. J Hepatol. 43 (5), 817-822 (2005).
- Fietta, A. M., et al. Systemic inflammatory response and downmodulation of peripheral CD25+Foxp3+ T-regulatory cells in patients undergoing radiofrequency thermal ablation for lung cancer. Hum Immunol. 70 (7), 477-486 (2009).
- Jiang, C., Davalos, R. V., Bischof, J. C. A review of basic to clinical studies of irreversible electroporation therapy. IEEE Trans Biomed Eng. 62 (1), 4-20 (2015).
- Neal, R. E. 2nd, et al. Improved local and systemic anti-tumor efficacy for irreversible electroporation in immunocompetent versus immunodeficient mice. PLoS One. 8 (5), e64559 (2013).
- Hingorani, S. R., et al. Trp53R172H and KrasG12D cooperate to promote chromosomal instability and widely metastatic pancreatic ductal adenocarcinoma in mice. Cancer Cell. 7 (5), 469-483 (2005).
- Safran, M., et al. Mouse reporter strain for noninvasive bioluminescent imaging of cells that have undergone Cre-mediated recombination. Mol Imaging. 2 (4), 297-302 (2003).
- Martin, R. C. 2nd, McFarland, K., Ellis, S., Velanovich, V. Irreversible electroporation in locally advanced pancreatic cancer: potential improved overall survival. Ann Surg Oncol. 20 Suppl 3, S443-S449 (2013).
- Neal, R. E., Garcia, P. A., Robertson, J. L., Davalos, R. V. Experimental Characterization and Numerical Modeling of Tissue Electrical Conductivity during Pulsed Electric Fields for Irreversible Electroporation Treatment Planning. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 59 (4), 1076-1085 (2012).
