Summary
Her præsenterer vi en protokol for at isolere mus pancreas ø-celler for screening ROS induktion af fremmedstoffer for at identificere de potentielle diabetogenic xenobiotiske kemikalier.
Abstract
Eksponering for visse miljømæssige kemikalier i mennesker og dyr er blevet fundet for at forårsage cellulære skader i bugspytkirtlen β-celler, hvilket vil føre til udviklingen af type 2 diabetes mellitus (T2DM). Selv om mekanismerne til den kemiske-induceret β celleskader var uklare og tilbøjelige til at være kompleks, er en tilbagevendende konstatering, at disse kemikalier fremkalde oxidativt stress fører til generation af overdreven reaktive ilt arter (ROS), fremkalde skader på β-cellen. For at identificere potentielle diabetogenic miljømæssige kemikalier, isoleret vi pancreas ø-celler fra C57BL/6 mus og kulturperler islet celler i 96-brønd celle kultur plader; derefter ø-celler blev doseret med kemikalier og ROS generation blev opdaget af 2', 7'-dichlorofluorescein (DCFH-DA) fluorescerende farvestof. Brug denne metode, vi fandt at bisphenol A (BPA), Benzo [a] pyren (BaP) og polychlorerede biphenyler (PCB), kunne fremkalde høje niveauer af ROS, tyder på, at de potentielt kan fremkalde skader i ø-celler. Denne metode bør være nyttige for screening diabetogenic fremmedstoffer. Derudover kan kulturperle ø-celler også tilpasses til in vitro- analyse af kemiske-induceret toksicitet i pancreas celler.
Introduction
Stigninger i prævalensen af T2DM er blevet en global sundhedskrise i de seneste år udgør en alvorlig trussel mod folkesundheden1. Mange faktorer er blevet fundet at være kausalt forbundet med udvikling af T2DM, blandt hvilke, tilbagevendende resultaterne tyder på at et fælles konvergerende point for disse faktorer er induktion af oxidativ stress, som fører til generation af overdreven ROS2 , 3.
Et bredt spektrum af Miljøkontaminanter herunder PCB, dioxiner og BaP har vist sig for at fremkalde oxidativ stress, som kan forringe funktionen af pancreas β celler, der fører til insulinresistens og T2DM4. Selv om den fysiologiske niveau af ROS spiller en vigtig rolle i cellulære funktioner, eksponering for ROS, som overstiger kapaciteten af antioxidant system resulterer i skader på celler/væv og fører til sygdomme5. Pancreas β celler udtrykker et lavt niveau af antioxidant enzym, og således er en følsom mål for oxidative stress-medieret skader6,7. Kronisk udsættelse for høje niveauer af ROS har vist sig at forårsage stress-induceret i bugspytkirtlen celle dysfunktion5 samt insulinresistens i lever og fedtvæv8.
Det overordnede mål med dette projekt er at udvikle en celle-baseret analyse for skærmen kemikalier for deres diabetogenic potentialer baseret på deres induktion af ROS i pancreas celler. Bugspytkirtlen mangler metaboliske afgiftning og er en følsom mål for xenobiotiske-induceret skade6,7. Derfor, ved direkte måling af den ROS, der er genereret i bugspytkirtlen celler, denne analyse bør give en direkte indbyrdes tilnærmelse af den kemiske-induceret skade i bugspytkirtlen. For at udvikle denne metode, vi isoleret mus i bugspytkirtlen Holme, kulturperler den isolerede islet celle kultur betingelse med kemikalier, og udnyttet den kemiske-induceret ROS generation som udlæsningen. Denne procedure er enkel og effektiv i at identificere ROS-inducerende kemikalier i isolerede Holmen; Det kan udvikles yderligere undersøgelse af de mekanismer af toksicitet, der er specifikke for bugspytkirtlen in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev henrettet i overensstemmelse med alle relevante retningslinjer, regler og reguleringsorganer. Protokollen demonstreres blev udført under vejledning og godkendelse af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) af Texas A & M Institute for genomisk medicin.
1. løsning forberedelse
- Fortynde 10 x Hank afbalanceret saltopløsning til 1 x med dobbelt destilleret H2O, og opbevares ved 4 ° C.
- Forbered isolation løsning ved at tilføje HEPES (10 mM), MgCl2 (1 mM) og glukose (5 mM). PH indstilles til 7,4 og holde på is.
- Forberede collagenase løsning fra collagenase Type 4.
Bemærk: Specifikt, indeholder collagenase Type 4 160 U pr. mg tørstof. 1 g af collagenase Type 4 er fortyndet i 5 mL dobbelt destilleret H2O med en koncentration på 200 mg/mL. 2 mL af det fortyndede Collagenase føjes til 30 mL is kold isolation løsning, og 6 mL af collagenase opløsning overføres til en 50 mL tube for hver mus. - Vaskeopløsningen ved at tilføje 1 mM CaCl2 isoleret løsning.
- Forberede rensning løsningen med kold polysucrose/natrium diatrizoate løsning (1.1119 g/mL, 5 mL).
- Forbered 500 mL af holmen dyrkningsmediet ved at tilføje L-glutamin (20 mM), (100 U/mL) penicillin, streptomycin (100 µg/mL) og fostrets bovint serum (FBS) (10%) i RPMI medium.
- Forberede DCFH-DA stamopløsningen ved at opløse pulver i destilleret vand på 200 µM og opbevares ved-20 ° C.
Bemærk: ROS farvning løsning er frisklavet ved fortynding af DCFH-DA stamopløsning til en endelig koncentration på 5 µM i RPMI. Dette reagens skal beskyttes mod lys.
2. kirurgiske forberedelse
- Intraperitoneal injicere (I.P.) en mus med avertin (2,5% avertin, 0,4 mL/20 g). Når musen er helt bedøvede og ikke længere reagerer til bagben fod pinches, aflive mus og flytte til den biologiske hætte.
- Placer de aflivede mus med den abdominale side opad og spray huden med 70% ethanol til sterilisation.
- Åbn bughulen med en 1 cm U-snit på den øvre del af maven og trække huden i den rostralt retning over brystet til at udsætte i bughulen.
3. bugspytkirtlen Perfusion og fjernelse
- Som illustreret i figur 1, finde placeringen af ampulla. Brug et par buet pincet til at klemme duodenum tæt på placeringen af sphincter af Oddi. Brug et andet par af buet pincet til at klemme duodenum væg for at blokere den galde pathway i duodenum.
Bemærk: Ampulla er ikke indsat i dette trin. Dette trin er beregnet til at blokere den galde pathway i duodenum. - Flytte musen med hovedet proksimale og distale med hensyn til forskeren fødder.
- Find fælles galdegang og langsomt injicere 3 mL af collagenase løsning med en 30 G kanyle og 5 mL sprøjte. Kontroller, at fælles galdegang og bugspytkirtlen er oppustet efter injektionen.
- Fjerne udspilet bugspytkirtlen ved hjælp af buet pincet og fine saks til at adskille den fra den faldende kolon, tarme, mave og milt. Placer bugspytkirtlen i en 50 mL tube indeholder 3 mL af collagenase løsning og holde det på is.
4. bugspytkirtlen fordøjelsen
- Læg hver 50 mL tube i et 37 ° C vandbad. Inkuber i 15-20 min (tiden varierer med belastning og alder af musene).
- Vibrere røret ved hjælp af en vortex.
- Pulje 4-5 fordøjet bugspytkirtlen i en stor sterile vask si og bruge et scoop for at gøre bugspytkirtlen forliser grundigt. Bruge en 23 G kanyle og 10 mL sprøjte indeholdende vaskeopløsning til kraftigt afpipetteres fordøjet cellerne ud af skærmen. Indsamle vaskeopløsning i en 50 mL tube.
- Centrifugeres rør på 97 x g ved 4 ° C i 1 min og den dekanteres.
- Tilsættes 25 mL vaskeopløsning til rør og genopslæmmes i væv af blide vortexing. Spin ned væv på 97 x g ved 4 ° C i 1 min og den dekanteres. Gentag for 3 gange. Vær omhyggelig med ikke at løsne den pelleted væv.
5. rensning af Holme
- Tilsættes 10 mL rensning at vasket væv pellet og forsigtigt resuspend indholdet.
- Forsigtigt overlay 5 mL af isolation løsning på rensning løsning. Vær omhyggelig med at holde en skarp flydende interface mellem de to løsninger.
- Der centrifugeres tube på 560 x g ved 4 ° C i 15 min med langsom acceleration og ingen bremse. Indsæt pipetten i grænsefladen og indsamle Holme lag ind i nye 50 mL rør.
- Vaske i Holme, som beskrevet i trin 3.5.
6. plating og behandling af ø-celler
- Resuspend holmene i 10 mL af Holme kultur løsning, forsigtigt blandes godt og placere 100 µL/brønd med en multikanalpipette til en 96-brønd plade. Placer ca 5 Holme pr. 96 godt.
- Pladen anbringes i vævskultur inkubator for 12 timer.
- Der centrifugeres (112 x g) 96-brønd plade og fjerne næringssubstratet.
- Fortynd Miljøkontaminanter dyrkningsmedium Holme. Tilsæt 100 µL af hver af de kemiske fortyndingsmidler i separate brønd af pladen. Resuspend Holme i hver brønd og Inkuber i 12 timer ved 37 ° C (koncentrationen varierer for de forskellige miljømæssige kemikalier).
7. ROS farvning og måling
- Efter Holme behandling, vask med 1 x PBS (200 µL for hver 96-brønd).
Bemærk: Koncentrationen af kemikalierne, der er som følger: AFB1: 3 µM, atrazin: 100 µM, BaP: 10 µM, BPA: 100 µM, β-østrogen, PCB126: 10 µM, Nonylphenol og BPA: 100 µM. - Bruge N-Acetyl cystein (NAC) som en antioxidant til dæmpning af ROS. Tilføj 5 mM af NAC at de ROS-induceret kemiske fortyndingsmidler og Ruger i 12 timer ved 37 ° C.
- 96-brønd pladen på 112 x g der centrifugeres og med 5 µM løsning af fluorescerende sonde (H2-DCFH-DA opløst i RPMI medier) der inkuberes ved 37 ° C i 60 min.
- Vaske behandlede ø-celler 3 gange med PBS og måle fluorescens med en mikrotiterplade læser på 488 nm.
Bemærk: Ophobning af DCF i celler kan måles ved en stigning i fluorescens på 530 nm når prøven er spændt på 488 nm. - Udføre den glucose-stimulerede insulin sekretion (GSIS) assay9 på ROS-inducerende xenobiotiske behandlet Holme og ubehandlet Holme at måle de xenobiotiske effekter på den fysiologiske funktion i pancreas holmene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En Mikrograf af sunde isolerede Holmen er vist i figur 2, hvor Holme har en rund eller oval form med relativt ensartet størrelse (selvom størrelse ensartethed kan varierer fra stamme til stamme). Vi undersøgte næste funktionerne i bugspytkirtlen Holmen i en in vitro- analyse ved at isolere Holmen og stimulere insulinsekretion i kultur Holme. Figur 3 viser vores typiske analyse af GSIS analysen fra C57BL/6 mus isoleret Holme induceret af 3,3 mM og 16,7 mM glukose9.
Ved hjælp af metoden plade format skærm, har vi identificeret flere fremmedstoffer, der forårsagede betydelige induktion af ROS i ø-celler (figur 4). Vi behandlede de isolerede øer med forskellige kemikalier til 12 h og fandt at atrazin, BPA, BaP og PCB126og β-østrogen kan forårsage betydelige induktion af ROS i isolerede småøer10,11,12 , 13.
Selvom ROS ikke er lig med diabetogenic induktion, er der rigeligt med beviser med angivelse af ROS vigtige rolle i at beskadige de fysiologiske funktioner i bugspytkirtlen β celler, hvilket fører til T2DM8. Derfor er værdien af arbejdet at identificere disse ROS inducerende kemiske som den oprindelige skærm. Endvidere kan forbindelser identificeret være yderligere analyseres i vitro i isolerede pancreas islet celle kultur systemet beskrevet i håndskriftet. Vi har vist virkningerne af ROS-inducerende fremmedstoffer på glucose-stimulere insulin udskillelsen af de isolerede småøer, der kortvarigt diabetogenic data i disse testet forbindelser. Pancreas Holme forbehandlet med PCB126 og BPA viste en betydelig nedgang i insulinsekretion end kontrolgruppen (figur 5).
Figur 1 : Procedure for musen bugspytkirtlen perfusion. Proceduren består af følgende trin: (1) finde ampulla og bruge to par buet pincet til at klemme ampulla. (2) indsætte nålen gennem fælles galden. (3) langsomt injicere 3 mL collagenase løsning materiel i 5 mL sprøjten. (4) indsamle udspilet bugspytkirtlen fra duodenum.
Figur 2 : Isoleret mus Holme. Isolerede mus i bugspytkirtlen Holme i dyrkningsmediet er vist. Skalalinjen på 500 µm.
Figur 3 : Glucose-stimuleret insulinsekretion af isolerede pancreas Holme. Dosisafhængig glucose-stimuleret insulinsekretion (1, 3.3 og 16,7 mM, behandlet for 15 min) blev målt i isolerede øer (gennemsnitlig 5 Holme pr. brønd), ved hjælp af en mus insulin ELISA kit. Fejllinjer Vis standardafvigelser. p < 0,05.
Figur 4 : Induktion af ROS af fremmedstoffer i isolerede øer fra C57BL/6 mus. (A) isolerede øer blev behandlet for 12 h og farves med fluorescens dye 2', 7'-dichlorofluorescein (DCFH-DA) for 1 h. Fluorescens var bestemt af et fluorescens-Pladelæser. (B) den kemiske-induceret ROS blev slukket af NAC (5 mM). (AFB1: 3 µM, atrazin: 100 µM, BaP: 10 µM, BPA: 100 µM, PCB126: 10 µM, Nonylphenol, BPA: 100 µM og NAC: 5 mM). Fejllinjer Vis standardafvigelser. p < 0,05. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Xenobiotiske effekter på glucose-stimuleret insulinsekretion af isolerede småøer. Isolerede øer var forbehandlet med PCB126, β-østrogen og BPA (4 h) og holdt i Holmen næringssubstrat for 1 h. Supernatanten af holmene blev indsamlet til måling af insulin af et kommercielt tilgængelige mus insulin ELISA assay. Fejllinjer Vis standardafvigelser. p < 0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Akkumulere beviser tyder på, at eksponering for Miljøkontaminanter spiller en vigtig rolle i udviklingen af T2DM. Fremmedstoffer-induceret ROS er blevet anerkendt som en potentiel ætiologiske faktor, der bidrager til udviklingen af T2DM. Mennesker er udsat for en bred vifte af xenobiotiske kemikalier og der er et stort behov for nye forskningsteknikker effektivt identificere de pancreas giftstoffer og at efterforske mekanismen af toksicitet specifikke med cellerne i pancreas.
I denne undersøgelse, baseret på offentliggjorte procedurer14, har vi udviklet en protokol til at isolere pancreas Holme fra mus og skærm celler med xenobiotiske kemikalier til oxidativ stress-induceret skade på bugspytkirtlen celler. Vi også bruge denne fremgangsmåde til at undersøge de i bugspytkirtlen specifikke giftige svar induceret af de Miljøfremmede stoffer. For at få bugspytkirtlen fra mus, foretrækker vi at bruge avertin over andre anæstesi, fordi det ændrer ikke blodsukkerniveauet og påvirker ikke Vaskulaturen af bugspytkirtlen15,16,17. Vi fandt, at tæthed gradient centrifugering skridt er kritisk for isolation af holmen med høj renhed. Bør sikres at opnå de forskellige lag mellem polysucrose/natrium og isolation buffer fase at opnå en ren Holme prøve, blottet for snavs og eksokrine celler/væv. Metoden kan anvendes til in vitro- analyse af kemiske miljøvirkninger på pancreas islet fysiologi, såsom GSIS assay (som vist i figur 3). Holmene bør omhyggeligt spredt med gentagne pipettering i separate celler at sikre uniformerede celle nummer i 96-celle kultur plade. Metoden beskrevet kombineret her isolation af holmen og en hurtig assay for ROS generation og derfor er en enkel og effektiv første skærmbillede for potentielle bugspytkirtel-skadelige kemikalier.
Vi brugte insulinsekretion i svar til glucose udfordring for at bekræfte identiteten af de isoleret i bugspytkirtlen Holme. Proceduren er meget tilpasningsdygtige til analyse af ændringer i parametre, herunder insulinsekretion (figur 3) og cAMP generation, som svar på xenobiotiske behandlinger18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af et pilotprojekt tilskud fra CREH center sponsoreret af NIEHS og National Natural Science Foundation of China (nr. 31572626).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10×Hank’s balanced salt solution | GIBCO | 14185-052 | |
| Collagenase Type 4 | Worthington Biochemical Corporation | CLS-4 | |
| polysucrose/sodium diatrizoate solution | Sigma | 10771 | |
| 2’,7’-dichlorofluorescein (DCFH-DA) | Sigma | D6883-50MG | |
| fluorescence microplate reader | Biotek | ||
| L-glutamine | Sigma | G8540-25G | |
| streptomycin | GIBCO | 15140148 | |
| FBS | GIBCO | 26140079 | |
| RPMI 1640 | GIBCO | 11875-085 | |
| avertin | Sigma | T48402-25G | |
| Rat/Mouse Insulin ELISA Kit | Millipore | EZRMI-13K | |
| Centrifuge | Sorval | Sorval RT7 | for 96-well plate centrifuge |
| Microplate reader | Biotek | Epoch 2 | for fluorescence reading |
References
- Maruthur, N. M. The growing prevalence of type 2 diabetes: increased incidence or improved survival? Current diabetes reports. 13 (6), 786-794 (2013).
- Houstis, N., Rosen, E. D., Lander, E. S. Reactive oxygen species have a causal role in multiple forms of insulin resistance. Nature. 440 (7086), 944-948 (2006).
- Ma, Z. A., Zhao, Z., Turk, J. Mitochondrial dysfunction and beta-cell failure in type 2 diabetes mellitus. Exp Diabetes Res. , 703538 (2012).
- Valavanidis, A., Vlahogianni, T., Dassenakis, M., Scoullos, M. Molecular biomarkers of oxidative stress in aquatic organisms in relation to toxic environmental pollutants. Ecotoxicology and environmental safety. 64 (2), 178-189 (2006).
- Robertson, R. P., Harmon, J., Tran, P. O., Tanaka, Y., Takahashi, H. Glucose toxicity in β-cells: type 2 diabetes, good radicals gone bad, and the glutathione connection. Diabetes. 52 (3), 581-587 (2003).
- Kaneto, H., et al. Oxidative stress induces p21 expression in pancreatic islet cells: possible implication in beta-cell dysfunction. Diabetologia. 42 (9), 1093-1097 (1999).
- Maechler, P., Jornot, L., Wollheim, C. B. Hydrogen peroxide alters mitochondrial activation and insulin secretion in pancreatic beta cells. Journal of Biological Chemistry. 274 (39), 27905-27913 (1999).
- Gao, D., et al. The effects of palmitate on hepatic insulin resistance are mediated by NADPH Oxidase 3-derived reactive oxygen species through JNK and p38MAPK pathways. Journal of Biological Chemistry. 285 (39), 29965-29973 (2010).
- Efendić, S., et al. Pancreastatin and islet hormone release. Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (20), 7257-7260 (1987).
- Tian, Y., Ke, S., Denison, M. S., Rabson, A. B., Gallo, M. A. Ah receptor and NF-κB interactions, a potential mechanism for dioxin toxicity. Journal of Biological Chemistry. 274 (1), 510-515 (1999).
- Cui, H., et al. Pregnane X receptor regulates the AhR/Cyp1A1 pathway and protects liver cells from benzo-[α]-pyrene-induced DNA damage. Toxicology Letters. 275, 67-76 (2017).
- Li, L. A., Wang, P. W. PCB126 induces differential changes in androgen, cortisol, and aldosterone biosynthesis in human adrenocortical H295R cells. Toxicological Sciences. 85 (1), 530-540 (2005).
- Asahi, J., et al. Bisphenol A induces endoplasmic reticulum stress-associated apoptosis in mouse non-parenchymal hepatocytes. Life sciences. 87 (13), 431-438 (2010).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Murine pancreatic islet isolation. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (7), e255 (2007).
- Kirstetter, P., Lagneau, F., Lucas, O., Krupa, Y., Marty, J. Role of endothelium in the modulation of isoflurane-induced vasodilatation in rat thoracic aorta. British journal of anaesthesia. 79 (1), 84-87 (1997).
- Brown, E., Umino, Y., Loi, T., Solessio, E., Barlow, R. Anesthesia can cause sustained hyperglycemia in C57/BL6J mice. Visual neuroscience. 22 (5), 615-618 (2005).
- Vaupel, D., McCoun, D., Cone, E. J. Phencyclidine analogs and precursors: rotarod and lethal dose studies in the mouse. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 230 (1), 20-27 (1984).
- Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination. Journal of visualized experiments: JoVE. (88), (2014).
