Summary
여기 우리는 잠재적인 diabetogenic xenobiotic 화학 물질 식별는 xenobiotics에 의해 선생님 inductions을 심사에 대 한 마우스 췌 장 섬 세포 격리 프로토콜을 제시.
Abstract
인간과 동물에서 특정 환경 화학 물질에 노출은 타입-2 당뇨병 mellitus (T2DM)의 개발으로 이어질 것 이다 췌 장 β 세포의 세포 손상을 발견 되었습니다. 화학 유도 β 세포 손상에 대 한 메커니즘은 불분명 하 고 복잡 한 것 같다, 비록 한 되풀이 발견은 이러한 화학 물질에 손상을 유발합니다 과도 한 반응성 산소 종 (선생님)의 생성을 선도 하는 산화 스트레스 유발 β 세포입니다. 우리 C57BL/6 마우스의 췌 장 섬 세포과 교양된 섬 셀 96 잘 세포 배양 배지;에 있는 고립 된 잠재적인 diabetogenic 환경 화학 물질 식별, 그리고, 작은 섬 세포는 화학 물질과 복용 했다 선생님 세대 2', dichlorofluorescein (DCFH-다)-7' 형광 염료에 의해 발견 되었다. 이 방법을 사용 하 여, 우리는 bisphenol A (BPA), Benzo [a] pyrene (BaP), 그리고 비페닐 (PCBs), 그들은 잠재적으로 작은 섬 세포에 손상을 유발 수 있습니다 제안 하는 선생님의 상부 유도 수 있습니다. 이 메서드는 diabetogenic xenobiotics를 심사 하는 데 유용 해야 합니다. 또한, 경작된 작은 섬 세포 췌 장 세포에서 화학 유도 된 독성의 생체 외에서 분석에 맞게 수도 있습니다.
Introduction
T2DM의 보급에 있는 증가 최근 몇 년 동안 공중 보건1에 심각한 위협이 포즈 세계 보건 위기 되고있다. 많은 요인이 발견 되었습니다 원인이 되는, T2DM의 개발에 연결 될 반복 결과 것이 좋습니다 이러한 요소에 대 한 하나의 일반적인 집중 포인트의 과도 한 선생님2 세대에 이르게 산화 스트레스의 유도 , 3.
환경 화학 물질 PCBs, 다이옥신, BaP 등의 다양 한 스펙트럼 유발 산화 스트레스, 췌 장 β 세포의 기능을 손상 하 고 인슐린 저항 및 T2DM4이어질 수 있습니다 발견 되었습니다. 선생님의 생리 적 수준 세포 기능에 중요 한 역할을, 비록 항 산화 시스템의 용량을 초과 하는 선생님에 노출 세포/조직에 손상 귀착되 고 질병5리드. 췌 장 β 세포 항 산화 효소의 낮은 수준의 표현 되며 따라서 산화 스트레스 중재 손상6,7에 대 한 중요 한 목표. 선생님의 상부에 만성 노출은 췌 장 세포 스트레스 유발 장애5 원인을 보여줘 되었습니다8간 및 지방 조직 인슐린 저항 뿐만 아니라.
이 프로젝트의 전반적인 목표는 췌 장 세포에 선생님의 그들의 유도에 따라 그들의 diabetogenic 잠재력에 대 한 화학 물질 화면에 세포 기반 분석 결과 개발 하는 것입니다. 췌 대사 해독 부족 고 xenobiotic 손상6,7에 대 한 중요 한 대상 이다. 따라서, 췌 장 세포에서 생성 하는 선생님을 직접 측정 하 여이 분석 결과 췌에 화학 유도 부상의 직접적인 근사를 제공 해야 합니다. 이 방법을 개발, 우리는 절연 마우스 췌 장 독도 교양 화학 물질, 셀 문화 조건 하에서 고립 된 섬 하 고 판독으로 유도 하는 화학 선생님 세대를 활용. 이 절차는 간단 하 고 효과적인 격리 된 섬; 선생님 유도 하는 화학 물질 식별 그것은 췌 체 외에 관련 된 독성의 메커니즘의 조사에 대 한 추가 개발할 수 있습니다.
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Protocol
모든 동물 실험은 모든 관련 지침, 규정 및 규제 기관에 따라 실행 했다. 지도 및 게놈 의학 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 텍사스 A & M 연구소의 승인 아래 프로토콜 입증 되 고 수행 되었다.
1. 솔루션 준비
- 두 배 증류수 H2O, 1 x 10 x 행 크의 균형된 소금 솔루션을 희석 하 고 4 ° c.에 저장
- HEPES (10 m m), MgCl2 (1 m m), 포도 (5 m m)를 추가 하 여 격리 솔루션을 준비 합니다. PH 7.4에 조정 하 고 얼음에 계속.
- 유형 4 콜라에서 콜라 솔루션을 준비 합니다.
참고: 특히, 콜라 유형 4 건조 중량의 밀리 그램 당 160을 U 포함 되어 있습니다. 콜라 유형 4의 1 g 5 mL 두 배 증류수 H2O 200 mg/mL의 농도로 희석입니다. 희석된 콜라의 2 mL 30 mL 얼음 차가운 격리 솔루션에 추가 되 고 콜라 솔루션의 6 mL 50 mL 튜브 각 마우스에 대 한 전송 됩니다. - 1mm CaCl2 격리 솔루션에 추가 하 여 세척 솔루션을 준비 합니다.
- 찬 polysucrose/나트륨 diatrizoate 솔루션 (1.1119 g/mL, 5 mL) 정화 솔루션을 준비 합니다.
- RPMI 매체에 L-글루타민 (20 m m), 페니실린 (100 U/mL), 스 (100 µ g/mL), 및 소 태아 혈 청 (FBS) (10%)를 추가 하 여 섬 문화 매체의 500 mL를 준비 합니다.
- 200 µ M에서 증류수에-20 ° c.에 게 분말을 용 해 하 여 DCFH-다 재고 솔루션을 준비
참고: 솔루션 얼룩 선생님 갓 RPMI에 5 µ M의 최종 농도에 DCFH-다 재고 솔루션을 diluting 하 여 이루어집니다. 이 시 약은 빛 으로부터 보호 되어야 한다.
2. 수술 준비
- Intraperitoneally 주사 (I.P.) avertin (2.5 %avertin, 0.4 mL/20 g)와 마우스. 마우스 완전히 마 취 후 더 이상 응답 pinches 발 뒷 다리를 하 고 마우스를 안락사 한 생물 후드로 이동.
- 복 면이 위로 향하도록 안락사 마우스를 배치 하 고 피부 살 균에 대 한 70% 에탄올 스프레이.
- 상단 복 부에 1cm U-절 개 된 복 부 구멍을 열고 복 부 구멍을 노출 가슴 위에 rostral 방향으로 피부를 제거 합니다.
3. 췌 관류 및 제거
- 그림 1에서 볼 수 있듯이 ampulla의 위치를 찾아. 곡선된 집게의 쌍을 사용 하 여 십이지 장 Oddi의 괄약근의 위치에 가까운 클램프. 또 한 쌍의 곡선된 겸 자 사용 하 여 클램프 십이지 장 벽에는 십이지 장 담 즙 통로 차단.
참고: ampulla이이 단계에서 삽입 되지 않습니다 있다. 이 단계에서 십이지 장 담 즙 통로 차단 하도록 의미 된다. - 근 위 머리와 연구원에 관해서는 원심 발 마우스 위치를 변경할.
- 일반적인 담 관을 찾아서 30 G 바늘과 5 mL 주사기로 콜라 솔루션의 3 mL를 천천히 주입. 일반적인 담 관 및 췌 주입 후 증가 다는 것을 확인 하십시오.
- 팽창된 췌 내림차순 콜론, 창 자, 복 부, 및 비장에서 분리 곡선된 겸 자 및 좋은 위를 사용 하 여 제거 합니다. 콜라 솔루션의 3 mL를 포함 하는 50 mL 튜브에 췌를 놓고 얼음에 그것을 유지 합니다.
4. 췌 장 소화
- 37 ° C 물 목욕으로 각 50 mL 튜브를 놓습니다. 15-20 분 동안 품 어 (시간에 따라 다릅니다 긴장과 쥐의 나이).
- 소용돌이 사용 하 여 튜브를 진동.
- 대형 메 마른 싱크대 여과기에 4-5 소화 췌 풀 하 고 특 종 췌 철저 하 게 붕괴를 사용 하 여. 세척 솔루션을 포함 하는 23 G 바늘과 10 mL 주사기를 사용 하 여 강제로 화면에서 소화 셀 플라스틱. 세척 솔루션 50 mL 튜브에 수집 합니다.
- 1 분에 4 ° C에서 97 x g에서 튜브 원심 고는 상쾌한 가만히 따르다.
- 튜브를 세척 솔루션의 25 mL를 추가 하 고 다시 조직 부드러운 vortexing에 의해 일시 중단. 1 분에 4 ° C에서 97 x g에서 조직을 아래로 회전 시키십시오 그리고는 상쾌한 가만히 따르다. 3 번 반복 합니다. 수송과 조직을 꺼내 조심 해야.
5입니다. 독도의 정화
- 씻어 조직 펠 릿을 정화 솔루션의 10 mL를 추가 하 고 내용을 부드럽게 resuspend.
- 부드럽게 정화 솔루션에 격리 솔루션의 5 mL을 오버레이. 두 솔루션 간의 날카로운 액체 인터페이스를 유지 하려면 주의 해야 합니다.
- 느린 가속 15 분 동안 4 ° C에서 g x 560 및 아무 브레이크 튜브 원심 인터페이스에는 피 펫을 삽입 하 고 새로운 50 mL 튜브에 독도 레이어를 수집 합니다.
- 3.5 단계에서 설명한 대로 독도 씻어.
6. 도금 및 작은 섬 세포의 치료
- 독도 문화 솔루션의 10 mL에는 독도 resuspend, 부드럽게 섞어 잘, 그리고 100 µ L/96 잘 접시에 멀티 채널 피 펫으로 잘 배치. 96 당 약 5 독도 잘 배치 합니다.
- 12 h에 대 한 조직 문화 인큐베이터에 접시를 놓습니다.
- 원심 (112 x g) 96 잘 접시와 문화 매체를 제거 합니다.
- 독도 문화 매체에서 환경 화학 물질을 희석. 접시의 별도 우물에 각 화학 diluents 100 µ L를 추가 합니다. 각 잘에서 독도 resuspend 하 고 (다른 환경 화학 물질에 대 한 농도 다름) 37 ° C에 12 h에 대 한 품 어.
7. 선생님 얼룩 및 측정
- 독도 치료 후 1 x PBS로 세척 (각 96 잘 200 µ L).
참고: 화학 물질의 농도 다음과 같습니다: AFB1: 3 µ M, 아트 가진: 100 µ M, BaP: 10 µ M, BPA: 100 µ M, β-에스트로겐, PCB126: 10 µ M, Nonylphenol, 및 BPA: 100 µ M. - 항 산화로 N-아 세 틸 시스테인 (NAC)를 사용 하 여 선생님을 끄다. NAC의 5mm 선생님 유발 화학 diluents을 추가 하 고 37 ° c.에 12 h에 대 한 품 어
- 112 x g에서 96 잘 접시 원심 하 고 60 분 동안 37 ° C에서 5 µ M 솔루션 형광 프로브 (H2-DCFH-다 RPMI 미디어에 녹아 있는)의 품 어.
- PBS로 3 회 치료 작은 섬 세포를 세척 하 고 488에서 microplate 리더 형광 측정 nm.
참고: 셀에 DCF의 축적 증가 의해 형광 530에서 측정할 수 있습니다 때 샘플 488에 흥분은 nm nm. - 포도 당 자극 인슐린 분 비 (GSIS) 분석 결과9 선생님 유도 xenobiotic 수행 독도 췌 장 독도의 생리 기능에 xenobiotic 효과 측정 하기 위해 치료 독도 취급.
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Representative Results
건강 한 고립 된 섬의 현미경 사진 그림 2, 독도 원형 또는 타원형 모양으로 비교적 균일 한 크기 (비록 크기 균일성 스트레인 스트레인에서 다를 수 있습니다)를가지고 있는에 표시 됩니다. 우리 다음 조사 생체 외에서 분석 결과에서 췌 장 섬 기능 분리는 섬 하 고 문화 독도에서 인슐린 분 비를 자극. 그림 3 GSIS 분석 결과 3.3 m m와 16.7 m m 포도 당9에 의해 유도 된 C57BL/6 마우스 고립 된 독도에서 우리의 일반적인 분석을 보여준다.
플레이트 형식 화면 메서드를 사용 하 여 우리는 작은 섬 세포 (그림 4) 선생님의 중요 한 유도 시킨 여러 xenobiotics를 확인 했습니다. 우리는 12 h에 대 한 다른 화학 물질과 격리 된 독도 처리 하 고 그 아트 가진, BPA, BaP와 PCB126, 발견 및 β-에스트로겐 격리 된 독도10,,1112 에 선생님의 중요 한 유도 일으킬 수 있습니다. , 13.
선생님 diabetogenic 유도 아닌, 비록 T2DM8에 이르게 췌 장 β 세포의 생리 기능에 손상을 초래에서 선생님의 중요 한 역할을 나타내는 충분 한 증거가 있다. 따라서, 작품의 가치 초기 화면으로 화학 유도이 선생님을 식별 것입니다. 또한, 확인 된 화합물 수 추가 분석 생체 외에서 원고에 설명 된 고립 된 췌 장 섬 세포 문화 시스템에. 우리 잠시이 시험 된 화합물에 대 한 diabetogenic 데이터를 제공 하는 격리 된 독도의 포도 당 자극 인슐린 분 비에 선생님 유도 xenobiotics의 효과 보여주었다. 췌 장 독도 미리 치료 PCB126와 BPA 제어 그룹 (그림 5) 보다 인슐린 분 비에 상당한 감소를 보여주었다.
그림 1 : 마우스 췌 관류의 절차. 절차는 다음 단계로 구성 됩니다: (1) 는 ampulla 찾아서 두 켤레 곡선된 겸 자는 ampulla 클램프를 사용 하 여. (2) 일반적인 담 즙을 통해 바늘을 삽입 합니다. (3) 천천히 5 mL 주사기에 콜라 솔루션 주식의 3 mL를 주사. (4) 수집 팽창된 췌 십이지 장부터 시작 합니다.
그림 2 : 절연 마우스 독도. 절연된 마우스 췌 장 독도 문화 매체에 표시 됩니다. 규모는 500 µ m의 바.
그림 3 : 고립 된 췌 장 독도의 포도 당 자극 인슐린 분 비. 복용량-의존 포도 당 자극 인슐린 분 비 (1, 3.3, 및 16.7 m m, 15 분에 대 한 치료) 고립 된 독도 (5 독도 잘 당 평균), 마우스 인슐린 ELISA를 사용 하 여 측정 되었다 키트. 오차 막대는 표준 편차를 표시합니다. p < 0.05.
그림 4 : Xenobiotics C57BL/6 쥐에서 고립 된 독도에 여 선생님의 유도. (A) 고립 된 독도 12 h에 대 한 치료 되었고 형광 염료 2', 7'-dichlorofluorescein (DCFH-다) 1 시간에 대 한 물. 형광은 형광 플레이트 리더에 의해 결정 되었다. (B) 화학 유도 선생님은 NAC (5mm)에 의해 침묵 했다. (AFB1: 3 µ M, 아트 가진: 100 µ M, BaP: 10 µ M, BPA: 100 µ M, PCB126: 10 µ M, Nonylphenol, BPA: 100 µ M, 및 NAC: 5 m m). 오차 막대는 표준 편차를 표시합니다. p < 0.05. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : 격리 된 독도의 포도 당 자극 인슐린 분 비에 영향을 xenobiotic. 격리 된 독도 미리 치료 PCB126, β-에스트로겐와 BPA (4 h) 고 1 시간을 위한 섬 문화 매체에 보관. 독도의 상쾌한 상용 마우스 인슐린 ELISA에 의해 인슐린의 측정에 대 한 수집 된 분석 결과. 오차 막대는 표준 편차를 표시합니다. p < 0.05.
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Discussion
환경 화학 물질에 노출을 제안 증거를 축적 T2DM의 개발에 중요 한 역할. Xenobiotics 유도 선생님 T2DM의 발전에 기여 하는 잠재적인 etiological 요인으로 인식 하고있다. 인간은 다양 한 xenobiotic 화학 물질에 노출 되는 그리고 췌 장 이용과 효과적으로 식별 하 고 췌 장 세포에 독성의 기계 장치를 조사 하는 새로운 연구 기법에 대 한 큰 필요.
14, 게시 된 절차 따라 본이 연구에서는 우리 췌 장 세포를 산화 스트레스 유발 손상 xenobiotic 화학 물질과 세포 마우스와 화면에서 췌 장 독도 격리 프로토콜 개발 했습니다. 우리는 또한 xenobiotic 화합물에 의해 유도 된 췌 장 특정 독성 응답을 조사 하기 위해이 절차를 사용 합니다. 마우스에서 췌를 얻으려면, 우리는 혈액 포도 당 수치를 변경 하지 않습니다 하기 때문에 췌 장15,,1617의 맥 관 구조에는 영향을 미치지 않습니다 다른 마 취를 통해 avertin를 사용 하 여 선호. 우리 밀도 그라데이션 원심 분리 단계는 높은 순수성을 가진 섬의 격리에 대 한 중요 한 발견. 파편과 외 분 비 세포/조직 없는 순수한 독도 샘플을 얻기 위해 polysucrose/나트륨 및 절연 버퍼 단계 사이의 뚜렷한 계층을 얻기 위해 주의 해야 합니다. ( 그림 3에서 같이) 췌 장 섬 생리학, GSIS 분석 결과 등에 환경 화학 효과의 분석 생체 외에서 메서드를 사용할 수 있습니다. 독도 96-세포 배양 접시에 제복을 입은 셀 수 있도록 별도 셀에 반복 pipetting으로 신중 하 게 분산 되어야 한다. 설명 하는 방법을 여기는 섬 및 선생님 세대에 대 한 빠른 분석 결과 결합 이며, 따라서 잠재적인 췌 장 손상 화학 물질에 대 한 간단 하 고 효과적인 초기 화면.
우리는 고립 된 췌 장 독도의 정체성을 확인 하 포도 당 도전 하 응답에서 인슐린 분 비를 사용. 절차는 인슐린 분 비 (그림 3)과 캠프 세대, xenobiotic 치료18응답에 포함 하는 매개 변수에서 변경의 분석에 대 한 높은 적응력.
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Disclosures
저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.
Acknowledgments
이 작품은 NIEHS 및 국가 자연 과학 재단의 중국 (No. 31572626) 후원 CREH 센터에서 파일럿 프로젝트 교부 금에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10×Hank’s balanced salt solution | GIBCO | 14185-052 | |
| Collagenase Type 4 | Worthington Biochemical Corporation | CLS-4 | |
| polysucrose/sodium diatrizoate solution | Sigma | 10771 | |
| 2’,7’-dichlorofluorescein (DCFH-DA) | Sigma | D6883-50MG | |
| fluorescence microplate reader | Biotek | ||
| L-glutamine | Sigma | G8540-25G | |
| streptomycin | GIBCO | 15140148 | |
| FBS | GIBCO | 26140079 | |
| RPMI 1640 | GIBCO | 11875-085 | |
| avertin | Sigma | T48402-25G | |
| Rat/Mouse Insulin ELISA Kit | Millipore | EZRMI-13K | |
| Centrifuge | Sorval | Sorval RT7 | for 96-well plate centrifuge |
| Microplate reader | Biotek | Epoch 2 | for fluorescence reading |
References
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