Summary
Здесь мы представляем протокол изолировать клетки поджелудочной островок мыши для скрининга ROS индукции, ксенобиотиков с целью выявления потенциальных diabetogenic ксенобиотиков химических веществ.
Abstract
Было установлено, что воздействие некоторых экологических химических веществ у животных и человека вызывают повреждения клеток поджелудочной железы β-клеток, которые приведут к развитию сахарного диабета типа 2 (T2DM). Хотя механизмы для β химико индуцированного повреждения клеток были неясными и может быть сложным, один из повторяющихся выводов является что эти химические вещества вызывают Оксидативный стресс приводит к генерации чрезмерного реактивнооксигенных видов (ров) который вызвать повреждения β-клеток. Для выявления потенциальных diabetogenic окружающей среды химических веществ, мы изолированы поджелудочной островок клеток от мышей C57BL/6 и культивировали островковых клеток в 96-луночных клетки культуры пластин; затем были дозированной островковых клеток с химикатами и поколение ROS был обнаружен 2' 7'-dichlorofluorescein (DCFH-DA) Люминесцентная краска. С помощью этого метода, мы нашли что бисфенол А (BPA), бензо [а] пирена (БАП) и полихлорированных дифенилов (ПХД), может вызвать высокий уровень рос, предполагая, что они потенциально могут вызывать повреждения в островковых клеток. Этот метод должен быть полезным для скрининга diabetogenic ксенобиотиков. Кроме того искусственный островковых клеток также могут быть приспособлены для анализа в vitro химико индуцированной токсичности в клеток поджелудочной железы.
Introduction
Увеличение распространенности T2DM стали кризис глобального здравоохранения в последние годы, создает серьезную угрозу для общественного здравоохранения1. Многие факторы были найдены каузально связаны с развития T2DM, среди которых, повторяющиеся выводы позволяют предположить, что одной общей конвергентных точки для этих факторов индукции оксидативного стресса, что приводит к генерации чрезмерного Рось-2 , 3.
Было установлено, что широкий спектр окружающей среды химических веществ, включая ПХД, диоксины и BaP вызывают Оксидативный стресс, который может нарушить функции поджелудочной железы β-клеток и привести к сопротивление инсулина и T2DM4. Хотя физиологический уровень рос играет важную роль в клеточных функций, подверженности рос, что превышает емкость антиоксидантной системы приводит к повреждению клеток/тканей и приводит к болезни5. Клетки поджелудочной железы β Экспресс низкий уровень антиоксидантной фермента и таким образом являются чувствительными мишенью для Оксидативный стресс опосредованный ущерб6,7. Было показано, что хроническое воздействие высоких уровней ROS вызвать стресс индуцированного поджелудочной железы клетки дисфункции5 а также сопротивление инсулина в печени и жировой ткани8.
Общая цель этого проекта – разработать на основе ячеек пробирного экрана химических веществ для их diabetogenic потенциалов на основе их индукции рос в клеток поджелудочной железы. Поджелудочной железы не хватает метаболической дезинтоксикации и чувствительных мишенью для ксенобиотик индуцированного повреждения6,7. Таким образом непосредственно измеряя ROS, сгенерирована клеток поджелудочной железы, этот assay должны обеспечивать прямой аппроксимации химико индуцированного повреждения в поджелудочной железе. Развивать этот метод, мы изолированные мыши панкреатических островков, культивированный изолированных островок в условиях культуры клеток с химическими веществами и использовать химико индуцированной поколение ROS как индикация. Эта процедура является простым и эффективным при определении химических веществ заставить ROS в изолированном островке; она может быть дальнейшее развитие для изучения механизмов токсичности, которые являются специфическими для поджелудочной железы в пробирке.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты на животных были казнены во исполнение всех соответствующих руководящих принципов, правил и регулирующих органов. Протокол продемонстрировал была выполнена под руководством и утверждения институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) из Texas A & M институт для дальнейшего развития геномной медицины.
1. решение подготовка
- Разбавить 10 x Хэнк сбалансированного солевого раствора на 1 x с двойной дистиллированной H2O и хранить при 4 ° C.
- Приготовляют раствор изоляции путем добавления HEPES (10 мм), MgCl2 (1 мм) и глюкозы (5 мм). Отрегулируйте пэ-аш до 7,4 и держать на льду.
- Приготовляют раствор коллагеназы из коллагеназы типа 4.
Примечание: В частности коллагеназа типа 4 содержит 160 U на мг сухого веса. 1 g коллагеназы типа 4 разводят в 5 мл двойной дистиллированной H2O с концентрацией 200 мг/мл. 2 мл разбавленной коллагеназы добавляется 30 мл раствора лед холодной изоляции, и 6 мл раствора коллагеназы передается 50 мл трубки для каждой мыши. - Приготовьте промывочный раствор, добавив 1 мм CaCl2 к решению изоляции.
- Приготовляют раствор очистки с холодной polysucrose натрия diatrizoate раствор (1.1119 г/мл, 5 мл).
- Подготовка 500 мл островок культуры среды путем добавления в среду RPMI L-глютамин (20 мм), пенициллин (100 ед/мл), стрептомицин (100 мкг/мл) и плода бычьим сывороточным (ФБС) (10%).
- Подготовить раствор DCFH-DA путем растворения порошка в дистиллированной воде при 200 мкм и хранить при температуре-20 ° C.
Примечание: ROS, окрашивание раствора свежеприготовленные путем разбавления Стоковый раствор DCFH-DA до конечной концентрации 5 мкм в RPMI. Этот реагент должны быть защищены от света.
2. Хирургическое подготовка
- Внутрибрюшинно впрыскивают (и.п.) Мышь с Авертен (2,5% Авертен, 0,4 мл/20 g). После того, как мышь полностью под наркозом и больше не реагирует на задние ноги щепотки, усыпить мыши и перейти к биологической Худ.
- Место Усыпленных мышь с брюшной стороной вверх и спрей кожи с 70% этанола для стерилизации.
- Откройте брюшной полости с 1 см U-разрез по верхней части живота и втягивать кожу в ростральной направлении над комодом подвергать брюшной полости.
3. поджелудочная железа перфузии и удаление
- Как показано на рисунке 1, найдите расположение ампула. Использование пара Изогнутый пинцет для зажима в двенадцатиперстную кишку вблизи позиции сфинктера Одди. Используйте другую пару Изогнутый пинцет для зажима стенку двенадцатиперстной кишки для блокирования пути желчи в двенадцатиперстную кишку.
Примечание: Ампула не были вставлены в этом шаге. Этот шаг предназначен для блокирования пути желчи в двенадцатиперстную кишку. - Переместите мышь с головой проксимальных и дистальных отношении исследователь ноги.
- Найти общего желчного протока и медленно вводить 3 мл раствора коллагеназы с 30 G иглы и 5 мл шприц. Убедитесь, что общий желчных протоков и поджелудочной железы завышены после инъекции.
- Удаление растянутый поджелудочной железы с помощью тонкой ножницы и Изогнутый пинцет чтобы отделить его от нисходящей толстой кишки, кишечника, желудка и селезенки. Место поджелудочной железы в 50 мл, содержащие 3 мл раствора коллагеназы и держать его на льду.
4. поджелудочная железа пищеварение
- Поместите каждую 50-мл пробирку в ванну воды 37 ° C. Инкубируйте 15-20 мин (время зависит от штамма и возраст мышей).
- Вибрация трубки с помощью вихря.
- Бассейн переваривается 4-5 поджелудочной железы в большой стерильные раковиной фильтр и использовать совок чтобы развалиться тщательно поджелудочной железы. Используйте 23 G иглы и 10 мл шприц, содержащие промывочный раствор для насильственно Пипетка усваивается клетками на экране. Соберите промывочного раствора в 50-мл.
- Центрифуга трубы в 97 x г на 4 ° C за 1 мин и сцеживаться супернатант.
- Добавить 25 мл промывочного раствора в трубки и вновь приостановить ткани, нежный vortexing. Спин вниз тканей в 97 x г на 4 ° C за 1 мин и сцеживаться супернатант. Повторите процедуру 3 раза. Будьте осторожны, чтобы не вытеснить гранулированных ткани.
5. Очистка островков
- Добавить 10 мл раствора очистки гранул промывают ткани и нежно ресуспензируйте содержимое.
- Аккуратно наложение 5 мл раствора изоляции на решение очистки. Будьте осторожны, чтобы сохранить острый жидкий интерфейс между двумя решениями.
- Центрифуга трубки на 560 x g при 4 ° C на 15 мин с медленным ускорение и без тормозов. Вставьте дозатор в интерфейсе и собирать слой островков в новые трубы 50 мл.
- Вымойте островки, как описано в шаге 3.5.
6. обшивка и лечение островковых клеток
- Ресуспензируйте островки в 10 мл раствора островки культуры, осторожно перемешать и место 100 мкл/колодец с многоканальные пипетки на плиту 96-луночных. Место примерно 5 островков на 96 хорошо.
- Место пластину в инкубатор культуры ткани для 12 h.
- Центрифуга (112 x g) 96-луночных пластины и удалить питательной среды.
- Разбавьте окружающей среды химических веществ в среде культуры островков. Добавьте 100 мкл каждого из химических растворителей в отдельной скважины пластины. Ресуспензируйте островков в каждой скважине и инкубировать в течение 12 ч при 37 ° C (концентрация варьируется для различных окружающей среды химических веществ).
7. Рось окрашивание и измерения
- После лечения островков, мыть с ПБС (200 мкл для каждого 96-луночных).
Примечание: Концентрация химических веществ является следующим: АВ1: 3 мкм, атразина: 100 мкм, Бат: 10 мкм, BPA: 100 мкм, β-эстроген, PCB126: 10 мкм, нонилфенол и BPA: 100 мкм. - Использование N-ацетил-цистеин (NAC) как антиоксидант для утоления рос. Добавить 5 мм НАК в рос индуцированной химических растворителей и инкубировать в течение 12 ч при 37 ° C.
- Центрифуга 96-луночных пластины на 112 x g и инкубировать раствором 5 мкм флуоресцентного зонда (H2-DCFH-DA растворяют в СМИ RPMI) при 37 ° C 60 мин.
- Промыть обработанные островковых клеток 3 раза с PBS и измерения флуоресценции с Считыватель микропланшетов на 488 нм.
Примечание: Накопление ФСР в клетках могут быть измерены путем увеличения в флуоресцировании на 530 нм, когда образец спешит на 488 нм. - Выполните инсулина глюкоза стимулирует секрецию (ССГС) пробирного9 на заставить ROS ксенобиотик лечение островков и неочищенных островков для измерения ксенобиотиков воздействия на физиологические функции панкреатических островков.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Микрофотография здорового изолированных островок показано на Рисунок 2, у островками круглой или овальной формы с относительно единообразные размер (хотя размер единообразие может варьироваться от деформации напряжения). Далее мы исследовали функции поджелудочной островок в assay в vitro изоляции островок и стимулируя секрецию инсулина в островки культуры. Рисунок 3 показывает наш типичный анализ ССГС assay от C57BL/6 мыши изолированные островки индуцированных 3,3 мм и 16,7 мм глюкозы9.
С помощью метода экрана формат пластины, мы определили несколько ксенобиотиков, вызвавшие значительные индукции рос в островковых клеток (рис. 4). Мы лечение изолированных островков с различными химическими веществами для 12 h и нашли что Атразин, BPA, Бат и PCB126, и β-эстрогена может привести к значительным индукции рос в изолированные островки10,11,12 , 13.
Хотя ROS не равна индукции diabetogenic, имеется достаточно свидетельств, указывающих важную роль рос в повреждения физиологические функции поджелудочной железы β-клеток, что приводит к T2DM8. Таким образом работа значение для идентификации этих ROS, вызывая химический как начальный экран. Кроме того определены соединений можно дополнительно проанализированы в пробирке в системе культуры изолированных поджелудочной островок клеток, описанные в рукописи. Мы показали эффекты заставить ROS ксенобиотиков на глюкозу стимулирующий секрецию инсулина изолированных островков, которые кратко представить diabetogenic данные для этих проверенных соединений. Панкреатических островков, предварительно обработанных с PCB126 и BPA показали значительное снижение секреции инсулина, чем в контрольной группе (рис. 5).
Рисунок 1 : Процедура мыши поджелудочной железы перфузии. Процедура состоит из следующих этапов: (1) найти ампула и использовать две пары Изогнутый пинцет для зажима ампула. (2) Вставьте иглу через общие желчи. (3) медленно вводить 3 мл бульона коллагеназы раствор в шприц 5 мл. (4) сбор растянутый поджелудочной железы, начиная от двенадцатиперстной кишки.
Рисунок 2 : Изолированные островки мыши. Показываются изолированные мыши панкреатических островков в культурной среде. Бар в масштабе 500 мкм.
Рисунок 3 : Инсулина глюкоза стимулирует секрецию изолированных панкреатических островков. Секреции инсулина глюкоза стимулирует дозозависимый (1, 3.3 и 16,7 мм, лечения 15 мин) был измерен в изолированных островков (в среднем 5 островков в колодец), с помощью мыши инсулина ELISA комплект. Планки погрешностей Показать стандартных отклонений. p < 0,05.
Рисунок 4 : Индукция ROS путем ксенобиотиков в изолированных островков от мышей C57BL/6. (A) изолированные островки были лечение 12 h и витражи с флуоресцентной краской 2' 7'-dichlorofluorescein (DCFH-DA) за 1 ч. Флюоресценция определяется флуоресценции пластины читателя. (B), химико индуцированной ROS были угасает, НАК (5 мм). (АВ1: 3 мкм, атразина: 100 мкм, Бат: 10 мкм, BPA: 100 мкм, PCB126: 10 мкм, нонилфенол, BPA: 100 мкм и НАК: 5 мм). Планки погрешностей Показать стандартных отклонений. p < 0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 : Ксенобиотиков влияние на секрецию инсулина глюкоза стимулирует изолированных островков. Изолированные островки были предварительно обработанных с PCB126, β-эстрогена и BPA (4 ч) и хранится в островок культуры среднего за 1 ч. Супернатант островки собранные для измерения инсулина, коммерчески доступных мыши инсулина ELISA assay. Планки погрешностей Показать стандартных отклонений. p < 0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Накопление доказательств свидетельствует о том, что воздействие окружающей среды химических веществ играет важную роль в развитии T2DM. Ксенобиотиков индуцированной ROS была признана потенциальным этиологического фактора, способствующих развитию T2DM. Люди подвергаются воздействию широкого круга ксенобиотиков химических веществ, и существует большая потребность Роман исследовательские методы для эффективного выявления токсикантов поджелудочной железы и исследовать механизм токсичности конкретных клеток поджелудочной железы.
В этом исследовании, на основе опубликованных процедур14мы разработали протокол, чтобы изолировать панкреатических островков от мыши и экрана клетки с ксенобиотиков химикаты для Оксидативный стресс индуцированного повреждения клеток поджелудочной железы. Мы также использовать эту процедуру для расследования поджелудочной железы конкретные токсичные ответы, вызванных ксенобиотиков соединений. Чтобы получить поджелудочной железы от мыши, мы предпочитаем использовать Авертен над другими анестезии, потому что она не изменяет уровень глюкозы в крови и не влияет на сосудистую поджелудочной железы15,16,17. Мы обнаружили, что плотность градиентного центрифугирования шаг очень важен для изоляции островок с высокой чистоты. Следует позаботиться о том, чтобы получить собственный слой между polysucrose натрия и изоляции фазы буфер для получения образца чисто островков, лишенный мусора и экзокринной клеток/тканей. Этот метод может использоваться для анализа в vitro химического воздействия на окружающую среду на поджелудочной островок физиологии, таких как assay ССГС (как показано на рис. 3). Островки следует тщательно разогнали с неоднократные дозирование в отдельные ячейки для обеспечения форме ячейки номер в пластину 96-клеточной культуры. Метод, описанный здесь сочетаются изоляции островок и быстрого анализа для поколение ROS и поэтому является простой и эффективной начальный экран для потенциальных поджелудочной железы вредных химических веществ.
Мы использовали секреции инсулина в ответ на вызов глюкозы для подтверждения личности изолированных островков поджелудочной железы. Процедура является весьма гибкой для анализа изменений в параметрах, включая секреции инсулина (рис. 3) и лагеря поколения, в ответ на ксенобиотиков лечения18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантом пилотного проекта от CREH центра под эгидой NIEHS и Национальный фонд естественных наук Китая (№ 31572626).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10×Hank’s balanced salt solution | GIBCO | 14185-052 | |
| Collagenase Type 4 | Worthington Biochemical Corporation | CLS-4 | |
| polysucrose/sodium diatrizoate solution | Sigma | 10771 | |
| 2’,7’-dichlorofluorescein (DCFH-DA) | Sigma | D6883-50MG | |
| fluorescence microplate reader | Biotek | ||
| L-glutamine | Sigma | G8540-25G | |
| streptomycin | GIBCO | 15140148 | |
| FBS | GIBCO | 26140079 | |
| RPMI 1640 | GIBCO | 11875-085 | |
| avertin | Sigma | T48402-25G | |
| Rat/Mouse Insulin ELISA Kit | Millipore | EZRMI-13K | |
| Centrifuge | Sorval | Sorval RT7 | for 96-well plate centrifuge |
| Microplate reader | Biotek | Epoch 2 | for fluorescence reading |
References
- Maruthur, N. M. The growing prevalence of type 2 diabetes: increased incidence or improved survival? Current diabetes reports. 13 (6), 786-794 (2013).
- Houstis, N., Rosen, E. D., Lander, E. S. Reactive oxygen species have a causal role in multiple forms of insulin resistance. Nature. 440 (7086), 944-948 (2006).
- Ma, Z. A., Zhao, Z., Turk, J. Mitochondrial dysfunction and beta-cell failure in type 2 diabetes mellitus. Exp Diabetes Res. , 703538 (2012).
- Valavanidis, A., Vlahogianni, T., Dassenakis, M., Scoullos, M. Molecular biomarkers of oxidative stress in aquatic organisms in relation to toxic environmental pollutants. Ecotoxicology and environmental safety. 64 (2), 178-189 (2006).
- Robertson, R. P., Harmon, J., Tran, P. O., Tanaka, Y., Takahashi, H. Glucose toxicity in β-cells: type 2 diabetes, good radicals gone bad, and the glutathione connection. Diabetes. 52 (3), 581-587 (2003).
- Kaneto, H., et al. Oxidative stress induces p21 expression in pancreatic islet cells: possible implication in beta-cell dysfunction. Diabetologia. 42 (9), 1093-1097 (1999).
- Maechler, P., Jornot, L., Wollheim, C. B. Hydrogen peroxide alters mitochondrial activation and insulin secretion in pancreatic beta cells. Journal of Biological Chemistry. 274 (39), 27905-27913 (1999).
- Gao, D., et al. The effects of palmitate on hepatic insulin resistance are mediated by NADPH Oxidase 3-derived reactive oxygen species through JNK and p38MAPK pathways. Journal of Biological Chemistry. 285 (39), 29965-29973 (2010).
- Efendić, S., et al. Pancreastatin and islet hormone release. Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (20), 7257-7260 (1987).
- Tian, Y., Ke, S., Denison, M. S., Rabson, A. B., Gallo, M. A. Ah receptor and NF-κB interactions, a potential mechanism for dioxin toxicity. Journal of Biological Chemistry. 274 (1), 510-515 (1999).
- Cui, H., et al. Pregnane X receptor regulates the AhR/Cyp1A1 pathway and protects liver cells from benzo-[α]-pyrene-induced DNA damage. Toxicology Letters. 275, 67-76 (2017).
- Li, L. A., Wang, P. W. PCB126 induces differential changes in androgen, cortisol, and aldosterone biosynthesis in human adrenocortical H295R cells. Toxicological Sciences. 85 (1), 530-540 (2005).
- Asahi, J., et al. Bisphenol A induces endoplasmic reticulum stress-associated apoptosis in mouse non-parenchymal hepatocytes. Life sciences. 87 (13), 431-438 (2010).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Murine pancreatic islet isolation. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (7), e255 (2007).
- Kirstetter, P., Lagneau, F., Lucas, O., Krupa, Y., Marty, J. Role of endothelium in the modulation of isoflurane-induced vasodilatation in rat thoracic aorta. British journal of anaesthesia. 79 (1), 84-87 (1997).
- Brown, E., Umino, Y., Loi, T., Solessio, E., Barlow, R. Anesthesia can cause sustained hyperglycemia in C57/BL6J mice. Visual neuroscience. 22 (5), 615-618 (2005).
- Vaupel, D., McCoun, D., Cone, E. J. Phencyclidine analogs and precursors: rotarod and lethal dose studies in the mouse. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 230 (1), 20-27 (1984).
- Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination. Journal of visualized experiments: JoVE. (88), (2014).
