Summary
Hier presenteren we een protocol om te isoleren van de alvleesklier eilandjecellen muis voor het screenen van de ROS inducties door de xenobiotica teneinde de potentiële diabetogenic xenobiotische chemische stoffen.
Abstract
Blootstelling aan bepaalde ecologische stoffen in mens en dier heeft gevonden om cellulaire schade van de alvleesklier β-cellen die tot de ontwikkeling van type 2 diabetes mellitus (T2DM leiden zal). Hoewel de mechanismen voor de chemische-geïnduceerde β celbeschadiging waren onduidelijk en waarschijnlijk te complex, is een terugkerende bevinding dat deze chemische stoffen veroorzaken oxidatieve stress die leidt tot de generatie van buitensporige reactieve zuurstof soorten (ROS), die het veroorzaken van schade aan de β-cel. Voor de identificatie van potentiële diabetogenic milieu chemicaliën zijn we geïsoleerd alvleesklier eilandjecellen van C57BL/6 muizen en gekweekte eilandjecellen in 96-Wells cel cultuur platen; vervolgens de eilandjecellen waren gedoseerd met chemicaliën en de ROS-generatie werd ontdekt door 2', 7'-dichlorofluorescein (DCFH-DA) fluorescente kleurstof. Met behulp van deze methode, wij gevonden dat Bisfenol A (BPA), Benzo [a] pyreen (BaP) en polychloorbifenylen (PCB's), kunnen induceren hoge niveaus van ROS, suggereren dat ze mogelijk schade in eilandjecellen veroorzaken. Deze methode moet zinvol zijn voor het screenen van diabetogenic xenobiotica. De gekweekte eilandjecellen kunnen daarnaast ook worden aangepast voor in vitro analyse van chemische-geïnduceerde toxiciteit in cellen van de alvleesklier.
Introduction
Stijgingen in de prevalentie van T2DM zijn een wereldwijde gezondheidscrisis geworden in de afgelopen jaren, die een ernstige bedreiging voor de volksgezondheid1. Vele factoren hebben gevonden causaal verband met de ontwikkeling van T2DM, waaronder, terugkerende bevindingen suggereren dat een gemeenschappelijk convergerende punt voor deze factoren is de inductie van oxidatieve stress die tot de generatie van buitensporige ROS2 leidt , 3.
Een breed spectrum van milieu chemische stoffen zoals PCB's, dioxinen en BaP is gebleken voor het opwekken van oxidatieve stress, die kan de functie van de alvleesklier β-cellen aantasten en leiden tot insulineresistentie en T2DM4. Hoewel het fysiologische niveau van ROS een belangrijke rol in de cellulaire functies speelt, blootstelling aan ROS die hoger is dan de capaciteit van de antioxidant-systeem resulteert in de schade aan de cellen/weefsels en leidt tot ziekten5. Cellen van de alvleesklier β express een laag niveau van anti-oxidant enzym en zijn dus een gevoelige doelgroep voor de oxidatieve stress-gemedieerde schade6,7. Chronische blootstelling aan hoge niveaus van ROS is aangetoond dat het stress-geïnduceerde alvleesklier cel dysfunctie5 veroorzaken evenals insulineresistentie in de lever en het vetweefsel8.
Het algemene doel van dit project is het ontwikkelen van een cel-gebaseerde bepaling aan scherm chemicaliën voor hun potentieel van de diabetogenic op basis van hun inductie van ROS in cellen van de alvleesklier. De alvleesklier mist metabole ontgifting en is een gevoelige doelwit voor xenobioticum veroorzaakte schade6,7. Dus, door het direct meten van de ROS gegenereerd in de cellen in de alvleesklier, deze bepaling dient een directe benadering van de chemische stof veroorzaakte schade in de alvleesklier. Ontwikkeling van deze methode, wij geïsoleerd muis alvleesklier eilandjes, gekweekt van de geïsoleerde islet onder cel cultuur voorwaarde met chemicaliën en de chemische-geïnduceerde ROS generatie als de uitlezing gebruikt. Deze procedure is eenvoudig en effectief in het identificeren van ROS-inducerende chemicaliën in het geïsoleerde rotseilandje; het kan verder worden ontwikkeld voor onderzoek van de mechanismen van toxiciteit die specifiek voor de alvleesklier in vitro zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven zijn uitgevoerd met inachtneming van alle relevante richtlijnen, verordeningen en regelgevende agentschappen. Het protocol wordt gedemonstreerd werd uitgevoerd onder leiding en goedkeuring van de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de Texas A & M Instituut voor Genomic geneeskunde.
1. oplossing voorbereiding
- Verdun 10 x Henks evenwichtige zout oplossing 1 x met dubbel gedestilleerd H2O en bewaren bij 4 ° C.
- Bereid de isolatie-oplossing door het toevoegen van HEPES (10 mM), MgCl2 (1 mM) en glucose (5 mM). Breng de pH op 7.4 en houd op ijs.
- Bereid de oplossing collagenase van collagenase Type 4.
Opmerking: In het bijzonder bevat collagenase Type 4 160 U per mg droog gewicht. 1 g collagenase Type 4 wordt in 5 mL dubbel gedestilleerd H2O met een concentratie van 200 mg/mL verdund. 2 mL van de verdunde Collagenase aan 30 mL ijs koude isolatie-oplossing is toegevoegd, en 6 mL collagenase oplossing wordt overgedragen aan een tube van 50 mL voor elke muis. - Bereid de oplossing van wassen door toevoeging van 1 mM CaCl2 aan de isolatie-oplossing.
- Bereid de oplossing van de zuivering met koude polysucrose/natrium diatrizoate oplossing (1.1119 g/mL, 5 mL).
- 500 mL islet kweekmedium voorbereiden door toevoeging van L-glutamine (20 mM), penicilline (100 U/mL), streptomycine (100 µg/mL) en foetale runderserum (FBS) (10%) tot RPMI medium.
- De DCFH-DA-stockoplossing voorbereiden door de ontbinding van het poeder in gedistilleerd water van 200 µM en winkel bij-20 ° C.
Opmerking: De ROS kleurstofoplossing wordt vers gemaakt door verdunning van de stockoplossing van het DCFH-DA aan de uiteindelijke concentratie van 5 µM in RPMI. Dit reagens moet worden beschermd tegen licht.
2. chirurgische voorbereiding
- Intraperitoneally injecteren (I.P.) een muis met avertin (2.5% avertin, 0.4 mL/20 g). Nadat de muis is volledig verdoofd en niet langer reageert op achterste voet snuifjes, euthanaseren van de muis en verplaats naar de biologische kap.
- Plaats de euthanized muis met de abdominale zijde naar boven en spray de huid met 70% ethanol voor sterilisatie.
- Open de buikholte met een 1 cm U-incisie op de bovenbuik en intrekken van de huid in de rostraal richting over de borst te bloot van de buikholte.
3. de alvleesklier perfusie en verwijdering
- Zoals geïllustreerd in Figuur 1, vinden de locatie van de Papil. Gebruik een paar gebogen pincet naar de twaalfvingerige darm klem dicht bij de positie van de sfincter van Oddi. Gebruik een ander paar van gebogen verlostang om de klem van de wand van de twaalfvingerige darm om te blokkeren van het traject van de gal in de twaalfvingerige darm.
Opmerking: De ampul is niet geplaatst in deze stap. Deze stap is bedoeld om te blokkeren van het traject van de gal in de twaalfvingerige darm. - Verplaats de muis met het proximale hoofd en de voeten distale met betrekking tot de onderzoeker.
- Vind de Galgang en 3 mL collagenase oplossing langzaam te injecteren met een 30 G naald en 5 mL spuit. Zorg ervoor dat de Galgang en de alvleesklier worden opgeblazen na de injectie.
- Verwijder de opgezwollen alvleesklier met behulp van de gebogen pincet en fijne schaar te scheiden van de dalende dikke darm, darmen, maag en milt. De alvleesklier plaats in een 50 mL-buis met 3 mL collagenase oplossing en bewaar deze op ijs.
4. de alvleesklier, spijsvertering
- Elke 50 mL-buis in een waterbad 37 ° C te plaatsen. Incubeer gedurende 15-20 min (tijd varieert met de stam en leeftijd van de muizen).
- Het trillen van de buis met behulp van een vortex.
- Groep 4-5 verteerd alvleesklier in een grote steriele wastafel zeef en een bolletje gebruik te maken van de alvleesklier grondig uit elkaar vallen. Gebruik een 23 G naald en 10 mL spuit met wassen oplossing om krachtig Pipetteer de verteerd cellen vandoor naar de zeef. Verzamel de wash-oplossing in een 50 mL-buis.
- Centrifugeer de buizen bij 97 x g bij 4 ° C voor 1 min en decanteren van de bovendrijvende substantie.
- Voeg 25 mL wassen oplossing buizen en resuspendeer de weefsel door zachte vortexing. Spin down de weefsels bij 97 x g bij 4 ° C voor 1 min en decanteren van de bovendrijvende substantie. Herhaal dit voor 3 keer. Wees voorzichtig niet te verjagen de Ingehuld weefsel.
5. reiniging van eilandjes
- Voeg 10 mL van de reiniging oplossing aan de pellet van gewassen en voorzichtig resuspendeer de inhoud.
- Zachtjes overlay 5 mL van de oplossing van de isolatie op de reiniging oplossing. Wees voorzichtig met het houden van een scherpe vloeibare interface tussen de twee oplossingen.
- Centrifugeer de buis op 560 x g bij 4 ° C gedurende 15 minuten met langzame acceleratie en geen rem. Plaats de pipet in de interface en het verzamelen van de eilandjes laag in nieuwe 50 mL buizen.
- Wassen de eilandjes zoals beschreven in stap 3.5.
6. plating en behandelingvan eilandjecellen
- Resuspendeer de eilandjes in 10 mL eilandjes cultuur oplossing voorzichtig meng goed en plaats 100 µL per putje met een meerkanaalspipet aan een 96-wells-plaat. Ongeveer 5 eilandjes per 96 goed plaatsen.
- Plaats de plaat in de weefselkweek incubator voor 12u.
- Centrifugeer (112 x g) de 96-wells-plaat en verwijder het kweekmedium.
- Verdun de milieu chemische stoffen in het kweekmedium eilandjes. Voeg 100 µL van elk van de chemische verdunningsmiddelen in aparte putjes van de plaat. Resuspendeer de eilandjes in elk putje en incubeer gedurende 12 uur bij 37 ° C (de concentratie varieert voor de verschillende milieu chemische stoffen).
7. ROS kleuring en meting
- Na behandeling van de eilandjes, wassen met 1 x PBS (200 µL voor elke 96-Wells).
Opmerking: De concentratie van de chemicaliën is als volgt: AFB1: 3 µM, Atrazine: 100 µM, BaP: 10 µM, BPA: 100 µM, β-oestrogeen, PCB126: 10 µM, nonylfenol en BPA: 100 µM. - N-Acetyl-cysteïne (NAC) als een antioxidant gebruiken om quench ROS. Voeg van 5 mM van NAC aan de ROS-geïnduceerde chemische verdunningsmiddelen en incubeer gedurende 12 uur bij 37 ° C.
- De 96-wells-plaat bij 112 x g centrifugeren en met 5 µM oplossing van fluorescente sonde (H2-DCFH-DA opgelost in RPMI media) incuberen bij 37 ° C gedurende 60 minuten.
- Wassen van het behandelde eilandjecellen 3 keer met PBS en meten van de fluorescentie met een microplate-lezer op 488 nm.
Opmerking: De accumulatie van DCF in cellen kan worden gemeten door een toename in de fluorescentie bij 530 nm wanneer het monster is enthousiast op 488 nm. - De glucose-gestimuleerd insuline secretie (GSIS) assay9 uitvoeren op ROS-inducerende xenobioticum eilandjes en onbehandelde eilandjes om te meten de xenobiotische effecten op de fysiologische functie van de alvleesklier eilandjes behandeld.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een opname van het gezonde geïsoleerd eiland is afgebeeld in Figuur 2, waarin eilandjes een ronde of ovale vorm met relatief uniforme grootte hebben (hoewel uniformiteit van de grootte van stam tot stam variëren kan). Wij onderzocht vervolgens de alvleesklier islet functies in een in vitro assay door isoleren het rotseilandje en stimuleren de secretie van insuline in de eilandjes van de cultuur. Figuur 3 toont onze typische analyse van de GSIS bepaling van C57BL/6 muis geïsoleerde eilandjes geïnduceerd door 3.3 en 16.7 mM glucose9.
Met behulp van de methode plaat formaat scherm, hebben we verschillende xenobiotica waardoor aanzienlijke inductie van ROS in eilandjecellen (Figuur 4) vastgesteld. We behandeld van de geïsoleerde eilandjes met verschillende chemische stoffen voor 12u en vond dat Atrazine, BPA, BaP en PCB126en β-oestrogeen kan ervoor zorgen dat significante inductie van ROS in de geïsoleerde eilandjes10,11,12 , 13.
Hoewel ROS niet gelijk aan de diabetogenic-inductie is, is er voldoende bewijs die de belangrijke rol van ROS aangeeft in het veroorzaken van schade aan de fysiologische functies van de alvleesklier β-cellen, wat tot T2DM8 leidt. Daarom is de waarde van het werk te identificeren deze ROS inducerende chemische als het eerste scherm. Bovendien, de verbindingen geïdentificeerd kunnen worden verder geanalyseerd in vitro in de geïsoleerde alvleesklier islet celcultuur beschreven in het manuscript. Wij hebben de effecten van ROS-inducerende xenobiotica getoond op stimuleren van glucose insuline secretie van de geïsoleerde eilandjes, die kort diabetogenic gegevens te voor deze geteste stoffen leveren. Alvleesklier eilandjes vooraf behandeld met PCB126 en BPA toonde een significante afname van de insuline secretie dan de controlegroep (Figuur 5).
Figuur 1 : Procedure van muis alvleesklier perfusie. De procedure bestaat uit de volgende stappen: (1) vinden de Papil en twee paren van gebogen pincet gebruiken om te klem van de Papil. (2) plaats de naald door de gemeenschappelijke Gal. (3) langzaam injecteren 3 mL collagenase oplossing voorraad in de 5 mL spuit. (4) verzamelen de opgezwollen alvleesklier vanaf de twaalfvingerige darm.
Figuur 2 : Muis eilandjes geïsoleerd. Geïsoleerde muis alvleesklier eilandjes in cultuurmedium worden weergegeven. De bar van de schaal van 500 µm.
Figuur 3 : Glucose-gestimuleerd insuline secretie van geïsoleerde alvleesklier eilandjes. Dosis-afhankelijke glucose-gestimuleerd insuline secretie (1, 3.3 en 16.7 mM, behandeling gedurende 15 min) werd gemeten in geïsoleerde eilandjes (gemiddeld 5 eilandjes per putje), met behulp van een muis insuline ELISA kit. Foutbalken Toon standaarddeviaties. p < 0.05.
Figuur 4 : Inductie van ROS door xenobiotica in geïsoleerde eilandjes van C57BL/6 muizen. (A) geïsoleerde eilandjes werden behandeld voor 12u en gekleurd met fluorescentie kleurstof 2', 7'-dichlorofluorescein (DCFH-DA) gedurende 1 uur. De fluorescentie werd bepaald door een fluorescentie-afleesapparaat. (B) de chemische-geïnduceerde ROS waren uitgeblust door NAC (5 mM). (AFB1: 3 µM, Atrazine: 100 µM, BaP: 10 µM, BPA: 100 µM, PCB126: 10 µM, nonylfenol, BPA: 100 µM en NAC: 5 mM). Foutbalken Toon standaarddeviaties. p < 0.05. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 : Xenobiotische effecten op glucose-gestimuleerd insuline secretie van geïsoleerde eilandjes. Geïsoleerde eilandjes waren vooraf behandeld met PCB126, β-oestrogeen en BPA (4 h) en bewaard in islet kweekmedium gedurende 1 uur. De bovendrijvende substantie van de eilandjes werd verzameld voor meting van insuline door een commercieel beschikbare muis insuline ELISA test. Foutbalken Toon standaarddeviaties. p < 0.05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vergaren van bewijs suggereert dat de blootstelling aan chemicaliën milieu speelt een belangrijke rol in de ontwikkeling van T2DM. Xenobiotica-geïnduceerde ROS is erkend als een potentiële etiologische factor die bijdraagt tot de ontwikkeling van T2DM. Mensen worden blootgesteld aan een breed scala van xenobiotische chemische stoffen en er is een grote behoefte aan nieuwe onderzoekstechnieken effectief de alvleesklier toxische stoffen te identificeren en te onderzoeken van het mechanisme van toxiciteit die specifiek zijn voor de cellen in de alvleesklier.
In deze studie, op basis van gepubliceerde procedures14, hebben we een protocol bij het isoleren van de alvleesklier eilandjes van muis en scherm de cellen met xenobiotische chemicaliën voor oxidatieve stress-geïnduceerde schade aan de cellen in de alvleesklier. We gebruiken ook deze procedure om te onderzoeken de alvleesklier specifieke toxische reacties geïnduceerd door de xenobiotische verbindingen. Voor het verkrijgen van de alvleesklier van muis, die we graag gebruiken avertin over andere verdoving omdat het verandert niets aan de niveaus van de glucose van het bloed en heeft geen invloed op de therapieën van de alvleesklier15,16,17. We vonden dat de dichtheid kleurovergang centrifugeren stap cruciaal voor het isoleren van het eilandje met hoge zuiverheid is. Worden moet gewaakt voor de afzonderlijke laag tussen de polysucrose/natrium en isolatie buffer fase te verkrijgen van een steekproef van zuiver eilandjes, verstoken van puin en exocrine cellen/weefsels. De methode kan worden gebruikt voor in vitro analyse van chemische milieueffecten op alvleesklier islet fysiologie, zoals de GSIS assay (zoals weergegeven in Figuur 3). De eilandjes moeten zorgvuldig worden verspreid met herhaalde pipetting in afzonderlijke cellen om geüniformeerde celaantal in de plaat 96-celkweek. De beschreven methode hier gecombineerd het isolement van het rotseilandje en een snelle assay voor ROS generatie en daarom is een eenvoudige en effectieve eerste scherm voor potentiële alvleesklier-schadelijke chemicaliën.
We insuline secretie gebruikt in reactie op de uitdaging van de glucose te bevestigen van de identiteit van de geïsoleerde alvleesklier eilandjes. De procedure is zeer aanpasbaar voor analyse van veranderingen in de parameters, met inbegrip van insuline secretie (Figuur 3) en cAMP generatie, in reactie op xenobiotische behandelingen18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door een subsidie van het proefproject van CREH center gesponsord door NIEHS en door nationale Natural Science Foundation of China (nr. 31572626).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10×Hank’s balanced salt solution | GIBCO | 14185-052 | |
| Collagenase Type 4 | Worthington Biochemical Corporation | CLS-4 | |
| polysucrose/sodium diatrizoate solution | Sigma | 10771 | |
| 2’,7’-dichlorofluorescein (DCFH-DA) | Sigma | D6883-50MG | |
| fluorescence microplate reader | Biotek | ||
| L-glutamine | Sigma | G8540-25G | |
| streptomycin | GIBCO | 15140148 | |
| FBS | GIBCO | 26140079 | |
| RPMI 1640 | GIBCO | 11875-085 | |
| avertin | Sigma | T48402-25G | |
| Rat/Mouse Insulin ELISA Kit | Millipore | EZRMI-13K | |
| Centrifuge | Sorval | Sorval RT7 | for 96-well plate centrifuge |
| Microplate reader | Biotek | Epoch 2 | for fluorescence reading |
References
- Maruthur, N. M. The growing prevalence of type 2 diabetes: increased incidence or improved survival? Current diabetes reports. 13 (6), 786-794 (2013).
- Houstis, N., Rosen, E. D., Lander, E. S. Reactive oxygen species have a causal role in multiple forms of insulin resistance. Nature. 440 (7086), 944-948 (2006).
- Ma, Z. A., Zhao, Z., Turk, J. Mitochondrial dysfunction and beta-cell failure in type 2 diabetes mellitus. Exp Diabetes Res. , 703538 (2012).
- Valavanidis, A., Vlahogianni, T., Dassenakis, M., Scoullos, M. Molecular biomarkers of oxidative stress in aquatic organisms in relation to toxic environmental pollutants. Ecotoxicology and environmental safety. 64 (2), 178-189 (2006).
- Robertson, R. P., Harmon, J., Tran, P. O., Tanaka, Y., Takahashi, H. Glucose toxicity in β-cells: type 2 diabetes, good radicals gone bad, and the glutathione connection. Diabetes. 52 (3), 581-587 (2003).
- Kaneto, H., et al. Oxidative stress induces p21 expression in pancreatic islet cells: possible implication in beta-cell dysfunction. Diabetologia. 42 (9), 1093-1097 (1999).
- Maechler, P., Jornot, L., Wollheim, C. B. Hydrogen peroxide alters mitochondrial activation and insulin secretion in pancreatic beta cells. Journal of Biological Chemistry. 274 (39), 27905-27913 (1999).
- Gao, D., et al. The effects of palmitate on hepatic insulin resistance are mediated by NADPH Oxidase 3-derived reactive oxygen species through JNK and p38MAPK pathways. Journal of Biological Chemistry. 285 (39), 29965-29973 (2010).
- Efendić, S., et al. Pancreastatin and islet hormone release. Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (20), 7257-7260 (1987).
- Tian, Y., Ke, S., Denison, M. S., Rabson, A. B., Gallo, M. A. Ah receptor and NF-κB interactions, a potential mechanism for dioxin toxicity. Journal of Biological Chemistry. 274 (1), 510-515 (1999).
- Cui, H., et al. Pregnane X receptor regulates the AhR/Cyp1A1 pathway and protects liver cells from benzo-[α]-pyrene-induced DNA damage. Toxicology Letters. 275, 67-76 (2017).
- Li, L. A., Wang, P. W. PCB126 induces differential changes in androgen, cortisol, and aldosterone biosynthesis in human adrenocortical H295R cells. Toxicological Sciences. 85 (1), 530-540 (2005).
- Asahi, J., et al. Bisphenol A induces endoplasmic reticulum stress-associated apoptosis in mouse non-parenchymal hepatocytes. Life sciences. 87 (13), 431-438 (2010).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Murine pancreatic islet isolation. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (7), e255 (2007).
- Kirstetter, P., Lagneau, F., Lucas, O., Krupa, Y., Marty, J. Role of endothelium in the modulation of isoflurane-induced vasodilatation in rat thoracic aorta. British journal of anaesthesia. 79 (1), 84-87 (1997).
- Brown, E., Umino, Y., Loi, T., Solessio, E., Barlow, R. Anesthesia can cause sustained hyperglycemia in C57/BL6J mice. Visual neuroscience. 22 (5), 615-618 (2005).
- Vaupel, D., McCoun, D., Cone, E. J. Phencyclidine analogs and precursors: rotarod and lethal dose studies in the mouse. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 230 (1), 20-27 (1984).
- Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination. Journal of visualized experiments: JoVE. (88), (2014).
