Summary
यहां हम xenobiotics द्वारा ROS प्रेरण स्क्रीनिंग के लिए माउस अग्नाशय टाप कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत क्रम में संभावित diabetogenic xenobiotic रसायनों की पहचान करने के लिए ।
Abstract
मानव और पशुओं में कुछ पर्यावरणीय रसायनों के संपर्क में अग्नाशय β कोशिकाओं के सेलुलर नुकसान का कारण पाया गया है जो टाइप 2 मधुमेह (T2DM) के विकास के लिए नेतृत्व करेंगे । हालांकि रासायनिक के लिए तंत्र-प्रेरित β कोशिका क्षति अस्पष्ट और जटिल होने की संभावना थे, एक आवर्ती खोज है कि इन रसायनों ऑक्सीडेटिव तनाव अत्यधिक प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) जो नुकसान के लिए प्रेरित की पीढ़ी के लिए अग्रणी प्रेरित β कक्ष. संभावित diabetogenic पर्यावरणीय रसायनों की पहचान करने के लिए, हम C57BL/6 चूहों और ९६-well सेल कल्चर प्लेटों में कल्चरल टाप सेल से अग्नाशय टाप कोशिकाओं अलग; इसके बाद, टाप कोशिकाओं को रसायनों से खुराक दी गई और ROS जनरेशन को 2 ', 7 '-dichlorofluorescein (DCFH-DA) फ्लोरोसेंट डाई का पता चला । इस विधि का प्रयोग, हमने पाया है कि bisphenol एक (BPA), Benzo [एक] pyrene (BaP), और polychlorinated biphenyls (पीसीबी), ROS के उच्च स्तर को प्रेरित कर सकता है, सुझाव है कि वे संभवतः टाप कोशिकाओं में नुकसान पैदा कर सकता है. यह विधि diabetogenic xenobiotics को परखने के लिए उपयोगी होनी चाहिए । इसके अलावा, संस्कृतिक टाप कोशिकाओं को भी इन विट्रो में अग्नाशय कोशिकाओं में रासायनिक प्रेरित विषाक्तता के विश्लेषण के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।
Introduction
T2DM की व्यापकता में वृद्धि हाल के वर्षों में एक वैश्विक स्वास्थ्य संकट बन गए है सार्वजनिक स्वास्थ्य1के लिए एक गंभीर खतरा खड़ी । कई कारकों के लिए कारण T2DM के विकास से जुड़ा हो पाया गया है, जो बीच में, आवर्ती निष्कर्षों का सुझाव है कि इन कारकों के लिए एक आम अभिसरण बिंदु ऑक्सीडेटिव तनाव की प्रेरण जो अत्यधिक ROS2 की पीढ़ी की ओर जाता है , 3.
पीसीबी, डाइअॉकॉ्सिन सहित पर्यावरणीय रसायनों की एक व्यापक स्पेक्ट्रम, और BaP ऑक्सीडेटिव तनाव पैदा करने के लिए पाया गया है, जो अग्नाशय β कोशिकाओं के समारोह ख़राब कर सकते हैं और इंसुलिन प्रतिरोध और T2DM4के लिए नेतृत्व. हालांकि ROS के शारीरिक स्तर सेलुलर कार्यों में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, ROS कि कोशिकाओं को नुकसान में एंटीऑक्सीडेंट प्रणाली के परिणाम की क्षमता से अधिक है/ऊतकों और रोगों की ओर जाता है5. अग्नाशय β कोशिकाओं एंटीऑक्सीडेंट एंजाइम के एक निम्न स्तर व्यक्त, और इस प्रकार ऑक्सीडेटिव तनाव के लिए एक संवेदनशील लक्ष्य-6,7की मध्यस्थता नुकसान कर रहे हैं. ROS के उच्च स्तर के लिए पुरानी जोखिम तनाव प्रेरित अग्नाशय कोशिका रोग5 के रूप में के रूप में अच्छी तरह से जिगर और वसा ऊतक में इंसुलिन प्रतिरोध के कारण दिखाया गया है8.
इस परियोजना का समग्र लक्ष्य एक कोशिका को विकसित करने के लिए परख के लिए अपने diabetogenic अग्नाशय कोशिकाओं में ROS की प्रेरण के आधार पर क्षमता के लिए रसायनों स्क्रीन है । अग्ंयाशय चयापचय detoxification का अभाव है और xenobiotic प्रेरित नुकसान6,7के लिए एक संवेदनशील लक्ष्य है । इसलिए, सीधे अग्नाशय कोशिकाओं में उत्पन्न ROS को मापने के द्वारा, इस परख अग्न्याशय में रासायनिक प्रेरित चोट के एक प्रत्यक्ष सन्निकटन प्रदान करना चाहिए. इस विधि को विकसित करने के लिए, हम अलग माउस अग्नाशय के टाप, रसायन के साथ कोशिका संस्कृति हालत के तहत पृथक टाप कल्चरित, और readout के रूप में रासायनिक प्रेरित ROS पीढ़ी का उपयोग किया । इस प्रक्रिया को अलग टाप में ROS उत्प्रेरण रसायनों की पहचान करने में सरल और प्रभावी है; यह और विषाक्तता के तंत्र है कि इन विट्रो मेंअग्ंयाशय के लिए विशिष्ट है की जांच के लिए विकसित किया जा सकता है ।
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Protocol
सभी संबंधित दिशानिर्देशों, विनियमों और विनियामक एजेंसियों के अनुपालन में सभी पशु प्रयोगों का निष्पादन किया गया. प्रोटोकॉल का प्रदर्शन किया जा रहा मार्गदर्शन और संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति के अनुमोदन के तहत किया गया था (IACUC) टेक्सास के एक एंड एम संस्थान जीनोमिक चिकित्सा के लिए ।
1. समाधान तैयारी
- डबल आसुत एच2हे, और 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान के साथ 1x के लिए 10x है हांक संतुलित नमक समाधान पतला ।
- HEPES (10 मिमी), MgCl2 (1 मिमी), और ग्लूकोज (5 मिमी) जोड़कर आइसोलेशन समाधान तैयार करें । ७.४ के लिए पीएच समायोजित करें और बर्फ पर रखें ।
- collagenase प्रकार 4 से collagenase समाधान तैयार करें ।
नोट: विशेष रूप से, collagenase प्रकार 4 शुष्क वजन के मिलीग्राम प्रति १६० U शामिल हैं । 1 जी का collagenase टाइप 4 5 मिलीलीटर में पतला है डबल आसुत एच2हे २०० मिलीग्राम/एमएल की एकाग्रता के साथ । पतला Collagenase के 2 मिलीलीटर 30 मिलीलीटर बर्फ ठंड अलगाव समाधान के लिए जोड़ा गया है, और Collagenase समाधान के 6 मिलीलीटर प्रत्येक माउस के लिए एक ५० मिलीलीटर ट्यूब को हस्तांतरित किया है । - आइसोलेशन समाधान के लिए 1 mM CaCl2 जोड़कर वाश समाधान तैयार करें ।
- शीत polysucrose/सोडियम diatrizoate समाधान (१.१११९ ग्राम/एमएल, 5 एमएल) के साथ शुद्धि समाधान तैयार करें ।
- L-glutamine (20 मिमी), पेनिसिलिन (१०० U/एमएल), streptomycin (१०० µ g/एमएल), और भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) (10%) RPMI माध्यम में जोड़कर टाप कल्चरल मीडियम के ५०० मिलीलीटर तैयार करें ।
- आसुत जल में पाउडर को भंग करके DCFH-DA स्टॉक समाधान तैयार करें २०० µ m पर और स्टोर-20 ° c ।
नोट: ROS धुंधला समाधान हौसले से कमजोर DCFH द्वारा किया जाता है-RPMI में 5 µ मीटर की अंतिम एकाग्रता के लिए दा स्टॉक समाधान । इस रिएजेंट को लाइट से सुरक्षित किया जाना चाहिए ।
2. सर्जिकल तैयारी
- Intraperitoneally सुई (आईएफसआई) avertin के साथ एक चूहा (२.५% avertin, ०.४ मिलीलीटर/ के बाद माउस पूरी तरह से anesthetized है और अब हिंद पैर चुटकी, euthanize माउस और जैविक डाकू के लिए कदम का जवाब ।
- पेट की ओर का सामना करना पड़ के साथ euthanized माउस प्लेस और नसबंदी के लिए ७०% इथेनॉल के साथ त्वचा स्प्रे ।
- पेट के ऊपरी हिस्से पर 1 सेमी U-चीरा के साथ उदर गुहा खोलें और उदर गुहा को बेनकाब करने के लिए छाती पर rostral दिशा में त्वचा को वापस लेना ।
3. अग्ंयाशय छिड़काव और हटाने
- जैसा चित्र 1में सचित्र है, कलसा का स्थान ढूंढें । घुमावदार संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करने के लिए ग्रहणी Oddi के लुगदी की स्थिति के करीब दबाना । घुमावदार संदंश की एक और जोड़ी का उपयोग ग्रहणी दीवार ग्रहणी में पित्त मार्ग ब्लॉक दबाना करने के लिए ।
नोट: इस चरण में कलसा को नहीं डाला गया है । इस चरण के लिए ग्रहणी में पित्त मार्ग ब्लॉक करने के लिए होती है । - सिर समीपस्थ के साथ माउस की स्थिति और बाहर के साथ बाहर पैर शोधकर्ता के संबंध है ।
- आम पित्त नलिका का पता लगाएं और धीरे से एक 30 जी सुई और 5 मिलीलीटर सिरिंज के साथ collagenase समाधान के 3 मिलीलीटर सुई । सुनिश्चित करें कि आम पित्त नलिका और अग्ंयाशय इंजेक्शन के बाद फुलाया जाता है ।
- मुड़ा हुआ संदंश और ठीक कैंची का उपयोग कर इसे अवरोही बृहदांत्र, आंतों, पेट, और तिल्ली से अलग करने के लिए इस्तेमाल अग्ंयाशय निकालें । एक ५०-एमएल ट्यूब collagenase समाधान के 3 मिलीलीटर युक्त में अग्ंयाशय प्लेस और यह बर्फ पर रहते हैं ।
4. अग्ंयाशय पाचन
- एक ३७ ° c जल स्नान में प्रत्येक ५०-एमएल ट्यूब प्लेस । 15-20 मिनट के लिए मशीन (समय तनाव और चूहों की उंर के साथ बदलता है) ।
- एक भंवर का उपयोग कर ट्यूब कांपना ।
- पूल 4-5 एक बड़े बाँझ सिंक छलनी में पचा अग्ंयाशय और अग्ंयाशय के अलावा अच्छी तरह से गिर बनाने के लिए एक स्कूप का उपयोग करें । स्क्रीन से पच कोशिकाओं को जबरदस्ती पिपेट करने के लिए एक 23 जी सुई और 10 मिलीलीटर सिरिंज युक्त वॉश सॉल्यूशन का उपयोग करें । एक ५०-एमएल ट्यूब में धो समाधान लीजिए ।
- 1 मिनट के लिए 4 ° c पर ९७ x g पर ट्यूबों और supernatant नहीं कर सकते हैं ।
- ट्यूबों के लिए धोने समाधान के 25 मिलीलीटर जोड़ें और कोमल भंवर से ऊतक को फिर से निलंबित । 1 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ९७ x जी में ऊतक नीचे स्पिन और supernatant के लिए खिचड़ी भाषा । 3 बार के लिए दोहराएं । छर्रों ऊतक बेदखल करने के लिए नहीं सावधान रहना ।
5. टाप का शुद्धिकरण
- धो ऊतक गोली के लिए शुद्धि समाधान के 10 मिलीलीटर जोड़ें और धीरे सामग्री reसस्पेंड ।
- धीरे शुद्धि समाधान पर अलगाव समाधान के 5 मिलीलीटर ओवरले । दो समाधानों के बीच एक तेज तरल इंटरफेस रखने के लिए सावधान रहें ।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर ५६० x g पर ट्यूब धीमी गति और कोई ब्रेक के साथ 15 मिनट के लिए केंद्रापसारक । इंटरफ़ेस में पिपेट डालें और नए ५० मिलीलीटर ट्यूबों में टाप लेयर एकत्र करें ।
- ३.५ चरण में वर्णित के रूप में टाप धो लें ।
6. टाप कोशिकाओं का चढ़ाना और उपचार
- टाप संस्कृति समाधान के 10 मिलीलीटर में टाप reसस्पेंड, धीरे अच्छी तरह से मिश्रण है, और जगह १०० µ एल/अच्छी तरह से एक ९६-अच्छी तरह से थाली के लिए एक मल्टीचैनल पिपेट के साथ । ९६ प्रति लगभग 5 टाप प्लेस अच्छी तरह से ।
- 12 एच के लिए ऊतक संस्कृति मशीन में थाली प्लेस ।
- केंद्रापसारक (११२ x जी) ९६-अच्छी तरह से थाली और संस्कृति माध्यम हटा दें ।
- टाप कल्चर मीडियम में पर्यावरणीय रसायनों को पतला करना । प्रत्येक रासायनिक diluents के १०० µ एल जोड़ें थाली के अलग कुओं में । एक अच्छी तरह से और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 12 घंटे के लिए गर्मी में टाप reसस्पेंड (एकाग्रता अलग पर्यावरण रसायनों के लिए बदलता है) ।
7. ROS धुंधला और माप
- टाप उपचार के बाद, 1x पंजाबियों (प्रत्येक ९६-well) के लिए २०० µ l से धो लें ।
नोट: रसायनों की एकाग्रता का पालन के रूप में है: AFB1:3 µ एम, Atrazine: १०० µ एम, BaP: 10 µ मीटर, BPA: १०० µ एम, β-एस्ट्रोजन, PCB126:10 µ एम, Nonylphenol, और bpa: १०० µ एम. - उपयोग N-एसिटाइल Cysteine (एनएसी) एक एंटीऑक्सीडेंट के रूप में ROS बुझाने के लिए । ३७ डिग्री सेल्सियस पर 12 घंटे के लिए ROS प्रेरित रासायनिक diluents और मशीन के लिए एनएसी के 5 मिमी जोड़ें ।
- ११२ x जी पर ९६ अच्छी तरह से थाली और फ्लोरोसेंट जांच के 5 µ एम समाधान के साथ मशीन (H2-DCFH-RPMI मीडिया में भंग डीए) ६० मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर ।
- पंजाब के साथ इलाज टाप कोशिकाओं 3 बार धो और ४८८ एनएम पर एक microplate रीडर के साथ प्रतिदीप्ति उपाय ।
नोट: कोशिकाओं में डीसीएफ के संचय ५३० एनएम पर प्रतिदीप्ति में वृद्धि से मापा जा सकता है जब नमूना ४८८ एनएम पर उत्साहित है । - अग्नाशय के टाप के शारीरिक समारोह पर xenobiotic प्रभाव को मापने के लिए ROS-उत्प्रेरण xenobiotic इलाज टाप और अनुपचारित टाप पर ग्लूकोज-उत्तेजित इंसुलिन स्राव (GSIS) परख9 प्रदर्शन करते हैं ।
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Representative Results
स्वस्थ पृथक टाप का एक micrograph चित्रा 2में दिखाया गया है, जिसमें टाप अपेक्षाकृत समान आकार के साथ गोल या अंडाकार आकार के होते हैं (हालांकि आकार एकरूपता तनाव से तनाव में भिन्न हो सकती है). हम अगले एक इन विट्रो में में अग्नाशय के टाप कार्यों की जांच परख अलग से टाप और संस्कृति के टाप में इंसुलिन स्राव उत्तेजक । चित्रा 3 C57BL से GSIS परख के हमारे ठेठ विश्लेषण/6 माउस से पता चलता है अलग टाप ३.३ mm और १६.७ mm ग्लूकोज9द्वारा प्रेरित ।
प्लेट प्रारूप स्क्रीन विधि का उपयोग करना, हम कई xenobiotics कि टाप कोशिकाओं (चित्रा 4) में ROS की महत्वपूर्ण प्रेरण के कारण की पहचान की है । हम 12 ज के लिए विभिंन रसायनों के साथ अलग अलग टाप का इलाज किया और पाया कि Atrazine, BPA, BaP, और पीसीबी१२६, और β-एस्ट्रोजन अलग टाप में ROS के महत्वपूर्ण प्रेरण कारण सकता10,11,12 , 13.
हालांकि ROS diabetogenic प्रेरण के बराबर नहीं है, वहां पर्याप्त अग्नाशय β कोशिकाओं के शारीरिक कार्यों को क्षति के कारण में ROS की महत्वपूर्ण भूमिका का संकेत सबूत है, जो8T2DM की ओर जाता है । इसलिए, काम का मूल्य प्रारंभिक स्क्रीन के रूप में इन ROS उत्प्रेरण रसायन की पहचान करने के लिए है । इसके अलावा, की पहचान की यौगिकों आगे की पांडुलिपि में वर्णित अलग अग्नाशय टाप सेल संस्कृति प्रणाली में इन विट्रो में विश्लेषण किया जा सकता है । हम ROS-उत्प्रेरण xenobiotics के प्रभाव से पता चला है ग्लूकोज उत्तेजक अलग टाप के इंसुलिन स्राव, जो संक्षेप में इन परीक्षण यौगिकों के लिए diabetogenic डेटा प्रदान करते हैं. अग्नाशय के टाप पूर्व PCB126 और BPA के साथ इलाज किया नियंत्रण समूह (चित्रा 5) से इंसुलिन स्राव में एक महत्वपूर्ण कमी दिखाई ।
चित्रा 1 : माउस अग्ंयाशय छिड़काव की प्रक्रिया । प्रक्रिया निम्न चरणों के होते हैं: (1) कलसा का पता लगाएं और कलसा को दबाना करने के लिए घुमावदार संदंश के दो जोड़े का उपयोग करें । (२) आम पित्त के माध्यम से सुई डालें. (3) धीरे 5 मिलीलीटर सिरिंज में collagenase समाधान स्टॉक के 3 मिलीलीटर इंजेक्षन । (4) ग्रहणी से शुरू कर अग्न्याशय इकट्ठा ।
चित्रा 2 : पृथक माउस टाप । पृथक माउस संस्कृति माध्यम में अग्नाशय के टाप दिखाए जाते हैं. ५०० µm की स्केल बार ।
चित्रा 3 : ग्लूकोज-अलग अग्नाशय के टाप के इंसुलिन स्राव उत्तेजित । खुराक-निर्भर ग्लूकोज-प्रेरित इंसुलिन स्राव (1, ३.३, और १६.७ मिमी, 15 मिनट के लिए इलाज) अलग टाप में मापा गया था (औसत 5 टाप प्रति अच्छी तरह से), एक माउस इंसुलिन एलिसा किट का उपयोग कर. त्रुटि पट्टियां मानक विचलन दिखाएं । *p < 0.05.
चित्र 4 : C57BL/6 चूहों से पृथक टाप में xenobiotics द्वारा ROS की प्रेरण । (क) पृथक टाप 12 ज और सना के लिए प्रतिदीप्ति डाई 2 ', 7 '-dichlorofluorescein (DCFH-DA) के साथ 1 ज के लिए इलाज किया गया । प्रतिदीप्ति एक प्रतिदीप्ति प्लेट रीडर द्वारा निर्धारित किया गया था । (ख) एनएसी (५ मि. ली.) द्वारा रासायनिक-प्रेरित ROS को बुझाया गया. (AFB1:3 µ एम, Atrazine: १०० µ एम, BaP: 10 µ एम, BPA: १०० µ एम, PCB126:10 µ एम, Nonylphenol, BPA: १०० µ एम, और एनएसी: 5 मिमी) । त्रुटि पट्टियां मानक विचलन दिखाएं । *p < 0.05. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 5 : पृथक टाप के ग्लूकोज-उत्तेजित इंसुलिन स्राव पर Xenobiotic प्रभाव. पृथक टाप PCB126, β-एस्ट्रोजन, और BPA (4 एच) के साथ पूर्व इलाज किया गया और 1 एच के लिए टाप संस्कृति माध्यम में रखा । supernatant के एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध माउस इंसुलिन एलिसा परख द्वारा इंसुलिन की माप के लिए एकत्र किया गया था । त्रुटि पट्टियां मानक विचलन दिखाएं । *p < 0.05.
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Discussion
सबूत जमा पता चलता है कि पर्यावरण रसायनों के लिए जोखिम T2DM के विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । Xenobiotics-प्रेरित ROS एक संभावित etiological T2DM के विकास में योगदान कारक के रूप में मांयता प्राप्त किया गया है । मानव xenobiotic रसायनों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए संपर्क कर रहे है और वहां उपंयास अनुसंधान तकनीक के लिए एक बड़ी जरूरत को प्रभावी ढंग से अग्नाशय विषालु की पहचान और विषाक्तता के तंत्र की जांच अग्नाशय कोशिकाओं के लिए विशिष्ट है ।
इस अध्ययन में, प्रकाशित प्रक्रियाओं के आधार पर14, हम अग्नाशय के टाप को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया है माउस और स्क्रीन अग्नाशय कोशिकाओं को ऑक्सीडेटिव तनाव प्रेरित क्षति के लिए xenobiotic रसायनों के साथ कोशिकाओं. हम भी अग्नाशय विशिष्ट विषाक्त xenobiotic यौगिकों द्वारा प्रेरित प्रतिक्रियाओं की जांच करने के लिए इस प्रक्रिया का उपयोग करें । माउस से अग्ंयाशय प्राप्त करने के लिए, हम अंय संज्ञाहरण पर avertin का उपयोग करें क्योंकि यह रक्त शर्करा के स्तर को बदल नहीं करता है और अग्ंयाशय15,16,17के vasculature को प्रभावित नहीं करता पसंद करते हैं । हमने पाया है कि घनत्व ढाल केंद्रापसारक कदम उच्च शुद्धता के साथ टाप के अलगाव के लिए महत्वपूर्ण है । देखभाल के लिए polysucrose/सोडियम और अलगाव बफर चरण के बीच अलग परत प्राप्त करने के लिए एक शुद्ध टाप नमूना प्राप्त करने के लिए लिया जाना चाहिए, मलबे से रहित और exocrine कोशिकाओं/ विधि के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है इन विट्रो में GSIS परख के रूप में अग्नाशय टाप फिजियोलॉजी, पर पर्यावरणीय रासायनिक प्रभाव के विश्लेषण (के रूप में चित्र 3में दिखाया गया है) । टाप अलग कोशिकाओं में दोहराया pipetting के साथ ध्यान से फैलाया जाना चाहिए ९६ सेल संस्कृति की थाली में वर्दीधारी सेल संख्या सुनिश्चित करने के लिए । विधि यहां बताया टाप के अलगाव और ROS पीढ़ी के लिए एक तेजी से परख संयुक्त और इसलिए, एक सरल और प्रभावी संभावित अग्ंयाशय के लिए प्रारंभिक स्क्रीन हानिकारक रसायन है ।
हम ग्लूकोज चुनौती के जवाब में इंसुलिन स्राव अलग अग्नाशय के टाप की पहचान की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया. प्रक्रिया पैरामीटर में परिवर्तन के विश्लेषण के लिए अत्यधिक अनुकूलनीय है, इंसुलिन स्राव सहित (चित्रा 3) और शिविर पीढ़ी, xenobiotic उपचार के जवाब में18.
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Disclosures
लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।
Acknowledgments
यह काम CREH केंद्र से एक पायलट परियोजना अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था NIEHS द्वारा प्रायोजित और राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन द्वारा चीन (No. ३१५७२६२६) ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10×Hank’s balanced salt solution | GIBCO | 14185-052 | |
| Collagenase Type 4 | Worthington Biochemical Corporation | CLS-4 | |
| polysucrose/sodium diatrizoate solution | Sigma | 10771 | |
| 2’,7’-dichlorofluorescein (DCFH-DA) | Sigma | D6883-50MG | |
| fluorescence microplate reader | Biotek | ||
| L-glutamine | Sigma | G8540-25G | |
| streptomycin | GIBCO | 15140148 | |
| FBS | GIBCO | 26140079 | |
| RPMI 1640 | GIBCO | 11875-085 | |
| avertin | Sigma | T48402-25G | |
| Rat/Mouse Insulin ELISA Kit | Millipore | EZRMI-13K | |
| Centrifuge | Sorval | Sorval RT7 | for 96-well plate centrifuge |
| Microplate reader | Biotek | Epoch 2 | for fluorescence reading |
References
- Maruthur, N. M. The growing prevalence of type 2 diabetes: increased incidence or improved survival? Current diabetes reports. 13 (6), 786-794 (2013).
- Houstis, N., Rosen, E. D., Lander, E. S. Reactive oxygen species have a causal role in multiple forms of insulin resistance. Nature. 440 (7086), 944-948 (2006).
- Ma, Z. A., Zhao, Z., Turk, J. Mitochondrial dysfunction and beta-cell failure in type 2 diabetes mellitus. Exp Diabetes Res. , 703538 (2012).
- Valavanidis, A., Vlahogianni, T., Dassenakis, M., Scoullos, M. Molecular biomarkers of oxidative stress in aquatic organisms in relation to toxic environmental pollutants. Ecotoxicology and environmental safety. 64 (2), 178-189 (2006).
- Robertson, R. P., Harmon, J., Tran, P. O., Tanaka, Y., Takahashi, H. Glucose toxicity in β-cells: type 2 diabetes, good radicals gone bad, and the glutathione connection. Diabetes. 52 (3), 581-587 (2003).
- Kaneto, H., et al. Oxidative stress induces p21 expression in pancreatic islet cells: possible implication in beta-cell dysfunction. Diabetologia. 42 (9), 1093-1097 (1999).
- Maechler, P., Jornot, L., Wollheim, C. B. Hydrogen peroxide alters mitochondrial activation and insulin secretion in pancreatic beta cells. Journal of Biological Chemistry. 274 (39), 27905-27913 (1999).
- Gao, D., et al. The effects of palmitate on hepatic insulin resistance are mediated by NADPH Oxidase 3-derived reactive oxygen species through JNK and p38MAPK pathways. Journal of Biological Chemistry. 285 (39), 29965-29973 (2010).
- Efendić, S., et al. Pancreastatin and islet hormone release. Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (20), 7257-7260 (1987).
- Tian, Y., Ke, S., Denison, M. S., Rabson, A. B., Gallo, M. A. Ah receptor and NF-κB interactions, a potential mechanism for dioxin toxicity. Journal of Biological Chemistry. 274 (1), 510-515 (1999).
- Cui, H., et al. Pregnane X receptor regulates the AhR/Cyp1A1 pathway and protects liver cells from benzo-[α]-pyrene-induced DNA damage. Toxicology Letters. 275, 67-76 (2017).
- Li, L. A., Wang, P. W. PCB126 induces differential changes in androgen, cortisol, and aldosterone biosynthesis in human adrenocortical H295R cells. Toxicological Sciences. 85 (1), 530-540 (2005).
- Asahi, J., et al. Bisphenol A induces endoplasmic reticulum stress-associated apoptosis in mouse non-parenchymal hepatocytes. Life sciences. 87 (13), 431-438 (2010).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Murine pancreatic islet isolation. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (7), e255 (2007).
- Kirstetter, P., Lagneau, F., Lucas, O., Krupa, Y., Marty, J. Role of endothelium in the modulation of isoflurane-induced vasodilatation in rat thoracic aorta. British journal of anaesthesia. 79 (1), 84-87 (1997).
- Brown, E., Umino, Y., Loi, T., Solessio, E., Barlow, R. Anesthesia can cause sustained hyperglycemia in C57/BL6J mice. Visual neuroscience. 22 (5), 615-618 (2005).
- Vaupel, D., McCoun, D., Cone, E. J. Phencyclidine analogs and precursors: rotarod and lethal dose studies in the mouse. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 230 (1), 20-27 (1984).
- Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination. Journal of visualized experiments: JoVE. (88), (2014).
