Summary
Burada potansiyel diyabetojenik xenobiotic kimyasallar tanımlamak için xenobiotics tarafından ROS indüksiyon süzmek için fare pankreas adacık hücreleri izole etmek için bir iletişim kuralı mevcut.
Abstract
Bazı çevresel kimyasallar insan ve hayvanlarda maruz hangi-ecek götürmek tip 2 diabetes mellitus (T2DM) gelişimi için pankreas β hücrelerinin hücre hasarına neden tespit edilmiştir. Kimyasal kaynaklı β hücre hasarı için mekanizmalar belirsiz ve karmaşık olması olasılığı olmasına rağmen bir yinelenen bu kimyasalların oksidatif stres zarar neden aşırı reaktif oksijen türleri (ROS) üretimi için önde gelen neden bulgudur β hücre. Potansiyel diyabetojenik çevresel kimyasallar tanımlamak için C57BL/6 fareler pankreas adacık hücreleri ve kültürlü adacık hücreleri 96-şey hücre kültür tabak içinde izole; daha sonra adacık hücreleri kimyasallar ile ilaç ve ROS üretimi 2' tarafından 7'-dichlorofluorescein (DCFH-DA) floresan boya tespit edildi. Bu yöntemi kullanarak, biz o Bisfenol A (BPA), Benzo [a] dumanında (BaP), Poliklorlu bifeniller (PCB) bulup, potansiyel olarak adacık hücreleri hasara neden olabilir düşündüren ROS, yüksek düzeyde neden. Bu yöntem diyabetojenik xenobiotics eleme için yararlı olmalıdır. Buna ek olarak, kültürlü adacık hücreleri de kimyasal kaynaklı toksisite pankreas hücreleri vitro analiz için adapte olabilir.
Introduction
T2DM yaygınlığı artışlar küresel sağlık krizi son yıllarda poz halk sağlığı1için ciddi bir tehdit haline gelmiştir. Pek çok faktör bulunmuştur nedensel T2DM, geliştirme arasında hangi, bağlanacak şekilde yinelenen bulgular bu faktörler için bir ortak yakınsak noktası aşırı ROS2 nesil uzaklaşan oksidatif stres indüksiyon olduğunu göstermektedir , 3.
Çevresel kimyasallar PCB, dioksin ve BaP gibi geniş bir yelpazede pankreas β hücrelerinin işlevini bozabilir ve insülin direnci ve T2DM4yol oksidatif stres, neden tespit edilmiştir. Her ne kadar ROS fizyolojik düzeyi hücresel işlevlerinde önemli bir rol oynar, antioksidan sistem kapasitesini aşıyor ROS maruz hücreler/dokulara zarar sonuçları ve hastalıklar5' e götürür. Pankreas Beta hücreleri antioksidan enzim düşük düzeyde hızlı ve dolayısıyla oksidatif stres-aracılı hasar6,7için önemli bir hedef. Kronik ROS yüksek düzeyde maruz stres kaynaklı pankreas hücresi disfonksiyon5 neden için gösterilen yanı sıra karaciğer ve yağ dokusu8insülin direnci.
Bu projenin genel amacı bir hücre tabanlı tahlil ekran kimyasallara ROS pankreas hücreleri içinde onların indüksiyon dayalı onların diyabetojenik potansiyeller için geliştirmektir. Pankreas ve metabolik detoksifikasyon yoksun xenobiotic indüklenen zarar6,7için önemli bir hedeftir. Bu nedenle, doğrudan pankreas hücrelerinde üretilen ROS ölçerek, bu tahlil pankreas kimyasal kaynaklı yaralanma doğrudan bir yaklaşım sağlamalıdır. Bu yöntem geliştirmek için biz fare pankreas adacıkları izole, izole adacık hücre kültür koşul kimyasallar ile altında kültürlü ve kimyasal kaynaklı ROS üretimi okuma olarak kullanılmaktadır. Bu basit ve izole adacık kimyasal maddeler ROS-inducing belirlenmesinde etkili işlemdir; soruşturma için pankreas içinde vitroözgü mekanizmaları toksisite için daha fazla geliştirilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan deneyleri tüm ilgili kurallar, düzenlemeler ve düzenleyici kurumlar uygun olarak idam edildi. Gösterilen iletişim kuralı rehberlik ve kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Texas A & M Enstitüsü onaylanması için genomik Tıp altında gerçekleştirildi.
1. çözüm hazırlık
- Çift Kişilik distile H2O ile 1 x 10 x Hank'in dengeli tuz solüsyonu sulandırmak ve 4 ° C'de depolayın
- Yalıtım çözüm HEPES (10 mM), MgCl2 (1 mM) ve glikoz (5 mM) ekleyerek hazırlayın. PH 7.4 için ayarlamak ve buz üzerinde tutun.
- Collagenase tip 4 collagenase çözümden hazırlayın.
Not: Özellikle, collagenase tip 4 160 mg kuru ağırlığının U içerir. collagenase tip 4 1 g 5 mL Çift Kişilik distile H2O 200 mg/mL bir konsantrasyon ile seyreltilmiş. seyreltilmiş Collagenase 2 mL 30 mL buz soğuk izolasyon çözüme eklenir ve 6 mL collagenase çözeltisi 50 mL tüp her fare için transfer edilir. - Yıkama çözüm yalıtım çözüm 1 mM CaCl2 ekleyerek hazırlayın.
- Soğuk polysucrose/sodyum diatrizoate çözüm (1.1119 g/mL, 5 mL) ile arıtma çözüm hazırlamak.
- Adacık kültür ortamının 500 mL L-glutamin (20 mM), penisilin (100 U/mL), streptomisin (100 µg/mL) ve fetal Sığır serum (FBS) (% 10) RPMI orta ekleyerek hazırlayın.
- DCFH-DA hisse senedi çözüm toz 200 µM, distile su ve store-20 ° C'de çözülerek hazırlamak
Not: Çözüm boyama ROS taze DCFH-DA hisse senedi eriyik-e doğru RPMI içinde 5 mikron son konsantrasyonu sulandrarak yapılır. Bu reaktif ışıktan korunmalıdır.
2. cerrahi hazırlık
- İntraperitoneally (IP) bir fare ile avertin (%2.5 avertin, 0.4 mL/20 g) enjekte et. Sonra fare tamamen anestezi ve artık yanıt hind için pinch ayak, fare ötenazi ve biyolojik hood taşır.
- Karın yüzü yukarı bakacak şekilde euthanized fareyi getirin ve sterilizasyon için % 70 etanol ile cilt sprey.
- Karın üst karın üzerine 1 cm U-kesi ile açın ve karın boşluğu ortaya çıkarmak için göğüs üzerinde cilt rostral yönde geri çek.
3. pankreas perfüzyon ve kaldırma
- Şekil 1' de gösterildiği gibi ampulla konumunu bulmak. Duodenum Oddi Sfinkter konumunu yakın kelepçe için Kıvrımlı pensler bir çift kullanın. Bir çift daha Kıvrımlı pensler duodenum safra yolu engellemek için oniki parmak bağırsağı duvar kelepçe için kullanın.
Not: Ampulla Bu adımda eklenen değil. Bu adımı duodenum safra yolu engellemek içindir. - Fareyi başından proksimal ve distal açısından araştırmacı ayak yeniden konumlandırın.
- Ortak safra kanalını bulmak ve yavaş yavaş 30 G iğne ve 5 mL şırınga ile 3 mL collagenase çözeltisi enjekte. Ortak safra kanalını ve pankreas enjeksiyon sonra şişirilir emin olun.
- Şişmiş pankreas inen kolon, bağırsak, mide ve dalak ayırmak için Kıvrımlı pensler ve iyi makas kullanarak kaldırın. Pankreas 3 mL collagenase çözeltisi içeren bir 50 mL tüp içinde yerleştirin ve buz üzerinde tutun.
4. pankreas sindirim
- Her 50 mL tüp 37 ° C su banyosu yerleştirin. 15-20 dk için kuluçkaya (süre değişir zorlanma ve fareler yaş ile).
- Bir girdap kullanarak boru titremek.
- 4-5 büyük steril lavabo süzgeç sindirilir pankreasta havuz ve iyice darmadağın pankreas yapmak için bir kaşık kullanabilirsiniz. Zorla ekrandan sindirilir hücreleri pipette için yıkama solüsyon içeren 23 G iğne ve 10 mL şırınga kullanın. 50 mL tüp yıkama çözümde toplamak.
- Tüpler, 97 x g 4 ° c için 1 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant dikkatle boşaltmak.
- Tüpler için 25 mL yıkama çözeltisi ekleyin ve doku nazik vortexing tarafından yeniden askıya alma. Spin aşağı doku, 97 x g 1 dk. için 4 ° C'de ve süpernatant dikkatle boşaltmak. İçin 3 kez tekrarlayın. Pelleted doku çıkarmak değil dikkatli olun.
5. arıtma adacıkları
- Arıtma Çözüm 10 mL yıkanmış doku Pelet ekleyin ve hafifçe içeriği resuspend.
- Yavaşça 5 mL yalıtım çözeltisi arıtma çözüm üzerinde yerleşimi. İki çözüm arasında keskin bir sıvı arayüzü tutmak için dikkatli olun.
- Tüp 4 ° C'de 15 dakika yavaş ivme ile de g x 560 ve fren yok santrifüj kapasitesi. Pipet arayüzü içine yerleştirin ve adacıkları katman yeni 50 mL tüpler içine toplamak.
- Adacıkları 3.5 adımda anlatıldığı gibi yıkayın.
6. kaplama ve adacık hücreleri tedavi
- Adacıkları adacıkları kültür çözüm 10 mL resuspend, yavaşça karıştırın ve 100 µL/iyi bir 96-şey plaka için çok kanallı pipet ile yerleştirin. 96 başına yaklaşık 5 adacıktan de yerleştirin.
- 12 h için doku kültürü kuluçka plaka yerleştirin.
- 96-şey plaka (112 x g) santrifüj kapasitesi ve kültür orta kaldırın.
- Çevresel kimyasallar adacıkları kültür orta sulandırmak. Her birinin kimyasal seyrelticiler 100 µL plaka ayrı kuyu ekleyin. Her iyi adacıkları resuspend ve 12 h (konsantrasyonu farklı çevresel kimyasallar için değişir) 37 ° C'de için kuluçkaya.
7. ROS boyama ve ölçüm
- 1 x PBS ile adacıkları tedaviden sonra yıkayın (her 96-kuyu 200 µL).
Not: Kimyasal konsantrasyonu olarak takip olduğunu: AFB1: 3 µM, Atrazine: 100 µM, BaP: 10 µM, BPA: 100 µM, β-östrojen, PCB126: 10 µM, Nonylphenol ve BPA: 100 µM. - N-asetil sistein (NAC) bir antioksidan ROS gidermek için kullanın. NAC 5 mM ROS kaynaklı kimyasal seyrelticiler ekleyin ve 37 ° C'de 12 h için kuluçkaya
- 96-şey plaka 112 x g, santrifüj kapasitesi ve 60 dk 37 ° C'de 5 µM çözüm floresan inceleyebilirsek (H2-DCFH-DA RPMI ortamda çözünmüş) ile kuluçkaya.
- 3 kez PBS ile tedavi adacık hücreleri yıkama ve floresan 488 bir Mikroplaka Okuyucu ile ölçmek nm.
Not: DCF hücrelerdeki birikimi artış tarafından 530, floresans içinde ölçülen örnek 488 heyecanlı zaman nm nm. - Glikoz uyarılmış insülin salgılanması (GSIS) tahlil9 xenobiotic ROS-inducing gerçekleştirmek tedavi adacıkları ve tedavi edilmezse adacıkları pankreas adacıkları fizyolojik fonksiyonu xenobiotic etkisini ölçmek için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sağlıklı izole adacık test adacıkları olan bir yuvarlak veya oval şekil (boyutu tekdüzelik zorlanma zorlanma değişebilir rağmen) nispeten boyutu üniforma olduğu Şekil 2' de gösterilmiştir. Biz sonraki adacık yalıtma ve kültür adacıkları insülin salgılanmasını uyarıcı bir vitro tahlil pankreas adacık işlevlerinde araştırdık. Şekil 3 C57BL/6 izole fare adacıkları 3,3 mM ve 16,7 mM glikoz9tarafından indüklenen GSIS tahlil tipik bizim analizini gösterir.
Plaka format ekran yöntemi kullanarak, biz ROS önemli indüksiyon adacık hücreleri (Şekil 4) neden birkaç xenobiotics belirledik. Biz izole adacıkları 12 h için farklı kimyasallar ile tedavi ve o Atrazine, BPA, BaP ve PCB126bulunur ve β-östrojen ROS önemli indüksiyon izole adacıkları10,11,12 ' neden olabilir , 13.
ROS diyabetojenik indüksiyon eşit olmasa da, ROS önemli rol T2DM8' e açan fizyolojik fonksiyonları pankreas β hücrelerinin zarar olarak gösteren yeterli delil var. Bu nedenle, çalışma değeri başlangıç ekranı olarak kimyasal inducing bu ROS belirlemektir. Ayrıca, tanımlanan bileşikler ayrıca el yazması açıklanan izole pankreas adacık hücre kültür sistemi içinde analiz vitro olabilir. İnsülin salgılanmasını glikoz uyarıcı kısaca diyabetojenik veri sağlamak için test edilmiş bu bileşiklerin izole adacıkları üzerinde ROS-inducing xenobiotics etkilerini göstermiştir. Pankreas adacıkları PCB126 ve BPA ile önceden tedavi insülin salgısını kontrol grubu (Şekil 5) daha önemli bir azalma gösterdi.
Resim 1 : Fare pankreas perfüzyon prosedürü. Yordamı aşağıdaki adımlardan oluşur: (1) ampulla bulmak ve ampulla kelepçe için iki çift eğri forseps kullanın. (2) ortak safra aracılığıyla iğne yerleştirin. (3) yavaş yavaş 3 mL 5 mL şırınga collagenase çözüm stokta enjekte et. (4) oniki parmak bağırsağı--dan başlayan şişmiş pankreas toplamak.
Resim 2 : İzole fare adacıkları. Kültür ortamında izole fare pankreas adacıkları gösterilir. 500 µm ölçek çubuğu.
Şekil 3 : Glikoz uyarılmış insülin salgılanması izole pankreas adacıkları. Doz bağımlı glikoz uyarılmış insülin salgılanması (1, 3.3 ve 16,7 mM, tedavi için 15 dk) bir fare insülin ELISA kullanarak (ortalama 5 adacıktan iyi başına) izole adacıklar içinde ölçüldü kiti. Hata çubukları standart sapmalar gösterir. p < 0,05.
Şekil 4 : ROS xenobiotics C57BL/6 fareler gelen izole adacıklar içinde tarafından indüksiyon. (A)izole adacıkları 12 h için tedavi ve floresan boya 2', 7'-dichlorofluorescein (DCFH-DA) 1 h için lekeli. Floresan bir floresan plaka okuyucu tarafından tespit edilmiştir. (B) kimyasal kaynaklı ROS NAC (5 mM) tarafından su. (AFB1: 3 µM, Atrazine: 100 µM, BaP: 10 µM, BPA: 100 µM, PCB126: 10 µM, Nonylphenol, BPA: 100 µM ve NAC: 5 mM). Hata çubukları standart sapmalar gösterir. p < 0,05. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 : Xenobiotic glikoz uyarılmış insülin salgılanması izole adacıklar etkisi. İzole adacıkları PCB126, β-östrojen ve BPA (4 h) ile önceden tedavi ve adacık kültür orta 1 h için tuttu. Süpernatant adacıklar insülin bir ticari olarak mevcut fare insülin ELISA tarafından ölçüm için toplanan tahlil. Hata çubukları standart sapmalar gösterir. p < 0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kanıt biriken öneriyor çevresel kimyasallar o maruz T2DM gelişiminde önemli bir rol oynar. Xenobiotics kaynaklı ROS T2DM gelişmesine katkıda bulunan bir potansiyel etyolojik faktör olarak kabul edilmiştir. İnsanlar xenobiotic kimyasalların geniş bir dizi sunulur ve bir büyük gerek roman araştırma teknikleri etkili pankreas toxicants tanımlamak ve toksisite pankreas hücreleri belirli mekanizmasının araştırmak için.
Bu çalışmada, yayımlanmış yordamlar14, dayalı geliştirdiğimiz fare ve ekran pankreas adacıkları yalıtmak için bir protokol oksidatif stres kaynaklı zarar pankreas hücreleri için xenobiotic kimyasallar içeren hücreleri. Ayrıca xenobiotic bileşikler tarafından indüklenen pankreas belirli toksik yanıtlar araştırmak için bu yordamı kullanın. Pankreas fareden elde etmek için kan şekeri düzeylerini değiştirmez ve pankreas15,16,17damarlara etkilemez çünkü diğer anestezi üzerinde avertin kullanmayı tercih. Bulduk yoğunluk gradient Santrifüjü adım adacık yüksek saflıkta ile yalıtım için önemlidir. Enkaz ve ekzokrin hücreler/doku yoksun bir saf adacıkları örnek almak için polysucrose/sodyum ve yalıtım arabellek faz arasında farklı katman elde etmek için özen gösterilmelidir. Yöntem pankreas adacık fizyolojisi, GSIS tahlil gibi çevresel kimyasal etkileri vitro analiz için ( Şekil 3' te gösterildiği gibi) kullanılabilir. Adacıkları dikkatli 96-hücre kültürü plaka üniformalı cep numarası sağlamak için ayrı hücrelere tekrarlanan pipetting ile dağınık. Yöntem tanımlamak burada yalıtım adacık ve hızlı bir tahlil ROS üretimi için kombine ve bu nedenle, potansiyel pankreas zarar veren kimyasallar için basit ve etkili başlangıç ekranı.
Biz insülin salgılanması yanıt glikoz meydan okuma olarak izole pankreas adacıkları kimliğini onaylamak için kullanılır. Yüksek insülin salgılanması (Şekil 3) ve kamp üretimi, xenobiotic tedaviler18yanıt dahil olmak üzere Parametrelerindeki değişiklikler çözümlenmesi için uyarlanabilir bir yöntemdir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.
Acknowledgments
Bu eser CREH merkezi NIEHS tarafından ve Ulusal Doğa Bilimleri Foundation of China (No. 31572626) tarafından desteklenen bir pilot proje hibe tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10×Hank’s balanced salt solution | GIBCO | 14185-052 | |
| Collagenase Type 4 | Worthington Biochemical Corporation | CLS-4 | |
| polysucrose/sodium diatrizoate solution | Sigma | 10771 | |
| 2’,7’-dichlorofluorescein (DCFH-DA) | Sigma | D6883-50MG | |
| fluorescence microplate reader | Biotek | ||
| L-glutamine | Sigma | G8540-25G | |
| streptomycin | GIBCO | 15140148 | |
| FBS | GIBCO | 26140079 | |
| RPMI 1640 | GIBCO | 11875-085 | |
| avertin | Sigma | T48402-25G | |
| Rat/Mouse Insulin ELISA Kit | Millipore | EZRMI-13K | |
| Centrifuge | Sorval | Sorval RT7 | for 96-well plate centrifuge |
| Microplate reader | Biotek | Epoch 2 | for fluorescence reading |
References
- Maruthur, N. M. The growing prevalence of type 2 diabetes: increased incidence or improved survival? Current diabetes reports. 13 (6), 786-794 (2013).
- Houstis, N., Rosen, E. D., Lander, E. S. Reactive oxygen species have a causal role in multiple forms of insulin resistance. Nature. 440 (7086), 944-948 (2006).
- Ma, Z. A., Zhao, Z., Turk, J. Mitochondrial dysfunction and beta-cell failure in type 2 diabetes mellitus. Exp Diabetes Res. , 703538 (2012).
- Valavanidis, A., Vlahogianni, T., Dassenakis, M., Scoullos, M. Molecular biomarkers of oxidative stress in aquatic organisms in relation to toxic environmental pollutants. Ecotoxicology and environmental safety. 64 (2), 178-189 (2006).
- Robertson, R. P., Harmon, J., Tran, P. O., Tanaka, Y., Takahashi, H. Glucose toxicity in β-cells: type 2 diabetes, good radicals gone bad, and the glutathione connection. Diabetes. 52 (3), 581-587 (2003).
- Kaneto, H., et al. Oxidative stress induces p21 expression in pancreatic islet cells: possible implication in beta-cell dysfunction. Diabetologia. 42 (9), 1093-1097 (1999).
- Maechler, P., Jornot, L., Wollheim, C. B. Hydrogen peroxide alters mitochondrial activation and insulin secretion in pancreatic beta cells. Journal of Biological Chemistry. 274 (39), 27905-27913 (1999).
- Gao, D., et al. The effects of palmitate on hepatic insulin resistance are mediated by NADPH Oxidase 3-derived reactive oxygen species through JNK and p38MAPK pathways. Journal of Biological Chemistry. 285 (39), 29965-29973 (2010).
- Efendić, S., et al. Pancreastatin and islet hormone release. Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (20), 7257-7260 (1987).
- Tian, Y., Ke, S., Denison, M. S., Rabson, A. B., Gallo, M. A. Ah receptor and NF-κB interactions, a potential mechanism for dioxin toxicity. Journal of Biological Chemistry. 274 (1), 510-515 (1999).
- Cui, H., et al. Pregnane X receptor regulates the AhR/Cyp1A1 pathway and protects liver cells from benzo-[α]-pyrene-induced DNA damage. Toxicology Letters. 275, 67-76 (2017).
- Li, L. A., Wang, P. W. PCB126 induces differential changes in androgen, cortisol, and aldosterone biosynthesis in human adrenocortical H295R cells. Toxicological Sciences. 85 (1), 530-540 (2005).
- Asahi, J., et al. Bisphenol A induces endoplasmic reticulum stress-associated apoptosis in mouse non-parenchymal hepatocytes. Life sciences. 87 (13), 431-438 (2010).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Murine pancreatic islet isolation. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (7), e255 (2007).
- Kirstetter, P., Lagneau, F., Lucas, O., Krupa, Y., Marty, J. Role of endothelium in the modulation of isoflurane-induced vasodilatation in rat thoracic aorta. British journal of anaesthesia. 79 (1), 84-87 (1997).
- Brown, E., Umino, Y., Loi, T., Solessio, E., Barlow, R. Anesthesia can cause sustained hyperglycemia in C57/BL6J mice. Visual neuroscience. 22 (5), 615-618 (2005).
- Vaupel, D., McCoun, D., Cone, E. J. Phencyclidine analogs and precursors: rotarod and lethal dose studies in the mouse. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 230 (1), 20-27 (1984).
- Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination. Journal of visualized experiments: JoVE. (88), (2014).
