Summary
Her presenterer vi en protokoll for å isolere musen bukspyttkjertelen Holme celler for screening på inductions ROS av xenobiotics for å identifisere potensielle diabetogenic xenobiotic oval kjemikalier.
Abstract
Eksponering for visse miljømessige kjemikalier i menneske og dyr har funnet cellular skade bukspyttkjertelen β cellene som vil føre til utvikling av type 2 diabetes mellitus (T2DM). Selv om mekanismene for kjemisk-indusert β celleskader var uklart og sannsynlig å bli komplekse, er en regelmessig finne at disse kjemikaliene induserer oksidativt stress fører til generering av overdreven reaktive oksygen arter (ROS) som induserer skade β cellen. For å identifisere potensielle diabetogenic miljømessige kjemikalier, isolerte vi bukspyttkjertelen Holme cellene fra C57BL/6 mus og kultivert Holme i 96-brønnen celle kultur platene. deretter Holme cellene var dosert med kjemikalier og ROS generasjon ble oppdaget av 2', 7'-dichlorofluorescein (DCFH-DA) fluorescerende fargestoff. Bruker denne metoden, vi fant at bisphenol A (BPA), Benzo [a] pyrene (BaP) og polyklorerte bifenyler (PCB), kan føre til høye nivåer av ROS, tyder på at de kan potensielt forårsake skade i Holme celler. Denne metoden bør være nyttig for screening diabetogenic xenobiotics. I tillegg kan kulturperler Holme cellene også være tilpasset i vitro analyse av kjemiske-indusert toksisitet i bukspyttkjertelen celler.
Introduction
Økning i utbredelsen av T2DM har blitt en global helse-krise i årene utgjør en alvorlig trussel mot folkehelsen1. Mange faktorer er funnet å være causally knyttet til utviklingen av T2DM, blant annet, regelmessige funn tyder på at en vanlig konvergent punkt for disse faktorene er induksjon av oksidativt stress som fører til generasjon av overdreven ROS2 , 3.
Et bredt spekter av miljømessige kjemikaliene som PCB, dioksiner og BaP har blitt funnet for å indusere oksidativt stress, som kan forringe funksjonen i bukspyttkjertelen β celler og føre til insulinresistens og T2DM4. Selv om hvilket fysiologiske ROS spiller en viktig rolle i cellulære funksjoner, eksponering for ROS som overstiger kapasiteten av antioksidant resulterer i skade celler/vev og fører til sykdommer5. Bukspyttkjertelen β celler uttrykke lave antioksidant enzymet, og dermed er en følsom mål for oksidativt stress-mediert skade6,7. Kronisk eksponering for høye nivåer av ROS har vist seg å forårsake stress-indusert bukspyttkjertelen celle dysfunksjon5 og insulinresistens i lever og fettvev8.
Det overordnede målet med dette prosjektet er å utvikle et cellebasert analysen skjermen kjemikalier for deres diabetogenic potensialer basert på deres induksjon av ROS i bukspyttkjertelen celler. Bukspyttkjertelen mangler metabolske avgiftning og er en følsom mål for xenobiotic oval-indusert skade6,7. Derfor ved å måle direkte ROS generert i bukspyttkjertelen celler, bør denne analysen gi en direkte tilnærming til kjemisk-indusert skaden i bukspyttkjertelen. For å utvikle denne metoden, vi isolert musen bukspyttkjertelen holmer, kultivert isolert Holmen under celle kultur tilstand med kjemikalier og anvende den kjemiske-indusert ROS generasjonen som er avlesning. Denne prosedyren er enkel og effektiv identifisering ROS-inducing kjemikalier i isolerte Holmen; Det kan utvikles for undersøkelse av mekanismer toksisitet som gjelder for bukspyttkjertelen i vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med alle relevante retningslinjer, regler og regulerende instanser. Protokollen blir demonstrert ble utført under veiledning og godkjenning av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) av Texas A & M Institute for genomisk medisin.
1. løsning forberedelse
- Fortynne 10 x Hanks balansert salt løsning til 1 x med dobbel destillert H2O, og lagre på 4 ° C.
- Forberede isolasjon løsningen ved å legge HEPES (10 mM), MgCl2 (1 mM) og glukose (5 mM). Justere pH 7,4 og holde på isen.
- Forberede collagenase løsningen fra collagenase Type 4.
Merk: Spesielt inneholder collagenase Type 4 160 U per mg av tørrvekten. 1 g collagenase Type 4 er utvannet i 5 mL double destillert H2O med en konsentrasjon av 200 mg/mL. 2 mL utvannet Collagenase lagt til 30 mL isen kalde isolasjon løsning, og 6 mL av collagenase løsning er overført til en 50 mL tube for hver musen. - Forbered vaskeløsning ved å legge til 1 mM CaCl2 isolasjon løsningen.
- Forberede den rensing løsningen med kaldt polysucrose/natrium diatrizoate løsning (1.1119 g/mL, 5 mL).
- Forberede 500 mL Holme kultur medium ved å legge til L-glutamin (20 mM), penicillin (100 U/mL), streptomycin (100 µg/mL) og fosterets bovin serum (FBS) (10%) i RPMI medium.
- Klargjør DCFH-DA lager løsningen ved å oppløse pulveret i destillert vann på 200 µM og butikk på 20 ° C.
Merk: ROS flekker løsning er nystekte fortynne DCFH-DA lager løsning på den endelige konsentrasjonen av 5 µM i RPMI. Denne reagensen skal beskyttes fra lys.
2. kirurgisk forberedelse
- Intraperitoneally injisere (IP) en mus med avertin (2,5% avertin, 0.4 mL/20 g). Når musen er helt anesthetized og ikke lenger reagerer å bakben fot pinches, euthanize musen og flytte til biologiske panseret.
- Plasser euthanized musen med den mage siden vendt opp og spray huden med 70% etanol for sterilisering.
- Åpne bukhulen med en 1 cm U-snitt på øvre magen og trekke huden i rostral retning over brystet å avsløre bukhulen.
3. bukspyttkjertelen perfusjon og fjerning
- Som illustrert i figur 1, finne plasseringen av ampulla. Bruk et par buede tang for å klemme tolvfingertarmen nærheten sphincter av Oddi. Bruk et par buede tang for å klemme tolvfingertarmen veggen for å blokkere galle veien i tolvfingertarmen.
Merk: Ampulla er ikke satt inn i dette trinnet. Dette trinnet er ment å blokkere galle veien i tolvfingertarmen. - Flytte musen med hodet proksimale og føtter distale med hensyn til forskeren.
- Finne felles galle duct og sakte injisere 3 mL collagenase løsning med 30 G nål og 5 mL sprøyte. Kontroller at felles galle duct og bukspyttkjertelen oppblåst etter injeksjon.
- Fjerne distended bukspyttkjertelen med buet tang og fine saks til å skille den fra synkende tykktarmen, tarmen, mage og milt. Plasser bukspyttkjertelen i en 50-mL tube med 3 mL collagenase løsning og holde det på is.
4. bukspyttkjertelen fordøyelse
- Plass hver 50 mL tube i et 37 ° C-vannbad. Inkuber i 15-20 minutter (tiden varierer med belastning og alder av mus).
- Vibrere røret med en vortex.
- Basseng 4-5 fordøyd bukspyttkjertelen i en stor sterilt vask sil og bruke en scoop å bukspyttkjertelen oppløses grundig. Bruk en 23 G nål og 10 mL sprøyte som inneholder vaskeløsning å kraftig Pipetter fordøyd cellene av skjermen. Samle vaskeløsning i en 50-mL tube.
- Sentrifuge rør 97 x g ved 4 ° C i 1 min og Dekanter nedbryting.
- Legge til 25 mL vaskeløsning rør og re suspendere vev av mild vortexing. Nedspinning vev 97 x g ved 4 ° C i 1 min og Dekanter nedbryting. Gjenta for 3 timene. Vær forsiktig med å dislodge pelleted vevet.
5. rensing av holmer
- Legge til 10 mL av rensing løsningen vasket vev pellets og forsiktig resuspend innholdet.
- Forsiktig overlegg 5 mL av isolasjon løsning på rensing løsningen. Pass på å holde et skarpt flytende grensesnitt mellom de to løsningene.
- Sentrifuge røret på 560 x g ved 4 ° C i 15 min med langsom akselerasjon og ikke brems. Pipette inn grensesnittet og samle holmer laget i nye 50 mL rør.
- Vask øyene som beskrevet i trinn 3.5.
6. plating og behandling av Holme celler
- Resuspend øyene i 10 mL av holmer kultur løsning, forsiktig bland godt og plassere 100 µL/godt med en flerkanals pipette til en 96-brønns plate. Plass ca 5 holmer per 96 godt.
- Plass platen i vev kultur inkubator 12 h.
- Sentrifuge (112 x g) 96-brønns platen og fjerne kultur medium.
- Fortynne de miljømessige kjemikaliene i holmer kultur medium. Legg 100 µL av de kjemiske løsningsmidler i separate brønner av platen. Resuspend øyene hver brønn og ruge 12 h på 37 ° C (konsentrasjon varierer for ulike miljømessige kjemikalier).
7. ROS flekker og måling
- Holmer behandling, vaskes med 1 x PBS (200 µL for hver 96-brønnen).
Merk: Konsentrasjonen av kjemikaliene er som følger: AFB1: 3 µM, Atrazine: 100 µM, BaP: 10 µM, BPA: 100 µM, β-estrogen, PCB126: 10 µM, Nonylphenol og BPA: 100 µM. - Bruke N-Acetyl-cystein (NAC) som en antioksidant for å slukke ROS. Legg til 5 mM av NAC ROS-indusert kjemiske løsningsmidler og ruge 12 h på 37 ° C.
- Sentrifuge 96-brønns platen 112 x g og ruge med 5 µM løsning av fluorescerende probe (H2-DCFH-DA oppløst i RPMI media) på 37 ° C for 60 min.
- Vask behandlet Holme cellene 3 ganger med PBS og måle fluorescens med en microplate leser på 488 nm.
Merk: Akkumulering av DCF i celler kan måles av en økning i fluorescens på 530 nm når prøven er spent på 488 nm. - Utføre glukose-stimulert insulin sekresjon (GSIS) analysen9 på ROS-inducing xenobiotic oval holmer og Ubehandlet Holmer måle xenobiotic oval effektene på fysiologiske funksjon av bukspyttkjertelen øyene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et mikroskop-bilde av sunn isolert øyen er vist i figur 2, der holmer har en rund eller oval form med relativt jevnt størrelse (selv om størrelse ensartethet kan variere fra stamme til stamme). Vi undersøkt neste funksjonene bukspyttkjertelen Holme i i vitro analysen av aisolering Holmen og stimulere insulinsekresjon i kultur holmer. Figur 3 viser vår typisk analyse av GSIS analysen fra C57BL/6 musen isolerte småøyer av 3.3 mM og 16,7 mM glukose9.
Med metoden plate format skjermen har vi identifisert flere xenobiotics som forårsaket betydelig induksjon av ROS i Holme celler (Figur 4). Vi behandlet de isolerte småøyer med ulike kjemikalier til 12 h og fant at Atrazine, BPA, BaP og PCB126og β-østrogen kan forårsake betydelig induksjon av ROS de isolerte småøyer10,11,12 , 13.
Selv om ROS ikke lik diabetogenic induksjon, er det rikelig bevis angir den viktige rollen ROS forårsaker skade til fysiologiske funksjoner av bukspyttkjertelen β celler, noe som fører til T2DM8. Derfor er verdien av arbeidet å identifisere disse ROS inducing kjemiske som første skjermen. Videre kan forbindelser identifisert være ytterligere analysert i vitro i isolerte bukspyttkjertelen Holme celle kultur-systemet beskrevet i manuskriptet. Vi har vist effekten av ROS-inducing xenobiotics på glukose-stimulere insulinsekresjon av de isolerte småøyer, som kort gir diabetogenic data for disse testet forbindelser. Bukspyttkjertelen holmer pre-behandlet med PCB126 og BPA viste en betydelig reduksjon i insulinsekresjon enn i kontrollgruppen (figur 5).
Figur 1 : Prosedyre av musen bukspyttkjertelen perfusjon. Prosedyren består av følgende: (1) finne ampulla og bruke to par buede tang for å klemme ampulla. (2) inn nålen gjennom felles galle. (3) sakte injisere 3 mL collagenase løsning aksjer i 5 mL sprøyte. (4) samle distended bukspyttkjertelen fra tolvfingertarmen.
Figur 2 : Isolert musen holmer. Isolert musen bukspyttkjertelen holmer i kultur medium vises. Skala for på 500 µm.
Figur 3 : Glukose-stimulert insulinsekresjon av isolerte bukspyttkjertelen holmer. Doseavhengig glukose-stimulert insulinsekresjon (1, 3.3 og 16,7 mM, behandlet i 15 min) ble målt i isolerte småøyer (gjennomsnitt 5 holmer per brønn), bruker en mus insulin ELISA kit. Viser standard avvik. p < 0,05.
Figur 4 : Induksjon av ROS av xenobiotics i isolerte småøyer fra C57BL/6 mus. (A) isolerte småøyer ble behandlet for 12t og farget med fluorescens fargestoff 2', 7'-dichlorofluorescein (DCFH-DA) 1t. Fluorescensen ble bestemt av en fluorescens plate leser. (B) den kjemiske-indusert ROS var slukket av NAC (5 mM). (AFB1: 3 µM, Atrazine: 100 µM, BaP: 10 µM, BPA: 100 µM, PCB126: 10 µM, Nonylphenol, BPA: 100 µM og NAC: 5 mM). Viser standard avvik. p < 0,05. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Xenobiotic oval effekter på glukose-stimulert insulinsekresjon av isolerte småøyer. Isolerte småøyer var pre-behandlet med PCB126, β-østrogen og BPA (4 h) og holdt i Holme kultur medium 1t. Nedbryting av øyene ble samlet inn for måling av insulin av en kommersielt tilgjengelig mus insulin ELISA analysen. Viser standard avvik. p < 0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Samler bevis antyder at eksponering for miljømessige kjemikalier spiller en viktig rolle i utviklingen av T2DM. Xenobiotics-indusert ROS har blitt anerkjent som en potensiell paranoid faktor som bidrar til utviklingen av T2DM. Mennesker er utsatt for en rekke xenobiotic oval kjemikalier og det er et stort behov for romanen forskning teknikker å effektivt identifisere bukspyttkjertelen giftstoffer og undersøke mekanisme toksisitet gjelder for bukspyttkjertelen celler.
I denne studien, basert på publiserte prosedyrer14, har vi utviklet en protokoll for å isolere bukspyttkjertelen holmer fra mus og skjermen cellene med xenobiotic oval kjemikalier for oksidativt stress-indusert skade bukspyttkjertelen celler. Vi bruker også denne fremgangsmåten til å undersøke de bukspyttkjertelen bestemte giftig svarene av den xenobiotic oval forbindelser. For å få bukspyttkjertelen fra musen, foretrekker vi å bruke avertin over andre anestesi fordi det endrer ikke blodsukkernivået og påvirker ikke er blodkar bukspyttkjertelen15,16,17. Vi fant at tetthet gradert sentrifugering trinnet er kritisk for isolering av øyen med høy renhetsgrad. Forsiktighet bør utvises å få forskjellige laget mellom den polysucrose/natrium og isolasjon buffer fasen å få en ren holmer prøve, fri for rusk og exocrine celler/vev. Metoden kan brukes i vitro analyse av kjemiske miljøeffekter på bukspyttkjertelen Holme fysiologi, som GSIS analysen (som vist i Figur 3). Øyene bør nøye spres med gjentatte pipettering i separate celler å sikre uniformerte celle nummer i 96-celle kultur plate. Metoden beskrevet kombinert her isolering av Holmen og en rask analysen for ROS generasjon og er derfor en enkel og effektiv første skjermen for potensielle bukspyttkjertelen-ødeleggende kjemikalier.
Vi brukte insulinsekresjon svar på glukose utfordring for å bekrefte identiteten til de isolerte bukspyttkjertelen holmer. Fremgangsmåten er svært tilpasningsdyktige for analyse av endringer i parametere, inkludert insulinsekresjon (Figur 3) og leiren generasjon, som svar på xenobiotic oval behandlinger18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av et pilotprosjekt stipend fra CREH center sponset NIEHS og av National Natural Science Foundation of China (nr. 31572626).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10×Hank’s balanced salt solution | GIBCO | 14185-052 | |
| Collagenase Type 4 | Worthington Biochemical Corporation | CLS-4 | |
| polysucrose/sodium diatrizoate solution | Sigma | 10771 | |
| 2’,7’-dichlorofluorescein (DCFH-DA) | Sigma | D6883-50MG | |
| fluorescence microplate reader | Biotek | ||
| L-glutamine | Sigma | G8540-25G | |
| streptomycin | GIBCO | 15140148 | |
| FBS | GIBCO | 26140079 | |
| RPMI 1640 | GIBCO | 11875-085 | |
| avertin | Sigma | T48402-25G | |
| Rat/Mouse Insulin ELISA Kit | Millipore | EZRMI-13K | |
| Centrifuge | Sorval | Sorval RT7 | for 96-well plate centrifuge |
| Microplate reader | Biotek | Epoch 2 | for fluorescence reading |
References
- Maruthur, N. M. The growing prevalence of type 2 diabetes: increased incidence or improved survival? Current diabetes reports. 13 (6), 786-794 (2013).
- Houstis, N., Rosen, E. D., Lander, E. S. Reactive oxygen species have a causal role in multiple forms of insulin resistance. Nature. 440 (7086), 944-948 (2006).
- Ma, Z. A., Zhao, Z., Turk, J. Mitochondrial dysfunction and beta-cell failure in type 2 diabetes mellitus. Exp Diabetes Res. , 703538 (2012).
- Valavanidis, A., Vlahogianni, T., Dassenakis, M., Scoullos, M. Molecular biomarkers of oxidative stress in aquatic organisms in relation to toxic environmental pollutants. Ecotoxicology and environmental safety. 64 (2), 178-189 (2006).
- Robertson, R. P., Harmon, J., Tran, P. O., Tanaka, Y., Takahashi, H. Glucose toxicity in β-cells: type 2 diabetes, good radicals gone bad, and the glutathione connection. Diabetes. 52 (3), 581-587 (2003).
- Kaneto, H., et al. Oxidative stress induces p21 expression in pancreatic islet cells: possible implication in beta-cell dysfunction. Diabetologia. 42 (9), 1093-1097 (1999).
- Maechler, P., Jornot, L., Wollheim, C. B. Hydrogen peroxide alters mitochondrial activation and insulin secretion in pancreatic beta cells. Journal of Biological Chemistry. 274 (39), 27905-27913 (1999).
- Gao, D., et al. The effects of palmitate on hepatic insulin resistance are mediated by NADPH Oxidase 3-derived reactive oxygen species through JNK and p38MAPK pathways. Journal of Biological Chemistry. 285 (39), 29965-29973 (2010).
- Efendić, S., et al. Pancreastatin and islet hormone release. Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (20), 7257-7260 (1987).
- Tian, Y., Ke, S., Denison, M. S., Rabson, A. B., Gallo, M. A. Ah receptor and NF-κB interactions, a potential mechanism for dioxin toxicity. Journal of Biological Chemistry. 274 (1), 510-515 (1999).
- Cui, H., et al. Pregnane X receptor regulates the AhR/Cyp1A1 pathway and protects liver cells from benzo-[α]-pyrene-induced DNA damage. Toxicology Letters. 275, 67-76 (2017).
- Li, L. A., Wang, P. W. PCB126 induces differential changes in androgen, cortisol, and aldosterone biosynthesis in human adrenocortical H295R cells. Toxicological Sciences. 85 (1), 530-540 (2005).
- Asahi, J., et al. Bisphenol A induces endoplasmic reticulum stress-associated apoptosis in mouse non-parenchymal hepatocytes. Life sciences. 87 (13), 431-438 (2010).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Murine pancreatic islet isolation. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (7), e255 (2007).
- Kirstetter, P., Lagneau, F., Lucas, O., Krupa, Y., Marty, J. Role of endothelium in the modulation of isoflurane-induced vasodilatation in rat thoracic aorta. British journal of anaesthesia. 79 (1), 84-87 (1997).
- Brown, E., Umino, Y., Loi, T., Solessio, E., Barlow, R. Anesthesia can cause sustained hyperglycemia in C57/BL6J mice. Visual neuroscience. 22 (5), 615-618 (2005).
- Vaupel, D., McCoun, D., Cone, E. J. Phencyclidine analogs and precursors: rotarod and lethal dose studies in the mouse. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 230 (1), 20-27 (1984).
- Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination. Journal of visualized experiments: JoVE. (88), (2014).
