Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Maus pankreatische Inselzellen für das screening von ROS Induktionen durch die XENOBIOTIKA Ermittlung der potenziellen diabetogene XENOBIOTIKA Chemikalien zu isolieren.
Abstract
Exposition gegenüber bestimmten Umweltchemikalien in Mensch und Tier wurde gefunden, um zelluläre Schäden der Bauchspeicheldrüse β-Zellen verursachen, die zu die Entwicklung von Diabetes Mellitus Typ 2 (T2DM) führt. Obwohl die Mechanismen für die chemisch induzierte β Zellschädigung unklar und wahrscheinlich zu komplex waren, ist eine immer wiederkehrende Erkenntnis, dass diese Chemikalien verursachen oxidativen Stress führt zu der Generation von übermäßigen reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) die Schäden zu verursachen die β-Zelle. Ermittlung potenzieller diabetogene Umweltchemikalien, isoliert wir pankreatische Inselzellen von C57BL/6 Mäusen und kultivierten Inselzellen in 96-Well Zellplatten Kultur; dann wurden die Inselzellen mit Chemikalien dosiert und die ROS-Generation wurde von 2', 7'-dichlorofluoresceins (RLKV-DA) Fluoreszenzfarbstoff erkannt. Mit dieser Methode wir gefunden, dass Bisphenol A (BPA), Benzo [a] pyren (BaP) und polychlorierten Biphenylen (PCB), können hohe Konzentrationen von ROS, was darauf hindeutet, dass sie potenziell Schaden in Inselzellen induzieren können induzieren. Diese Methode sollte für das screening von diabetogene XENOBIOTIKA nützlich sein. Darüber hinaus können die kultivierten Inselzellen auch für in-vitro- Analyse der chemisch induzierten Toxizität in Zellen der Bauchspeicheldrüse angepasst werden.
Introduction
Anstieg der Prävalenz von T2DM geworden in den letzten Jahren stellt eine ernsthafte Bedrohung für öffentliche Gesundheit1einer weltweiten Gesundheitskrise. Viele Faktoren gefunden worden zur Entwicklung des T2DM, darunter kausal verknüpft werden wiederkehrende Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine konvergente Gemeinsamkeit dieser Faktoren ist die Induktion von oxidativem Stress führt zu der Generation von übermäßigen ROS2 , 3.
Ein breites Spektrum von Umweltchemikalien wie PCB, Dioxine und BaP hat sich herausgestellt, induzieren oxidativen Stress beeinträchtigen die Funktion der Bauchspeicheldrüse β-Zellen und zu Insulin-Resistenz und T2DM4führen kann. Obwohl der physiologische Ebene von ROS in zellulären Funktionen eine wichtige Rolle spielt, ROS, die die Kapazität des antioxidativen Systems übersteigt führt zu Schäden an Zellen/Gewebe und führt zu Krankheiten5. Pankreatische β-Zellen express ein niedriges Niveau der antioxidativen Enzym, und somit ist eine sensible Zielgruppe für den oxidativen Stress-vermittelten Schäden6,7. Chronische Exposition gegenüber hohen Konzentrationen von ROS wurde gezeigt, dass Stress-induzierte Pankreas Zelle Dysfunktion5 verursachen sowie Insulinresistenz in der Leber und Fettgewebe8.
Das übergeordnete Ziel dieses Projektes ist es, eine zellbasierte Assays Bildschirm Chemikalien für ihre diabetogene Potenziale basierend auf ihre Induktion von ROS in Zellen der Bauchspeicheldrüse entwickeln. Die Bauchspeicheldrüse fehlt metabolische Entgiftung und ist ein sensibler Ziel für Fremdstoff-induzierten Schäden6,7. Daher soll dieser Assay durch direkte Messung der ROS erzeugt in den Zellen der Bauchspeicheldrüsen, eine direkte Annäherung an die chemisch induzierte Schädigung der Bauchspeicheldrüse. Um diese Methode zu entwickeln, wir Maus Pankreas Inseln isoliert, kultiviert die isolierte Insel unter Zelle Kultur Bedingung mit Chemikalien und genutzt, die chemisch induzierte ROS-Generation als das Auslesen. Dieses Verfahren ist einfach und effektiv bei der Identifizierung von ROS-induzierende Chemikalien in der isolierten Insel; Es kann für die Untersuchung der Mechanismen der Toxizität weiterentwickelt werden, die speziell für die Bauchspeicheldrüse in Vitro.
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Protocol
Alle Tierversuche wurden hingerichtet, unter Beachtung aller relevanten Richtlinien, Verordnungen und Aufsichtsbehörden. Das Protokoll wird gezeigt wurde unter der Leitung und Genehmigung der institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) von der Texas A & M Institut für Genomic Medizin durchgeführt.
1. Vorbereitung der Lösung
- 10 X Hank ausgeglichene Salzlösung, 1 X mit doppelt destilliertem H2O verdünnen und Lagerung bei 4 ° C.
- Bereiten Sie die Isolierungslösung indem HEPES (10 mM), MgCl2 (1 mM) und Glukose (5 mM). Einstellen Sie den pH-Wert 7,4 und halten Sie auf dem Eis.
- Bereiten Sie die Kollagenase-Lösung von Kollagenase Typ 4.
Hinweis: Insbesondere enthält Kollagenase Typ 4 160 U pro mg Trockengewicht. 1 g Kollagenase Typ 4 wird in 5 mL doppelt destilliertem H2O mit einer Konzentration von 200 mg/mL verdünnt. 2 mL der verdünnten Kollagenase ist 30 mL Eis kalt isoliert Projektmappe hinzugefügt, und 6 mL Kollagenase-Lösung wird in ein 50 mL-Tube für jede Maus übertragen. - Bereiten Sie die Waschlösung durch Zugabe von 1 mM CaCl2 zur Isolierungslösung.
- Bereiten Sie die Reinigung Lösung mit kalten Polysucrose/Natrium-Diatrizoate-Lösung (1,1119 g/mL, 5 mL).
- Bereiten Sie 500 mL Kulturmedium Inselchen durch Zugabe von L-Glutamin (20 mM), Penicillin (100 U/mL), Streptomycin (100 µg/mL) und fetalen bovine Serum (FBS) (10 %) in RPMI Medium vor.
- Vorbereiten der RLKV-DA-Stammlösung durch Auflösen des Pulvers in destilliertem Wasser bei 200 µM und Store bei-20 ° C.
Hinweis: Die Färbelösung ROS wird durch Verdünnung RLKV-DA-Stammlösung auf die Endkonzentration von 5 µM in RPMI frisch zubereitet. Dieses Reagenz sollten vor Licht geschützt werden.
2. chirurgische Vorbereitung
- Intraperitoneale Injektion (i.p.) eine Maus mit avertin (2,5 % avertin, 0,4 mL/20 g). Nach die Maus völlig betäubt ist und nicht mehr reagiert zum hinteren Fuß drückt, einschläfern die Maus und die biologische Motorhaube.
- Platzieren Sie die euthanasierten Maus mit dem Bauch nach oben und sprühen Sie die Haut mit 70 % igem Ethanol für die Sterilisation.
- Öffnen der Bauchhöhle mit einem 1 cm U-Schnitt auf den Oberbauch aus- und Einfahren der Haut in Richtung rostral über der Brust, die Bauchhöhle verfügbar zu machen.
3. die Bauchspeicheldrüse Perfusion und Entfernung
- Wie in Abbildung 1dargestellt, finden Sie den Standort der Ampulle. Verwenden Sie ein paar gebogene Pinzetten, Klemmen Sie den Zwölffingerdarm nahe der Position des Sphincter Oddi. Verwenden Sie ein weiteres Paar gebogene Pinzetten, Klemmen Sie die Zwölffingerdarm Wand um den Weg der Galle in den Zwölffingerdarm zu blockieren.
Hinweis: Der Ampulle wurde nicht in diesem Schritt eingefügt. Dieser Schritt soll die Galle Weg in den Zwölffingerdarm blockieren. - Positionieren Sie die Maus mit dem Kopf proximalen und distalen in Bezug auf die Forscher die Füße.
- Finden Sie den hauptgallengang und injizieren Sie langsam 3 mL Kollagenase-Lösung mit einer 30 G Nadel und 5 mL Spritze. Sicherstellen Sie, dass der Gallengang und Bauchspeicheldrüse nach der Injektion aufgeblasen werden.
- Entfernen Sie die aufgeblähten Bauchspeicheldrüse mit den gebogenen Pinzette und feine Schere, um es von den absteigenden Dickdarm, Darm, Magen und Milz zu trennen. Die Bauchspeicheldrüse in einen 50-mL-Röhrchen mit 3 mL Kollagenase-Lösung und lassen Sie ihn auf Eis.
4. Bauchspeicheldrüse Verdauung
- Legen Sie je 50-mL-Tube in einem 37 ° C-Wasserbad. 15-20 min inkubieren (Zeit variiert je nach Sorte und Alter der Mäuse).
- Schwingen Sie das Rohr mit einem Wirbel.
- Pool 4-5 verdaute Bauchspeicheldrüse in ein großes sterile Waschbecken Sieb und eine Kugel verwenden, um die Bauchspeicheldrüse gründlich auseinander zu fallen. Verwenden Sie eine 23 G Nadel und 10 mL Spritze mit Waschlösung, um mit Nachdruck die verdauten Zellen außerhalb des Bildschirms pipette. Sammeln Sie die Waschlösung in einen 50-mL-Tube.
- Zentrifugieren Sie die Rohre mit 97 X g bei 4 ° C für 1 min und Dekantieren Sie des Überstandes.
- Rohre fügen Sie 25 mL Waschlösung hinzu und erneut aussetzen Sie des Gewebes durch sanfte aufschütteln. Spin-down der Gewebe bei 97 X g bei 4 ° C für 1 min und den überstand abgießen. Für 3 Mal wiederholen. Achten Sie darauf, dass Sie nicht das gebeizte Gewebe verdrängen.
5. Reinigung der kleinen Inseln
- Das gewaschene Gewebe Pellet 10 mL Reinigung Lösung hinzu und Aufschwemmen Sie sanft des Inhalts.
- Überlagern Sie sanft 5 mL Lösung zur Isolierung auf die Reinigung Lösung. Achten Sie darauf, um eine scharfe flüssigen Schnittstelle zwischen den beiden Lösungen zu halten.
- Zentrifugieren Sie das Rohr auf 560 x g bei 4 ° C für 15 min mit der langsamen Beschleunigung und keine Bremse. Legen Sie die Pipette in die Schnittstelle und sammeln Sie die Inselchen Schicht in neuen 50 mL Röhrchen.
- Waschen Sie die kleinen Inseln, wie unter Punkt 3.5 beschrieben.
(6) Beschichtung und Behandlung von Inselzellen
- Die kleinen Inseln in 10 mL Inselchen Kulturlösung Aufschwemmen, sanft gut mischen und 100 µL/Well mit einer Mehrkanal-Pipette auf eine 96-Well-Platte zu platzieren. Platzieren Sie ca. 5 Inseln pro 96 gut.
- Legen Sie die Platte in der Gewebekultur-Inkubator für 12 h.
- Zentrifugieren Sie (112 X g) 96-Well-Platte und entfernen Sie das Kulturmedium zu.
- Verdünnen Sie die Umweltchemikalien in das Kulturmedium Inselchen. 100 µL der einzelnen chemischen Verdünnungsmitteln in separaten Vertiefungen der Platte hinzufügen. Aufschwemmen der Inseln in jede Vertiefung und inkubieren Sie für 12 h bei 37 ° C (die Konzentration variiert für verschiedenen Umweltchemikalien).
(7) ROS Färbung und Messung
- Nachbehandlung der Inselchen mit 1 X PBS waschen (200 µL für jede 96-Well).
Hinweis: Die Konzentration der Chemikalien ist wie folgt: AFB1: 3 µM, Atrazin: 100 µM, BaP: 10 µM, BPA: 100 µM, β-Östrogen, PCB126: 10 µM, Nonylphenol und BPA: 100 µM. - Verwenden Sie N-Acetyl-Cystein (NAC) als Antioxidans ROS zu stillen. Die ROS-induzierten chemischen Verdünnungsmittel 5 mM der NAK hinzu und 12 h bei 37 ° c inkubieren
- Die 96-Well-Platte bei 112 X g zentrifugieren und mit 5 µM-Lösung von fluoreszierenden Sonde (H2-RLKV-DA aufgelöst in RPMI Medien) bei 37 ° C für 60 min inkubieren.
- Die behandelten Inselzellen 3 Mal mit PBS waschen und Messung die Fluoreszenz mit Dozent Mikrotestplatte an 488 nm.
Hinweis: Die Anhäufung von DCF in Zellen kann gemessen werden, durch eine Erhöhung der Fluoreszenz bei 530 nm, wenn die Probe bei 488 angeregt wird nm. - Führen Sie die Glukose stimuliert Insulin-Sekretion (GSIS) Assay9 auf ROS-induzierende Harnblase behandelt Inselchen und unbehandelten Inselchen, die insbesondere Auswirkungen auf die physiologische Funktion der Bauchspeicheldrüsen Inselchen zu messen.
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Representative Results
Ein Schliffbild der gesunden isolierten Insel ist in Abbildung 2gezeigt, in dem kleinen Inseln eine Runde oder ovale Form mit relativ einheitliche Größe haben (obwohl Größe Einheitlichkeit von Stamm zu Stamm unterschiedlich sein kann). Wir als Nächstes untersucht pancreatic Islet-Funktionen in einer in-vitro- Assay durch das Inselchen zu isolieren und Stimulierung der Insulinsekretion in den Kultur-Inseln. Abbildung 3 zeigt unsere typische Analyse des GSIS Assays von C57BL/6 Maus isoliert Inselchen von 3,3 mM und 16,7 mM Glukose9induziert.
Die Platte Format Bildschirm-Methode verwenden, haben wir mehrere XENOBIOTIKA identifiziert, die verursacht erheblichen Induktion von ROS in Inselzellen (Abbildung 4). Wir behandeln die isolierte Inseln mit verschiedenen Chemikalien für 12 h gefunden, dass Atrazin, BPA, BaP und PCB126und β-Östrogen könnte erhebliche Induktion von ROS in den isolierten Inseln10,11,12 , 13.
ROS ist, zwar nicht gleich die diabetogene Induktion gibt es genügend Hinweise darauf die wichtige Rolle von ROS in Schäden an der physiologischen Funktionen des Pankreas β-Zellen, die zum T2DM8führt. Daher ist der Wert der Arbeit, diese ROS induzierende Chemikalie als das Einstiegsbild zu identifizieren. Darüber hinaus können die Verbindungen identifiziert weiter analysiert in-vitro- in isolierte Pankreatische Insel Zellkultursystem im Manuskript beschrieben sein. Wir haben die Auswirkungen der ROS-induzierende XENOBIOTIKA auf Glukose-stimulierende Insulin-Sekretion der isolierten Inseln gezeigt, die kurz diabetogene Daten für diese geprüften Verbindungen zur Verfügung. Pankreas Inseln mit PCB126 und BPA vorbehandelt zeigte eine signifikante Abnahme der Insulin-Sekretion als die Kontrollgruppe (Abbildung 5).
Abbildung 1 : Verfahren der Maus Bauchspeicheldrüse Perfusion. Das Verfahren besteht aus den folgenden Schritten: (1) der Ampulle finden und verwenden zwei Paar gebogene Pinzetten, Klemmen Sie die Ampulle. (2) setzen Sie die Nadel durch die gemeinsame Galle. (3) injizieren Sie langsam Kollagenase Lösung bestand in der 5 mL-Spritze 3 mL. (4) die aufgeblähten Bauchspeicheldrüse ausgehend von den Zwölffingerdarm zu sammeln.
Abbildung 2 : Maus-Inseln isoliert. Isolierte Maus Pankreas Inseln in Kulturmedium werden angezeigt. Maßstabsleiste von 500 µm.
Abbildung 3 : Glucose-stimulierten Insulinsekretion isoliert Pankreas Inseln. Dosisabhängige Glukose-stimulierten Insulinsekretion (1, 3.3 und 16,7 mM behandelt für 15 min) wurde gemessen, in isolierten Inseln (durchschnittlich 5 Inseln pro Well), mit einer Maus Insulin ELISA Kit. Fehlerbalken zeigen Standardabweichungen. p < 0,05.
Abbildung 4 : Induktion von ROS von XENOBIOTIKA in isolierten Inseln von C57BL/6 Mäusen. (A) isolierte Inseln waren für 12 h behandelt und gefärbt mit Fluoreszenz-Farbstoff 2', 7'-dichlorofluoresceins (RLKV-DA) für 1 h. Die Fluoreszenz wird durch ein Fluoreszenz-Platte-Leser bestimmt. (B), die chemisch induzierte ROS wurden von NAC (5 mM) abgeschreckt. (AFB1: 3 µM, Atrazin: 100 µM, BaP: 10 µM, BPA: 100 µM, PCB126: 10 µM, Nonylphenol, BPA: 100 µM und NAC: 5 mM). Fehlerbalken zeigen Standardabweichungen. p < 0,05. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5 : XENOBIOTIKA Auswirkungen auf Glukose-stimulierten Insulinsekretion isolierten Inseln. Isolierte Inseln waren mit PCB126, β-Östrogen und BPA (4 h) vorbehandelt und in Insel Kulturmedium für 1 h gehalten. Der Überstand der Inseln wurden für die Messung von Insulin durch eine handelsübliche Maus Insulin ELISA Test. Fehlerbalken zeigen Standardabweichungen. p < 0,05.
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Discussion
Sammeln Beweise deutet darauf hin, dass die Exposition zu Umweltchemikalien spielt eine wichtige Rolle bei der Entwicklung des T2DM. XENOBIOTIKA-induzierte ROS wurde als ein möglicher ätiologischer Faktor zur Entwicklung des T2DM anerkannt. Menschen ein breites Spektrum von XENOBIOTIKA Chemikalien ausgesetzt sind, und es gibt ein großer Bedarf an neuartigen Forschungstechniken, effektiv die Bauchspeicheldrüse Giftstoffe zu identifizieren und zu untersuchen, den Mechanismus der Toxizität für die Zellen der Bauchspeicheldrüsen.
In dieser Studie, basierend auf veröffentlichten Verfahren14entwickelten wir ein Protokoll zum Pankreas Inselchen von Maus und Bildschirm isolieren die Zellen mit XENOBIOTIKA Chemikalien für oxidativen Stress-induzierte Schäden an den Zellen der Bauchspeicheldrüsen. Wir verwenden Sie dieses Verfahren, um die Bauchspeicheldrüsen spezifischen toxischen Reaktionen induziert durch die xenobiotischen Verbindungen zu untersuchen. Um die Bauchspeicheldrüse von Maus zu erhalten, bevorzugen wir über andere Anästhesie avertin, denn es nichts an der Blutzuckerwerte ändert und hat keinen Einfluss auf das Gefäßsystem der Bauchspeicheldrüse15,16,17. Wir fanden, dass die Dichte Gradienten Zentrifugationsschritt für Isolierung der Insel mit hoher Reinheit entscheidend. Darauf sollte geachtet werden, um die deutliche Schicht zwischen der Polysucrose/Natrium und Isolation Puffer-Phase um eine reine Inselchen Probe frei von Schmutz und exokrinen Zellen/Gewebe erhalten zu erhalten. Die Methode kann für in-vitro- Analyse der chemische Umwelteinflüsse auf Pankreas Inselchen Physiologie, wie z. B. der GSIS Assay verwendet werden (siehe Abbildung 3). Die kleinen Inseln sollten sorgfältig verteilt werden, mit wiederholten pipettieren in getrennte Zellen, uniformierten Zellzahl in der 96-Zellkultur-Platte zu gewährleisten. Die beschriebene Methode hier kombiniert die Isolation von der Insel und eine schnelle Assay für ROS Generation und ist deshalb eine einfache und effektive Einstiegsbild für potenzielle Pankreas-schädigenden Chemikalien.
Als Reaktion auf Glukose Herausforderung verwendet wir Insulin-Sekretion, um die Identität der isolierte pankreatischen Inselchen zu bestätigen. Das Verfahren ist sehr anpassungsfähig für die Analyse der Veränderungen der Parameter, einschließlich Insulin-Sekretion (Abbildung 3) und cAMP-Generation, als Reaktion auf XENOBIOTIKA Behandlungen18.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch ein Pilotprojekt Stipendium CREH Zentrum gesponsert durch NIEHS und National Natural Science Foundation of China (Nr. 31572626) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10×Hank’s balanced salt solution | GIBCO | 14185-052 | |
| Collagenase Type 4 | Worthington Biochemical Corporation | CLS-4 | |
| polysucrose/sodium diatrizoate solution | Sigma | 10771 | |
| 2’,7’-dichlorofluorescein (DCFH-DA) | Sigma | D6883-50MG | |
| fluorescence microplate reader | Biotek | ||
| L-glutamine | Sigma | G8540-25G | |
| streptomycin | GIBCO | 15140148 | |
| FBS | GIBCO | 26140079 | |
| RPMI 1640 | GIBCO | 11875-085 | |
| avertin | Sigma | T48402-25G | |
| Rat/Mouse Insulin ELISA Kit | Millipore | EZRMI-13K | |
| Centrifuge | Sorval | Sorval RT7 | for 96-well plate centrifuge |
| Microplate reader | Biotek | Epoch 2 | for fluorescence reading |
References
- Maruthur, N. M. The growing prevalence of type 2 diabetes: increased incidence or improved survival? Current diabetes reports. 13 (6), 786-794 (2013).
- Houstis, N., Rosen, E. D., Lander, E. S. Reactive oxygen species have a causal role in multiple forms of insulin resistance. Nature. 440 (7086), 944-948 (2006).
- Ma, Z. A., Zhao, Z., Turk, J. Mitochondrial dysfunction and beta-cell failure in type 2 diabetes mellitus. Exp Diabetes Res. , 703538 (2012).
- Valavanidis, A., Vlahogianni, T., Dassenakis, M., Scoullos, M. Molecular biomarkers of oxidative stress in aquatic organisms in relation to toxic environmental pollutants. Ecotoxicology and environmental safety. 64 (2), 178-189 (2006).
- Robertson, R. P., Harmon, J., Tran, P. O., Tanaka, Y., Takahashi, H. Glucose toxicity in β-cells: type 2 diabetes, good radicals gone bad, and the glutathione connection. Diabetes. 52 (3), 581-587 (2003).
- Kaneto, H., et al. Oxidative stress induces p21 expression in pancreatic islet cells: possible implication in beta-cell dysfunction. Diabetologia. 42 (9), 1093-1097 (1999).
- Maechler, P., Jornot, L., Wollheim, C. B. Hydrogen peroxide alters mitochondrial activation and insulin secretion in pancreatic beta cells. Journal of Biological Chemistry. 274 (39), 27905-27913 (1999).
- Gao, D., et al. The effects of palmitate on hepatic insulin resistance are mediated by NADPH Oxidase 3-derived reactive oxygen species through JNK and p38MAPK pathways. Journal of Biological Chemistry. 285 (39), 29965-29973 (2010).
- Efendić, S., et al. Pancreastatin and islet hormone release. Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (20), 7257-7260 (1987).
- Tian, Y., Ke, S., Denison, M. S., Rabson, A. B., Gallo, M. A. Ah receptor and NF-κB interactions, a potential mechanism for dioxin toxicity. Journal of Biological Chemistry. 274 (1), 510-515 (1999).
- Cui, H., et al. Pregnane X receptor regulates the AhR/Cyp1A1 pathway and protects liver cells from benzo-[α]-pyrene-induced DNA damage. Toxicology Letters. 275, 67-76 (2017).
- Li, L. A., Wang, P. W. PCB126 induces differential changes in androgen, cortisol, and aldosterone biosynthesis in human adrenocortical H295R cells. Toxicological Sciences. 85 (1), 530-540 (2005).
- Asahi, J., et al. Bisphenol A induces endoplasmic reticulum stress-associated apoptosis in mouse non-parenchymal hepatocytes. Life sciences. 87 (13), 431-438 (2010).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Murine pancreatic islet isolation. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (7), e255 (2007).
- Kirstetter, P., Lagneau, F., Lucas, O., Krupa, Y., Marty, J. Role of endothelium in the modulation of isoflurane-induced vasodilatation in rat thoracic aorta. British journal of anaesthesia. 79 (1), 84-87 (1997).
- Brown, E., Umino, Y., Loi, T., Solessio, E., Barlow, R. Anesthesia can cause sustained hyperglycemia in C57/BL6J mice. Visual neuroscience. 22 (5), 615-618 (2005).
- Vaupel, D., McCoun, D., Cone, E. J. Phencyclidine analogs and precursors: rotarod and lethal dose studies in the mouse. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 230 (1), 20-27 (1984).
- Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination. Journal of visualized experiments: JoVE. (88), (2014).
