Summary
Aquí presentamos un protocolo para aislar células de islote pancreático de ratón para la detección de las inducciones de ROS por los xenobióticos con el fin de identificar los potenciales químicos xenobióticos diabetogenic.
Abstract
Exposición a determinadas sustancias químicas ambientales en humanos y animales se ha encontrado para causar daño celular de las células β pancreáticas que conducirá al desarrollo de diabetes mellitus tipo 2 (T2DM). Aunque los mecanismos para el daño de la célula β inducida por químicos eran probablemente sea complejo y confuso, un hallazgo recurrente es que estos productos químicos inducen estrés oxidativo que conduce a la generación de especies reactivas excesiva del oxígeno (ROS) que inducen daño a la célula β. Para identificar potenciales químicos ambientales diabetogenic, se aislaron células de los islotes pancreáticos de ratones C57BL/6 y las células del islote cultivadas en placas de cultivo celular de 96 pozos; Luego, las células del islote fueron dosificadas con productos químicos y la generación de ROS se detectó por 2', 7'-Diclorofluoresceína (DCFH-DA) colorante fluorescente. Usando este método, encontró bisphenol A (BPA), Benzo [a] pireno (BaP) y los bifenilos policlorados (PCB), podría inducir a altos niveles de ROS, sugiriendo que potencialmente pueden inducir daño en las células del islote. Este método debe ser útil para la detección diabetogenic xenobióticos. Además, las células del islote culta también pueden ser adaptadas para el análisis en vitro de la toxicidad inducida por el producto químico en las células pancreáticas.
Introduction
Aumentos en la prevalencia de T2DM se han convertido en una crisis de salud global en los últimos años plantea una grave amenaza a la salud pública1. Se han encontrado muchos factores causal relacionada con el desarrollo de T2DM, entre los que repite resultados sugieren que un punto convergente común para estos factores es la inducción de estrés oxidativo que conduce a la generación excesiva de ROS2 , 3.
Una amplia gama de productos químicos ambientales como PCBs, dioxinas y BaP se ha encontrado para inducir el estrés oxidativo, que puede perjudicar el funcionamiento de las células β pancreáticas y llevar a resistencia a la insulina y T2DM4. Aunque a nivel fisiológico de ROS desempeña un papel importante en las funciones celulares, la exposición a ROS que excede la capacidad del sistema antioxidante provoca el daño a las células/tejidos y conduce a enfermedades5. Las células β pancreáticas expresan un bajo nivel de enzimas antioxidantes y por lo tanto están un objetivo sensible de la mediada por estrés oxidativo6,7. La exposición crónica a altos niveles de ROS se ha demostrado para causar la disfunción de células pancreáticas inducida por estrés5 así como resistencia a la insulina en el hígado y tejido adiposo8.
El objetivo general de este proyecto es desarrollar un ensayo basado en células para productos químicos de la pantalla para sus potenciales diabetogenic basados en la inducción de ROS en las células pancreáticas. El páncreas carece de desintoxicación metabólica y es un blanco sensible de daño inducido por xenobióticos6,7. Por lo tanto, midiendo directamente los ROS generados en las células pancreáticas, este análisis deben proporcionar una aproximación directa a la lesión inducida por el producto químico en el páncreas. Para desarrollar este método, aislados islotes pancreático de ratón, había cultivado el islote aislado bajo condiciones de cultivo celular con productos químicos y utiliza la generación de ROS inducida por químicos como la lectura. Este procedimiento es simple y eficaz en la identificación de productos químicos inductores de ROS en el islote aislado; pueden desarrollarse para la investigación de los mecanismos de toxicidad que son específicos para el páncreas in vitro.
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Protocol
Todos los experimentos en animales fueron ejecutados en cumplimiento de todas las directrices pertinentes, regulaciones y agencias reguladoras. El protocolo se demostró fue realizado bajo la dirección y aprobación de la institucional Animal Care y el Comité uso (IACUC) de la Texas A & M Instituto de medicina genómica.
1. preparación de la solución
- Diluir una solución salina equilibrada de Hank de x 10 a 1 x con doble destilada H2O y almacenar a 4 ° C.
- Preparar la solución de aislamiento mediante la adición de HEPES (10 mM), MgCl2 (1 mM) y glucosa (5 mM). Ajustar el pH a 7,4 y mantener en hielo.
- Preparar la solución de colagenasa de colagenasa tipo 4.
Nota: Especialmente, la colagenasa tipo 4 contiene 160 U por mg de peso seco. 1 g de colagenasa tipo 4 es diluido en 5 mL doble destilada H2O con una concentración de 200 mg/mL. se agrega 2 mL de colagenasa diluida a la solución de aislamiento frío de hielo de 30 mL y 6 mL de solución de colagenasa se transfiere a un tubo de 50 mL para cada ratón. - Preparar la solución de lavado agregando 1 mM CaCl2 a la solución de aislamiento.
- Preparar la solución de purificación con solución de diatrizoato de sodio polysucrose frío (1,1119 g/mL, 5 mL).
- Preparar 500 mL de medio de cultivo de islotes pancreáticos mediante la adición de L-glutamina (20 mM), penicilina (100 U/mL), estreptomicina (100 μg/mL) y suero bovino fetal (FBS) (10%) en Medio RPMI.
- Prepare la solución DCFH-DA disolviendo el polvo en agua destilada a 200 μm y almacenar a-20 ° C.
Nota: El ROS solución de tinción es recién hecho diluyendo DCFH-DA solución a la concentración final de 5 μm en RPMI. Este reactivo debe ser protegido de la luz.
2. quirúrgico preparación
- Inyectar por vía intraperitoneal (I.P.) un ratón con avertin (2,5% avertin, 0,4 mL/20 g). Después de que el ratón está totalmente anestesiado y no responde a hind pie pizcas, eutanasia el ratón y mueve la campana biológica.
- Coloque el ratón eutanasia con el abdominal hacia arriba y rociar la piel con etanol al 70% para la esterilización.
- Abrir la cavidad abdominal con un 1 cm U-incisión en el abdomen superior y retraiga la piel en dirección rostral sobre el pecho para exponer la cavidad abdominal.
3. eliminación y perfusión páncreas
- Como se ilustra en la figura 1, encontrar la ubicación de la ampolla. Utilizar un par de pinzas curvas para apretar el duodeno cerca de la posición del esfínter de Oddi. Usar otro par de pinzas curvas para sujetar a la pared del duodeno para bloquear la vía biliar en el duodeno.
Nota: La ampolla no se ha insertado en este paso. Este paso está destinado a bloquear la vía biliar en el duodeno. - Vuelva a colocar el ratón con la cabeza proximal y los pies distales en relación con el investigador.
- El conducto biliar común y la inyecte lentamente 3 mL de solución de colagenasa con una jeringa de aguja y 5 mL de 30 G. Asegúrese de que el conducto biliar común y el páncreas se inflan después de la inyección.
- Retire el páncreas distendido con los fórceps curvado y tijeras finas para separar el colon descendente, intestino, estómago y bazo. Colocar el páncreas en un tubo de 50 mL que contiene 3 mL de solución de colagenasa y mantenerlo en hielo.
4. páncreas digestión
- Coloque cada tubo de 50 mL en un baño de agua de 37 ° C. Incube durante 15-20 minutos (el tiempo varía con la cepa y edad de los ratones).
- Vibrar el tubo utilizando un vortex.
- Piscina 4-5 páncreas digerida en un colador grande Lavabo estéril y utilizar una cuchara para que el páncreas desintegrarse completamente. Utilice una jeringa de aguja y 10 mL de 23 G con solución de lavado para pipetear con fuerza las células digeridas fuera de la pantalla. Recoger la solución de lavado en un tubo de 50 mL.
- Centrifugar los tubos a 97 x g a 4 ° C por 1 min y decantar el sobrenadante.
- Añadir 25 mL de solución de lavado para tubos y vuelva a suspender el tejido con un vórtex suave. Desactivación de los tejidos a 97 x g a 4 ° C por 1 min y decantar el sobrenadante. Repita 3 veces. Tenga cuidado de no desplazar los tejidos concentrados.
5. purificación de islotes
- Añadir 10 mL de solución de purificación a la pelotilla de tejido lavado y resuspender suavemente el contenido.
- Recubrimiento con cuidado 5 mL de solución de aislamiento en la solución de purificación. Tenga cuidado de mantener una interfaz líquida sostenida entre las dos soluciones.
- Centrifugar el tubo a 560 x g a 4 ° C durante 15 min con una aceleración lenta y sin freno. Introduzca la pipeta en la interfaz y recoger la capa de islotes en nuevos tubos de 50 mL.
- Lave los islotes como se describe en el paso 3.5.
6. revestimiento y tratamiento de las células del islote
- Resuspender los islotes en 10 mL de solución de cultivo de islotes, suavemente mezcle bien y coloque 100 μL/pocillo con una pipeta multicanal a una placa de 96 pocillos. Colocar aproximadamente 5 islotes por 96 bien.
- Colocar la placa en la incubadora de cultivo de tejidos para 12 h.
- Centrifugar (112 x g) la placa de 96 pocillos y retire el medio de cultivo.
- Diluir los productos químicos ambientales en el medio de cultivo de islotes. Añadir 100 μl de cada uno de los diluyentes químicos en pocillos separados de la placa. Resuspender los islotes en cada pocillo e incubar durante 12 h a 37 ° C (la concentración varía para los diferentes productos químicos ambientales).
7. ROS coloración y a la medida
- Después del tratamiento de islotes, lavado con PBS 1 x (200 μL para cada 96-well).
Nota: La concentración de las sustancias químicas es como sigue: AFB1: 3 μm, atrazina: 100 μm, BaP: 10 μm, BPA: 100 μm, β-estrógeno, PCB126: 10 μm, nonilfenol y BPA: 100 μm. - Uso de N-acetil cisteína (NAC) como antioxidante para saciar ROS. Añadir 5 mM de NAC a los diluyentes químicos inducida por ROS e incubar durante 12 h a 37 ° C.
- Centrifugar la placa de 96 pocillos x 112 g e incubar con solución de 5 μm de sonda fluorescente (H2-DCFH-DA disuelto en medios RPMI) a 37 ° C durante 60 minutos.
- Lavar las células de los islotes tratados 3 veces con PBS y medir la fluorescencia con un lector de microplacas a 488 nm.
Nota: La acumulación de DCF en células se puede medir por un aumento en fluorescencia en 530 nm cuando la muestra es excitada a 488 nm. - Realizar la insulina estimulada por glucosa secreción (GSIS) ensayo9 de xenobióticos inducen ROS tratados islas e islotes no tratadas para medir los efectos de xenobióticos sobre la función fisiológica de los islotes pancreáticos.
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Representative Results
Una micrografía del islote aislado sano se muestra en la figura 2, en la cual islotes tienen una forma redonda u ovalada con relativamente uniforme de tamaño (aunque uniformidad de tamaño puede variar de una cepa a cepa). Investigamos a continuación las funciones del islote pancreático en un ensayo en vitro por aislar el islote y estimulando la secreción de insulina en los islotes de cultura. La figura 3 muestra el análisis típico del ensayo GSIS de C57BL/6 islotes de ratón aislado inducida por glucosa de 3,3 mM y 16,7 mM9.
El método de placa formato pantalla, hemos identificado varios xenobióticos que causó inducción significativa de ROS en las células del islote (figura 4). Nos trataron los islotes aislados con diferentes productos químicos durante 12 h y la atrazina, BPA, BaP y PCB126y β de estrógeno podría causar significativa inducción de ROS en los islotes aislados10,11,12 , 13.
Aunque no es igual a la inducción de diabetogenic ROS, existe amplia evidencia que indica el importante papel de las ROS en causar daño a las funciones fisiológicas de las células β pancreáticas, que conduce a T2DM8. Por lo tanto, el valor del trabajo es identificar estos ROS inductores químicos como la pantalla inicial. Además, los compuestos identificados pueden ser más analizados en vitro en el sistema de cultivo de células de islotes pancreáticos aislados descrito en el manuscrito. Hemos demostrado los efectos de los xenobióticos inducen ROS de glucosa estimulando la secreción de insulina de los islotes aislados, que brevemente diabetogenic datos para estos compuestos probados. Islotes pancreáticos pretratadas con PCB126 y BPA mostraron una disminución significativa en la secreción de insulina que el grupo control (figura 5).
Figura 1 : Procedimiento de perfusión del páncreas de ratón. El procedimiento consta de los siguientes pasos: (1) encontrar la ampolla y utilizar dos pares de pinzas curvadas para apretar la ampolla. (2) Inserte la aguja a través de la bilis común. (3) lentamente inyectar 3 mL de stock de solución de colagenasa en la jeringa de 5 mL. (4) recoge el páncreas dilatado a partir del duodeno.
Figura 2 : Aislados islotes de ratón. Islotes pancreáticos aislados de ratón en medio de cultivo se muestran. Barra de escala de 500 μm.
Figura 3 : Secreción de insulina estimulada por glucosa de los islotes pancreáticos aislados. La secreción de insulina estimulada por glucosa dependiente de la dosis (1, 3.3 y 16,7 mM, trataron durante 15 min) se midió en islotes aislados (promedio 5 islotes por pozo), con una insulina de ratón ELISA kit. Barras de error indican desviaciones estándar. p < 0.05.
Figura 4 : Inducción de ROS por xenobióticos en islotes aislados de ratones C57BL/6. Islotes aislados (A) fueron tratados durante 12 h y teñidos con colorante de fluorescencia 2', 7'-Diclorofluoresceína (DCFH-DA) durante 1 hora. La fluorescencia se determinó mediante un lector de fluorescencia. (B) la química inducida por ROS se apagó por NAC (5 mM). (AFB1: 3 μm, atrazina: 100 μm, BaP: 10 μm, BPA: 100 μm, PCB126: 10 μm, nonilfenol, BPA: 100 μm y NAC: 5 mM). Barras de error indican desviaciones estándar. p < 0.05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 : Xenobióticos efectos sobre la secreción de insulina estimulada por glucosa de los islotes aislados. Islotes aislados se pretrata con PCB126, β-estrógeno y BPA (4 h) y se mantuvieron en medio de cultivo de islotes pancreáticos para 1 h. Se recogió el sobrenadante de los islotes para la medición de la insulina por una insulina de ratón disponibles comercialmente ELISA ensayo. Barras de error indican desviaciones estándar. p < 0.05.
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Discussion
La acumulación de pruebas sugiere que la exposición a químicos ambientales desempeña un papel importante en el desarrollo de T2DM. Inducida por xenobióticos ROS ha sido reconocido como un factor etiológico potencial contribuyendo al desarrollo de T2DM. Los seres humanos están expuestos a una amplia gama de productos químicos xenobióticos y hay una gran necesidad de técnicas de investigación novedosas para identificar efectivamente los toxicantes pancreáticos e investigar el mecanismo de la toxicidad específica de las células pancreáticas.
En este estudio, basado en los procedimientos publicados en14, hemos desarrollado un protocolo para aislar islotes pancreáticos de ratón y la pantalla de las células con productos químicos xenobióticos para inducida por el estrés oxidativo a las células pancreáticas. También usamos este procedimiento para investigar las respuestas tóxicas específicas pancreáticas inducidas por los compuestos xenobióticos. Para obtener el páncreas de ratón, preferimos utilizar avertin sobre otros anestesia ya que no altera los niveles de glucosa en sangre y no afecta a la vasculatura del páncreas15,16,17. Encontramos que el paso de centrifugación del gradiente de densidad es crítico para el aislamiento de los islotes pancreáticos de alta pureza. Debe tenerse cuidado para obtener la capa distintiva entre la fase de amortiguamiento polysucrose sodio y aislamiento para obtener una muestra de islotes puro, desprovisto de escombros y exocrino las células/tejidos. El método puede utilizarse para el análisis en vitro de efectos químicos ambientales en la fisiología del islote pancreático, como el ensayo GSIS (como se muestra en la figura 3). Los islotes deben ser cuidadosamente dispersos con pipeteo repetido en celdas separadas para número de uniformados de la célula en la placa de cultivo celular de 96. El método descrito aquí combina el aislamiento de la isla y un ensayo rápido para la generación de ROS y por lo tanto, es una pantalla inicial simple y efectiva para los posibles productos químicos dañan el páncreas.
Utilizamos la secreción de insulina en respuesta a la glucosa para confirmar la identidad de los islotes pancreáticos aislados. El procedimiento es altamente adaptable para el análisis de los cambios en los parámetros, incluida la secreción de insulina (figura 3) y la generación de campo, en respuesta a xenobióticos tratamientos18.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por una subvención de proyecto piloto de centro CREH auspiciada por NIEHS y por la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (Nº 31572626).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10×Hank’s balanced salt solution | GIBCO | 14185-052 | |
| Collagenase Type 4 | Worthington Biochemical Corporation | CLS-4 | |
| polysucrose/sodium diatrizoate solution | Sigma | 10771 | |
| 2’,7’-dichlorofluorescein (DCFH-DA) | Sigma | D6883-50MG | |
| fluorescence microplate reader | Biotek | ||
| L-glutamine | Sigma | G8540-25G | |
| streptomycin | GIBCO | 15140148 | |
| FBS | GIBCO | 26140079 | |
| RPMI 1640 | GIBCO | 11875-085 | |
| avertin | Sigma | T48402-25G | |
| Rat/Mouse Insulin ELISA Kit | Millipore | EZRMI-13K | |
| Centrifuge | Sorval | Sorval RT7 | for 96-well plate centrifuge |
| Microplate reader | Biotek | Epoch 2 | for fluorescence reading |
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