Summary
Qui presentiamo un protocollo per isolare le cellule delle isole pancreatiche del mouse per lo screening di induzioni ROS dai xenobiotici al fine di identificare i potenziali prodotti chimici xenobiotici diabetogeni.
Abstract
L'esposizione a determinati prodotti chimici ambientali negli umani e negli animali è stato trovato per causare danno cellulare delle cellule β del pancreas che porterà allo sviluppo di diabete mellito di tipo 2 (T2DM). Anche se i meccanismi per il danno cellulare indotto da chimica β erano poco chiare e probabile che sia complessa, una scoperta ricorrente è che queste sostanze chimiche inducono lo sforzo ossidativo che porta alla generazione di specie di eccessiva reattive dell'ossigeno (ROS) che inducono danni alla la cella β. Per identificare potenziali diabetogeni prodotti chimici ambientali, abbiamo isolato le cellule di Langerhans dai topi C57BL/6 e cellule dell'isolotto coltivate in piastre per colture cellulari di 96 pozzetti; cellule dell'isolotto sono state dosate con prodotti chimici, quindi la generazione di ROS è stata rilevata da 2', 7'-diclorofluorescina (DCFH-DA) tintura fluorescente. Utilizzando questo metodo, abbiamo trovato che il bisfenolo A (BPA), Benzo [a] pirene (BaP) e policlorobifenili (PCB), potrebbe indurre elevati livelli di ROS, suggerendo che potenzialmente possono indurre danni in cellule dell'isolotto. Questo metodo dovrebbe essere utile per lo screening di xenobiotici diabetogeni. Inoltre, cellule dell'isolotto coltivate possono anche essere adattate per l'analisi in vitro della tossicità chimica-indotta in cellule pancreatiche.
Introduction
Aumento della prevalenza di T2DM è diventati una crisi sanitaria globale negli ultimi anni ponevano una seria minaccia alla salute pubblica1. Molti fattori sono stati trovati per essere causalmente collegato allo sviluppo di T2DM, tra i quali, ricorrenti risultati suggeriscono che un comune punto convergente per questi fattori è l'induzione di stress ossidativo che porta alla generazione di eccessivo ROS2 , 3.
Un ampio spettro di prodotti chimici ambientali compresi PCB, diossine e BaP è stato trovato per indurre stress ossidativo, che può alterare la funzione delle cellule β del pancreas e portare a insulino-resistenza e T2DM4. Anche se il livello fisiologico di ROS svolge un ruolo importante nelle funzioni cellulari, l'esposizione a ROS che supera la capacità del sistema antiossidante provoca il danno ai tessuti o cellule e conduce a malattie5. Le cellule β del pancreas esprimere un basso livello di enzima antiossidante e quindi sono un obiettivo sensibile per il danno ossidativo di sforzo-mediati6,7. L'esposizione cronica ad alti livelli di ROS è stato indicato per causare la disfunzione di cellula pancreatica indotta da stress5 così come la resistenza di insulina nel fegato e nel tessuto adiposo8.
L'obiettivo generale di questo progetto è quello di sviluppare un'analisi basata su celle a sostanze chimiche di schermo per loro potenziali diabetogeni basati su loro induzione del ROS in cellule pancreatiche. Il pancreas manca disintossicazione metabolica ed è un obiettivo sensibile per danni indotti da xenobiotici6,7. Pertanto, misurando direttamente i ROS generati nelle cellule del pancreas, questo test dovrebbe fornire un'approssimazione diretta della ferita indotta da prodotto nel pancreas. Per sviluppare questo metodo, abbiamo isolato isolotti pancreatici del topo, coltivate l'isolotto isolato sotto condizione di cultura delle cellule con sostanze chimiche e utilizzate la generazione di ROS indotta da sostanze chimiche come la lettura. Questa procedura è semplice ed efficace nell'identificazione di prodotti chimici che inducono ROS nell'isolato isolotto; può essere ulteriormente sviluppato per indagine dei meccanismi di tossicità che sono specifici per il pancreas in vitro.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con tutte le pertinenti linee guida, regolamenti e agenzie di regolamentazione. Il protocollo in questione è stato effettuato sotto la guida e l'approvazione del istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) della Texas A & M. Istituto per la medicina genomica.
1. soluzione preparazione
- Diluire la soluzione salina bilanciata di Hank di 10 x 1 x con doppio distillata H2O e conservare a 4 ° C.
- Preparare la soluzione di isolamento aggiungendo HEPES (10 mM), MgCl2 (1 mM) e glucosio (5 mM). Regolare il pH a 7,4 e tenere sul ghiaccio.
- Preparare la soluzione di collagenasi da collagenasi tipo 4.
Nota: In particolare, collagenasi tipo 4 contiene 160 U per mg di peso a secco. 1 g di collagenasi tipo 4 è diluito in 5 mL doppio distillata H2O con una concentrazione di 200 mg/mL. 2 mL della collagenosi diluita viene aggiunto alla soluzione di isolamento freddo ghiaccio 30 mL e 6 mL di soluzione di collagenasi viene trasferito in una provetta 50 mL per ogni mouse. - Preparare la soluzione di lavaggio aggiungendo 1 mM CaCl2 per la soluzione di isolamento.
- Preparare la soluzione di purificazione con soluzione di sodio polysucrose freddo diatrizoate (1,1119 g/mL, 5 mL).
- Preparare 500 mL di terreno di coltura dell'isolotto con l'aggiunta di L-Glutammina (20 mM), penicillina (100 U/mL), streptomicina (100 µ g/mL) e siero bovino fetale (FBS) (10%) nel medium RPMI.
- Preparare la soluzione di riserva di DCFH-DA sciogliendo la polvere in acqua distillata a 200 µM e conservare a-20 ° C.
Nota: Il ROS macchiatura soluzione viene preparato diluendo la soluzione di riserva di DCFH-DA alla concentrazione finale di 5 µM in RPMI. Questo reagente dovrebbe essere protetto dalla luce.
2. preparazione chirurgica
- Iniettare per via intraperitoneale (I.P.) un mouse con avertin (2,5% avertin, 0,4 mL/20 g). Dopo che il mouse è completamente anestetizzato e non risponde più a posteriori del piede pizzichi, eutanasia il mouse e spostare la cappa biologica.
- Posizionare il mouse eutanasizzato col lato addominale rivolto verso l'alto e spruzzare sulla pelle con etanolo al 70% per la sterilizzazione.
- Aprire la cavità addominale con un 1 cm U-incisione sulla parte superiore dell'addome e ritrarre la pelle in direzione rostrale sopra la cassa per esporre la cavità addominale.
3. rimozione e l'aspersione del pancreas
- Come illustrato nella Figura 1, trovare la posizione del ampulla. Utilizzare un paio di pinze curve per serrare il duodeno vicina alla posizione dello sfintere di Oddi. Utilizzare un altro paio di pinzetta per serrare la parete del duodeno per bloccare la via biliare nel duodeno.
Nota: L'ampolla non è stata inserita in questo passaggio. Questo passaggio è destinato a bloccare la via biliare nel duodeno. - Riposizionare il mouse con la testa prossimale e distale per quanto riguarda il ricercatore piedi.
- Trovare il dotto biliare comune e iniettare lentamente 3 mL di soluzione della collagenosi con una siringa di ago e 5 mL di 30 G. Assicurarsi che il dotto biliare comune e il pancreas sono gonfiati dopo l'iniezione.
- Rimuovere il pancreas dilatato usando la pinzetta e forbice per separarla da discendente del colon, intestino, stomaco e milza. Posizionare il pancreas in un tubo da 50 mL contenente 3 mL di soluzione di collagenasi e tenerlo sul ghiaccio.
4. pancreas digestione
- Collocare ciascuna provetta da 50 mL in bagnomaria a 37 ° C. Incubare per 15-20 minuti (il tempo varia con lo sforzo e l'età dei topi).
- Vibrare il tubo con un vortex.
- Girone 4-5 pancreas digerito in un colino grande lavandino sterile e utilizzare una paletta per rendere il pancreas cadere a pezzi accuratamente. Utilizzare una siringa di ago e 10ml 23g contenente la soluzione di lavaggio per pipettare con forza le cellule digerite fuori dallo schermo. Raccogliere la soluzione di lavaggio in un tubo da 50 mL.
- Centrifugare le provette a 97 x g a 4 ° C per 1 min e decantare il supernatante.
- Aggiungere 25 mL di soluzione di lavaggio in provette e risospendere il tessuto delicato nel Vortex. Rotazione verso il basso i tessuti a 97 x g a 4 ° C per 1 min e decantare il supernatante. Ripetere per 3 volte. Fare attenzione a non spostare il tessuto pellettato.
5. purificazione degli isolotti
- Aggiungere 10 mL di soluzione di purificazione al pellet di tessuto lavato e Risospendere delicatamente il contenuto.
- Sovrapposizione delicatamente 5 mL di soluzione di isolamento sulla soluzione di purificazione. Prestare attenzione a mantenere un'interfaccia liquida tagliente tra le due soluzioni.
- Centrifugare la provetta a 560 x g a 4 ° C per 15 min con accelerazione lenta e senza freno. Inserire la pipetta nell'interfaccia e raccogliere lo strato di isolotti in nuove provette da 50 mL.
- Lavare gli isolotti come descritto al punto 3.5.
6. placcatura e trattamento delle cellule dell'isolotto
- Risospendere le isolette in 10 mL di soluzione di cultura di isolotti, delicatamente mescolare bene e mettere 100 µ l/pozzetto con una pipetta multicanale per una piastra a 96 pozzetti. Posizionare bene circa 5 isolotti a 96.
- Posizionare la piastra nell'incubatore coltura tissutale per 12 h.
- Centrifugare (112 x g) la piastra a 96 pozzetti e rimuovere il terreno di coltura.
- Diluire i prodotti chimici ambientali nel terreno di coltura di isolotti. Aggiungere 100 µ l di ciascuno dei diluenti chimici in pozzetti separati della piastra. Risospendere le isolette in ogni pozzetto e incubare per 12 ore a 37 ° C (la concentrazione varia per i diversi prodotti chimici ambientali).
7. ROS macchiatura e misurazione
- Dopo il trattamento di isolotti, lavare con PBS 1X (200 µ l per ogni 96 pozzetti).
Nota: La concentrazione delle sostanze chimiche è come segue: AFB1: 3 µM, atrazina: 100 µM, BaP: 10 µM, BPA: 100 µM, β-estrogeno, PCB126: 10 µM, nonilfenolo e BPA: 100 µM. - Utilizzare N-acetil cisteina (NAC) come antiossidante per placare ROS. Aggiungere 5 mM di NAC per i diluenti chimici indotta da ROS e incubare per 12 ore a 37 ° C.
- Centrifugare la piastra a 96 pozzetti a 112 x g e incubare con soluzione di 5 µM di sonda fluorescente (H2-DCFH-DA dissolto nei media RPMI) a 37 ° C per 60 min.
- Lavare le cellule dell'isolotto trattate 3 volte con PBS e misurare la fluorescenza con un lettore di micropiastre a 488 nm.
Nota: L'accumulo di DCF in cellule può essere misurata tramite un aumento nella fluorescenza a 530 nm quando il campione è eccitato a 488 nm. - Eseguire il glucosio-stimolata dell'insulina secrezione (GSIS) dosaggio9 su xenobiotici che inducono ROS trattati isolette e isolotti non trattati per misurare gli effetti degli xenobiotici sulla funzione fisiologica degli isolotti pancreatici.
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Representative Results
Un Micrografo dell'isolotto isolato sano è illustrato nella Figura 2, in cui isolotti hanno una forma rotonda o ovale con relativamente uniforme dimensioni (anche se uniformità di dimensione può variare da ceppo a ceppo). Successivamente abbiamo studiato le funzioni pancreatiche in un'analisi in vitro isolando l'isolotto e stimolando la secrezione di insulina negli isolotti di cultura. La figura 3 Mostra la nostra analisi tipica del dosaggio GSIS da C57BL/6 isolotti di topo isolato indotto da 3,3 mM e 16,7 mM glucosio9.
Usando il metodo della piastra formato schermo, abbiamo identificato diversi xenobiotici che ha causato l'induzione significativa di ROS in cellule dell'isolotto (Figura 4). Abbiamo trattato gli isolotti isolati con diverse sostanze chimiche per 12 h e trovato quello di atrazina, BPA, BaP e PCB126, e β-estrogeno potrebbe causare induzione significativa di ROS in isolotti isolati10,11,12 , 13.
Anche se non è uguale all'induzione diabetogeni ROS, è ampiamente dimostrato che indica l'importante ruolo dei ROS nel causare danni per le funzioni fisiologiche delle cellule β del pancreas, che conduce a T2DM8. Di conseguenza, il valore del lavoro consiste nell'identificare questi ROS inducendo chimico come schermata iniziale. Inoltre, i composti identificati possono essere ulteriormente analizzato in vitro nel sistema di coltura cellulare di isole pancreatiche isolato descritto nel manoscritto. Abbiamo mostrato gli effetti degli xenobiotici che inducono ROS sulla secrezione di insulina glucosio-stimolante degli isolotti isolati, che brevemente forniscono dati diabetogeni per questi composti in esame. Isolotti pancreatici pretrattati con PCB126 e BPA ha mostrato una diminuzione significativa nella secrezione di insulina rispetto al gruppo di controllo (Figura 5).
Figura 1 : Procedura di aspersione del pancreas di mouse. La procedura prevede i passaggi seguenti: (1) trovare ampulla e utilizzare due coppie di pinzetta per morsetto ampulla. (2) inserire l'ago attraverso la bile comune. (3) lentamente iniettare 3 mL di brodo di soluzione di collagenasi nella siringa 5 mL. (4) raccogliere il pancreas dilatato a partire dal duodeno.
Figura 2 : Isolato isolotti topo. Il isolotti pancreatici del topo isolato nel mezzo di coltura sono mostrato. Barra della scala di 500 µm.
Figura 3 : Secrezione insulinica glucosio-mediata degli isolotti pancreatici isolati. Secrezione insulinica glucosio-mediata dipendente dalla dose (1, 3.3 e 16,7 mM, trattati per 15 min) è stata misurata in isolotti isolati (media 5 isolotti per pozzetto), usando una mouse l'insulina ELISA kit. Barre di errore indicano le deviazioni standard. p < 0.05.
Figura 4 : Induzione di ROS da xenobiotici in isolotti isolati da topi C57BL/6. Isolotti isolati (A) sono stati trattati per 12 h e macchiati con tintura di fluorescenza 2', 7'-diclorofluorescina (DCFH-DA) per 1 h. La fluorescenza è stata determinata da un lettore di fluorescenza. (B) la chimica indotta da ROS sono stati temprati da NAC (5 mM). (AFB1: 3 µM, atrazina: 100 µM, BaP: 10 µM, BPA: 100 µM, PCB126: 10 µM, nonilfenolo, BPA: 100 µM e NAC: 5 mM). Barre di errore indicano le deviazioni standard. p < 0.05. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 : Xenobiotici effetti sulla secrezione insulinica glucosio-mediata degli isolotti isolati. Isolotti isolati sono stati pre-trattati con PCB126, β-estrogeno e BPA (4 h) e mantenuti in terreno di coltura dell'isolotto per 1 h. Il surnatante degli isolotti è stato raccolto per la misura dell'insulina di un'insulina di mouse commercialmente disponibili ELISA test. Barre di errore indicano le deviazioni standard. p < 0.05.
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Discussion
Raccogliendo la prova suggerisce che l'esposizione ai prodotti chimici ambientali svolge un ruolo importante nello sviluppo di T2DM. ROS indotta da xenobiotici è stato riconosciuto come un potenziale fattore eziologico che contribuiscono allo sviluppo di T2DM. Gli esseri umani sono esposti a una vasta gamma di prodotti chimici xenobiotici e c'è un grande bisogno di tecniche di ricerca romanzo di identificare in modo efficace le sostanze tossiche del pancreas e di studiare il meccanismo della tossicità specifica per le cellule pancreatiche.
In questo studio, basato su procedure pubblicate14, abbiamo sviluppato un protocollo per isolare gli isolotti pancreatici da mouse e schermo le cellule con prodotti chimici xenobiotici per danneggiamento indotto da stress ossidativo le cellule pancreatiche. Abbiamo anche utilizzare questa procedura per indagare le risposte tossiche specifiche pancreatiche indotte da composti xenobiotici. Per ottenere il pancreas da mouse, preferiamo usare avertin sopra altri anestesia perché non altera i livelli di glucosio nel sangue e non influisce il sistema vascolare del pancreas15,16,17. Abbiamo trovato che la fase di centrifugazione su gradiente di densità è critica per l'isolamento dell'isolotto con elevata purezza. Cura dovrebbe essere presa per ottenere il livello di distinto tra la fase di tampone sodio polysucrose e isolamento per ottenere un campione di isolotti puro, privo di detriti e di tessuti o cellule esocrini. Il metodo può essere utilizzato per l'analisi in vitro degli effetti chimici ambientali sulla fisiologia dell'isolotto pancreatico, ad esempio, il saggio GSIS (come mostrato nella Figura 3). Gli isolotti devono essere attentamente dispersa con ripetute dispensazione in celle separate per garantire il numero di cellulare in uniforme nella piastra di coltura 96-cellulare. Il metodo descritto qui combinato l'isolamento dell'isolotto e un'analisi rapida per la generazione di ROS e di conseguenza, è una schermata iniziale semplice ed efficace per i potenziali prodotti chimici danneggiano il pancreas.
Abbiamo usato la secrezione dell'insulina in risposta alla sfida del glucosio per confermare l'identità degli isolotti pancreatici isolati. La procedura è altamente adattabile per l'analisi dei cambiamenti nei parametri, tra cui la secrezione dell'insulina (Figura 3) e generazione di accampamento, in risposta a trattamenti xenobiotici18.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione di progetto pilota da CREH centro sponsorizzato dal NIEHS e dalla Fondazione nazionale di scienze naturali della Cina (No. 31572626).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10×Hank’s balanced salt solution | GIBCO | 14185-052 | |
| Collagenase Type 4 | Worthington Biochemical Corporation | CLS-4 | |
| polysucrose/sodium diatrizoate solution | Sigma | 10771 | |
| 2’,7’-dichlorofluorescein (DCFH-DA) | Sigma | D6883-50MG | |
| fluorescence microplate reader | Biotek | ||
| L-glutamine | Sigma | G8540-25G | |
| streptomycin | GIBCO | 15140148 | |
| FBS | GIBCO | 26140079 | |
| RPMI 1640 | GIBCO | 11875-085 | |
| avertin | Sigma | T48402-25G | |
| Rat/Mouse Insulin ELISA Kit | Millipore | EZRMI-13K | |
| Centrifuge | Sorval | Sorval RT7 | for 96-well plate centrifuge |
| Microplate reader | Biotek | Epoch 2 | for fluorescence reading |
References
- Maruthur, N. M. The growing prevalence of type 2 diabetes: increased incidence or improved survival? Current diabetes reports. 13 (6), 786-794 (2013).
- Houstis, N., Rosen, E. D., Lander, E. S. Reactive oxygen species have a causal role in multiple forms of insulin resistance. Nature. 440 (7086), 944-948 (2006).
- Ma, Z. A., Zhao, Z., Turk, J. Mitochondrial dysfunction and beta-cell failure in type 2 diabetes mellitus. Exp Diabetes Res. , 703538 (2012).
- Valavanidis, A., Vlahogianni, T., Dassenakis, M., Scoullos, M. Molecular biomarkers of oxidative stress in aquatic organisms in relation to toxic environmental pollutants. Ecotoxicology and environmental safety. 64 (2), 178-189 (2006).
- Robertson, R. P., Harmon, J., Tran, P. O., Tanaka, Y., Takahashi, H. Glucose toxicity in β-cells: type 2 diabetes, good radicals gone bad, and the glutathione connection. Diabetes. 52 (3), 581-587 (2003).
- Kaneto, H., et al. Oxidative stress induces p21 expression in pancreatic islet cells: possible implication in beta-cell dysfunction. Diabetologia. 42 (9), 1093-1097 (1999).
- Maechler, P., Jornot, L., Wollheim, C. B. Hydrogen peroxide alters mitochondrial activation and insulin secretion in pancreatic beta cells. Journal of Biological Chemistry. 274 (39), 27905-27913 (1999).
- Gao, D., et al. The effects of palmitate on hepatic insulin resistance are mediated by NADPH Oxidase 3-derived reactive oxygen species through JNK and p38MAPK pathways. Journal of Biological Chemistry. 285 (39), 29965-29973 (2010).
- Efendić, S., et al. Pancreastatin and islet hormone release. Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (20), 7257-7260 (1987).
- Tian, Y., Ke, S., Denison, M. S., Rabson, A. B., Gallo, M. A. Ah receptor and NF-κB interactions, a potential mechanism for dioxin toxicity. Journal of Biological Chemistry. 274 (1), 510-515 (1999).
- Cui, H., et al. Pregnane X receptor regulates the AhR/Cyp1A1 pathway and protects liver cells from benzo-[α]-pyrene-induced DNA damage. Toxicology Letters. 275, 67-76 (2017).
- Li, L. A., Wang, P. W. PCB126 induces differential changes in androgen, cortisol, and aldosterone biosynthesis in human adrenocortical H295R cells. Toxicological Sciences. 85 (1), 530-540 (2005).
- Asahi, J., et al. Bisphenol A induces endoplasmic reticulum stress-associated apoptosis in mouse non-parenchymal hepatocytes. Life sciences. 87 (13), 431-438 (2010).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Murine pancreatic islet isolation. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (7), e255 (2007).
- Kirstetter, P., Lagneau, F., Lucas, O., Krupa, Y., Marty, J. Role of endothelium in the modulation of isoflurane-induced vasodilatation in rat thoracic aorta. British journal of anaesthesia. 79 (1), 84-87 (1997).
- Brown, E., Umino, Y., Loi, T., Solessio, E., Barlow, R. Anesthesia can cause sustained hyperglycemia in C57/BL6J mice. Visual neuroscience. 22 (5), 615-618 (2005).
- Vaupel, D., McCoun, D., Cone, E. J. Phencyclidine analogs and precursors: rotarod and lethal dose studies in the mouse. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 230 (1), 20-27 (1984).
- Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination. Journal of visualized experiments: JoVE. (88), (2014).
