Summary
Agregação da proteína provoca estresse oxidativo celular. Este protocolo descreve um método para monitorar os Estados intracelulares de proteínas amiloidogénicos e o stress oxidativo associado a eles, usando citometria de fluxo. A abordagem é usada para estudar o comportamento de variantes do peptídeo β-amiloide solúveis e propensas a agregação.
Abstract
Enrolamento de proteínas e de agregação em conformações amiloides têm sido relacionados ao aparecimento e progressão de várias doenças neurodegenerativas. No entanto, ainda há pouca informação sobre proteína insolúvel como agregados exercem seus efeitos tóxicos em vivo. Organismos-modelo simples de procariotas e eucariotas, tais como bactérias e leveduras, têm contribuído significativamente para nossa compreensão atual dos mecanismos por trás da formação de amiloide intracelular, propagação de agregados e toxicidade. Neste protocolo, o uso de levedura é descrito como um modelo para dissecar a relação entre a formação de agregados de proteínas e seu impacto sobre o estresse oxidativo celular. O método combina a detecção de estado solúvel/agregados intracelular de uma proteína amiloidogénicos com a quantificação dos danos oxidativos celulares resultantes de sua expressão usando citometria de fluxo (FC). Essa abordagem é simples, rápido e quantitativo. O estudo ilustra a técnica correlacionando o estresse oxidativo celular, causado por um conjunto grande de variantes de peptídeo β-amiloide com suas propensões respectiva agregação intrínseca.
Introduction
Proteostasis é um determinante fundamental dos processos de adequação e envelhecimento celular. Nas células, homeostase de proteína é mantida pelo controle de qualidade de proteína sofisticadas redes visa garantir a correta dobrar de conformistas de misfolded proteínas por acompanhantes e/ou sua proteólise alvejado com vários mecanismos bem conservados1 ,2,3,4,5. Um grande número de estudos oferece suporte à ligação entre o início e a progressão de uma ampla gama de doenças humanas e o fracasso de proteostasis, levando ao enrolamento de proteínas e agregação. Por exemplo, a presença de depósitos de proteína é considerada uma característica patológica de muitas doenças neurodegenerativas, como Alzheimer, Parkinson e Huntington doenças6,7,8, doenças prionogenic e amyloidoses não-degenerativas9. Tem sido sugerido que cedo assemblies oligoméricos e protofibrillar na reação de agregação são os principais elicitores de citotoxicidade, estabelecendo interações aberrantes com outras proteínas no meio lotado de celular10. Além disso, inclusões de proteína (PI) podem ser transmitidos entre as células, seus efeitos tóxicos11,12de propagação. Portanto, pode ser que a formação de PI de fato pode constituir um mecanismo desintoxicante que restringe a presença de espécies perigosas agregados para locais específicos na célula, onde eles podem ser processados ou acumulados sem grandes efeitos colaterais 13 , 14.
Padrão em vitro abordagens bioquímicas forneceram importantes insights sobre as diferentes espécies que povoam as reações de agregação e suas propriedades de15,16. No entanto, as condições usadas nestes ensaios são claramente diferentes das que ocorrem dentro da célula e, portanto, questionar sua relevância fisiológica. Por causa de conservação notável dos caminhos celulares tais como controle de qualidade de proteína, autofagia ou o Regulamento do estado redox celular17,18 entre eucariotas19,20,21 ,22,23, a brotamento de levedura Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) surgiu como um modelo de celular simples privilegiado para estudar os determinantes moleculares de agregação da proteína e seu impacto associado citotóxico em ambientes biologicamente relevantes24,25,26.
Propensão de agregação de proteínas é uma característica inerentemente codificada na sequência principal. Assim, a formação de estruturas semelhantes a amiloide pode ser prevista com base na identificação e avaliação da potência de agregação-promover regiões em polipeptídeos27. No entanto, apesar do sucesso de bioinformatic algoritmos para prever as propriedades de agregação em vitro de sequências de proteínas, eles estão ainda longe de previsão como essas propensões traduzem na vivo citotóxicos impacto. Estudos que abordam a relação entre o estado agregado de uma determinada proteína e seu dano celular associado de forma sistemática podem ajudar a contornar essa limitação computacional. Esta conexão é abordada no presente estudo, aproveitando-se de um conjunto grande de variantes do peptídeo β-amiloide Aβ42 diferindo apenas em um único resíduo, mas indicando uma escala contínua de agregação propensões na vivo28. Em particular, uma abordagem baseada em FC para identificar a espécie conformacional representando o dano oxidativo eliciado propensas a agregação de proteínas nas células de levedura é descrita. A metodologia oferece muitas vantagens como simplicidade, capacidade de alta produtividade e precisão das medições quantitativo. Esta abordagem, foi possível confirmar essa jogada de PI um papel protetor contra o estresse oxidativo.
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Protocol
1. culturas de S. cerevisiae e expressão da proteína
Nota: Variantes Aβ apresentam propensões de agregação relativa diferente devido a uma mutação em um único resíduo na posição 19 (Phe19) do peptídeo Aβ42 (figura 1A). Essas variantes do peptide são marcados com a proteína fluorescente verde (GFP), que actua como uma agregação de repórter (Figura 1)29.
- Transforme os plasmídeos codificação para 20 variantes de Aβ42-GFP em células de levedura com um BY4741 fundo parental (MATa seu3Δ1 leu2Δ0 conheceu15Δ0 ura3Δ0)30. Cada plasmídeo codifica para um mutante de Aβ42 fundido a GFP por um vinculador GSSGSSG. Os plasmídeos são pESC(-URA) e incluem o marcador selecionável URA329.
- Prepare o suporte completo sintético sem uracil (SC-URA) com os seguintes componentes: 1,9 g/L nitrogênio levedura base sem uracil, 5g/L sulfato de amónio e 900 mL de DDQ2O combinado com 100 mL de glicose de 20% (p/v).
- Colocar uma colônia das células de fermento transformado em 20 mL do meio de SC-URA contendo 2% de glicose e crescem as culturas durante a noite a 30 ° C, sob agitação a 210 rpm.
- No dia seguinte, cresce novas culturas de células de levedura por inoculando 100 µ l de cultura durante a noite em 5 mL de meio fresco SC-URA.
- Em uma OD590 de 0.5, Centrifugar as culturas a 3.000 x g durante 4 min, desprezar o sobrenadante e ressuspender as células no mesmo volume de meio de SC-URA fresco contendo 2% rafinose.
- Incube a 30 ° C, sob agitação a 210 rpm por 30 min. Em seguida, Centrifugar as células a 3.000 x g, durante 4 min e descartar o sobrenadante. Ressuspender as células em meio de SC-URA fresco contendo 2% de galactose para induzir a expressão da proteína recombinante.
- Após 16 h de induzir a expressão de proteínas em meio de SC-URA contendo 2% de galactose, colha 1 mL de células induzidas em tubos estéreis microcentrifuga por centrifugação a 3.000 x g, durante 4 min.
Nota: As diferenças mais relevantes ocorrem após um período de indução de células de levedura induzida de 16 h. expressando variantes de Aβ42-GFP pode ser visualizado por microscopia de fluorescência para determinar a distribuição de proteína recombinante no interior das células (Figura 2B).
2. coloracao celular
Nota: As pilhas novas não induzida são necessárias como um controle negativo para estabelecer um limiar fluorescente durante uma análise FC.
- Levar as células de levedura induzida por h 16 e determinar sua densidade óptica, a 590 nm (OD590). Diluí-los em uma solução salina estéril tamponada de fosfato (PBS) para um OD590 de 0.1.
- Preparar 1 x solução salina tamponada fosfato como segue: adicionar 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na2HPO4, e 0,24 g de KH2PO4 a 800 mL de DDQ2O. Preencha a solução até 1 L de DDQ2O depois de ajustar o pH para 7,4 com HCl. Filtre o buffer com um filtro de 0,2 µm.
- Transferir as suspensões celulares expressando para tubos apropriadamente rotulados (12 × 75 de poliestireno de hum fundo redondo) e protegê-los de luz. Certifique-se de que estão prontos para ser carregado no citômetro de fluxo para análise, juntamente com células não-induzido e não manchada.
- Adicionar a sonda de estresse oxidativo (por exemplo, CellROX vermelha) para cada amostra em uma concentração final de 5 µM e incube as celulas a 30 ° C por 30 min no escuro.
- Após a incubação, lavar as células 3 vezes com 1X PBS e ressuspendê-los no mesmo volume da reserva antes da sua análise pela FC.
3. fluxo Cytometry Analysis
Nota: Use uma configuração FC com lasers apropriados e filtros para detectar GFP e sinal de fluorescência de sonda de estresse oxidativo. Um citômetro de fluxo, equipado com um 488 nm azul do laser para a detecção de GFP e laser 635 nm vermelho para a detecção de fluorescência de sonda de stress oxidativo pode ser usado. Aquisição da fluorescência de emissão de GFP e sonda de estresse oxidativo é executada com um filtro de nm BP 530/30 e um filtro de BP 660/20, respectivamente (tabela 1).
- Clique em Abrir novo painel de planilha e crie os seguintes lotes do ponto de aquisição.
- Selecione a Ferramenta de plotagem Scatter na barra de ferramentas e criar um enredo com as variáveis Scatter-área lateral (SSC-A) sobre o eixo y vs Forward Scatter-área (FSC-A) em uma escala linear no eixo x.
- Clique na Ferramenta de plotagem Scatter na barra de ferramentas e criar um enredo com as variáveis FL1-área (FITC) sobre o eixo x vs. FL3-área (APC) em uma escala logarítmica no eixo y.
- Clique no ícone Configurações de instrumentos . Clique na guia de compensação e definir todos os níveis de compensação. Clique na guia de aquisição e selecione um número total de 20.000 eventos para ser gravado.
- Clique no ícone de Caudal para mudar a taxa de fluxo para baixo.
- Clique na guia de adquirir para começar a correr as células não-induzida, imaculadas e ajustar a tensão nas Configurações do instrumento do RCS e dispersão de lado até que a população é distribuída no quadrante médio esquerdo.
- Clique no ícone do polígono para definir uma região R1, em torno de população celular excluindo os restos da célula e usar esta população gated P1 = R1 para todos os lotes do ponto fluorescente e representações de histograma (Figura 3).
- Para ajustar a tensão de PGTO do sinal de fluorescência, execute as células imaculadas na trama ponto FL1-FL3, ajuste o ganho na guia Configuração do instrumento , até que as células são distribuídas no quadrante inferior esquerdo.
- Altere a amostra para as células induzidas para medir a fluorescência de GFP. Na guia Configuração do instrumento , defina o ganho no FSC-A vs FL1 (FITC) quando a população é distribuída no quadrante inferior direito. Defina a população de células positivas com um portão (portão P2).
- Mudança da amostra para o não-induzida manchado células para exibir o estresse oxidativo por fluorescência em um terreno de ponto FSC-A vs FL3 (APC). Ajuste o ganho até a população celular é distribuída no quadrante esquerdo superior. A população de células positivas em P3 de portão.
- Fazer duas parcelas de histograma com o ícone de histograma para representar a fluorescência da célula. Para representar a intensidade da fluorescência, certifique-se de FL1 (FITC) representando a fluorescência de GFP é no eixo x e FL3 (APC) representando a fluorescência é no eixo y, aplicando as populações P2 e P3 em uma escala logarítmica, respectivamente.
Nota: As sobreposições de histograma são uma boa maneira de ilustrar as diferenças entre os perfis de fluorescência das células expressando diferentes variantes Aβ.
4. recombinação da proteína Immunodetection
- Para determinar os níveis de expressão da proteína, colher as culturas de leveduras induzidas por 16 h por centrifugação a 4.000 x g durante 6 min e armazenar as pelotas de célula a-80 ° C.
- Ressuspender as células coletadas, expressando a proteína recombinante para 16 h em PBS. Prepare suspensões da pilha de 200 µ l de cada mutante de Aβ42-GFP para uma OD590 de 20.
- Para análise de fração de proteínas totais, colheita de 100 µ l de cada mutante por centrifugação a 14.000 x g por 20 min e ressuspender as pelotas de célula no mesmo volume de tampão de lise de leveduras Y-PER (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 1% DMSO, 200 mM de NaCl, 1 mM EDTA, contendo 10 mg/mL (myr SB3-14 istyl sulfobetaine) suplementado com fluoreto de phenylmethylsulfonyl de 1 mM (PMSF)).
- Incube as amostras por 20 min em temperatura ambiente sob leve agitação.
- Determine a concentração de extrato de proteínas usando o ensaio de Bradford. Carrega até 5 µ g de extrato de proteína de cada amostra em um gel de electroforese de SDS-PAGE 15% acrilamida e borrão em uma membrana de difluoreto (PVDF) de polivinilideno a 100 V por 60 min.
- Prepare um Bradford reagente com 100 mg de azul de Coomassie brilhante G-250 dissolvido em 50 mL de etanol a 95% e adicionar 100 mL de ácido fosfórico 85% (p/v). Então, quando o corante é completamente dissolvido, diluir a mistura com o ddH2O de 1L e filtrar por papel de filtro de celulose imediatamente antes da utilização.
Nota: O reagente de Bradford deve ser marrom claro. - Prepare um padrão de albumina de soro bovino (BSA) variando de 5-100 µ g de proteína em 1.000 µ l de reagente de Bradford.
- Adicione 1-10 µ l de proteína extrair a 1 mL de reagente de Bradford e incubar a mistura à temperatura ambiente por 5 min.
- Medir a absorvância das normas e a proteína extrair amostras em OD595.
- Para a análise, fazer um gráfico com os valores de absorvância obtidos para os padrões vs. µ g de proteína. Com base na curva padrão, determine as concentrações das amostras originais da quantidade de proteína, considerando o volume e a diluição, se for o caso.
- Prepare um Bradford reagente com 100 mg de azul de Coomassie brilhante G-250 dissolvido em 50 mL de etanol a 95% e adicionar 100 mL de ácido fosfórico 85% (p/v). Então, quando o corante é completamente dissolvido, diluir a mistura com o ddH2O de 1L e filtrar por papel de filtro de celulose imediatamente antes da utilização.
- Lavar a membrana com 1 x salino Tris (TBS), 0.1% Tween 20 (TTBS) e bloqueá-lo usando leite seco desnatado 5% (p/v) em 1 x TTBS.
- Para preparar 1 L de 10 x TBS, dissolver 24 g de Tris base e 88 g de NaCl em 900 mL de H2Odd e ajustar o pH 7,6. Adicionar O ddH2até um volume final de 1 L. Para uma solução de 1 x, misturar 1 parte de estoque de x 10 com 9 peças de DDQ2O.
- Incubar a membrana para 1 h com um anticorpo primário de β-amiloide 6E10 diluído 1:1,000 e por 1h à temperatura ambiente com uma cabra de anticorpo secundário conjugado de anti-mouse IgG HRP diluído 01:10, 000.
- Desenvolver membranas usando 1 mL do reagente fluorescente Luminata e quantificar bandas por análise densitométricos, conforme descrito na etapa 5.2.
5. análise de dados
- Para analisar os dados obtidos pelo FC, criar uma tabela que exibe a média intensidade fluorescente (IFM) e fluorescência mediana com seu correspondente desvio-padrão e/ou o coeficiente de variação (CV) para os níveis de estresse oxidativo e fluorescência de GFP.
- Clique na guia de Inspetor e o ícone de estatísticas para personalizar os dados estatísticos que são necessários para cada canal.
Nota: Quando se comparam as variantes da proteína, converta dados valores de fluorescência para um fundo dobrável ou resolução métrica (RD):
Nesta métrica, a amostra média é a média fluorescência das amostras do problema, o controle médio é a média fluorescência das células usado como um controle e o SD é o desvio-padrão da média fluorescência. Fator de RD é um índice mais exato do que o valor de IFM como ele não só calcula a diferença entre as amostras, mas também as contas para a divulgação dos dados. Este cálculo é especificamente relevante quando comparar dados provenientes de diferentes experiências realizadas ao longo do tempo. Uma vez que o RDs foram calculado, o uso de um teste estatístico é aconselhável confirmar a significância das diferenças observadas entre as variantes da proteína.
- Clique na guia de Inspetor e o ícone de estatísticas para personalizar os dados estatísticos que são necessários para cada canal.
- Para a proteína immunodetection, quantificar os níveis de proteína recombinante por Western blot utilizando software ImageJ.
- Antes da análise de densitometria, converta as imagens raw originais da membrana desenvolvida em modo JPEG arquivo formato e escala de cinza.
- Ajuste a seção Definir medições do menu Analyze para Dizer o valor de cinza.
- Clique na ferramenta retângulo do ImageJ e definir uma região de interesse (ROI) com um tamanho consistente para a análise de densitometria de banda. Centro de cada banda na imagem dentro da moldura retangular criada de membrana e registrar a medição de um por um, usando Ctrl + M (o comando de medição).
- Meça o fundo local adjacente à cada banda, aplicando a mesma área ROI. Após a medição, subtrai o fundo local correspondente de cada banda individual.
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Representative Results
Este protocolo descreve como empregar uma coleção de 20 variantes do peptide Aβ42 onde Phe19 alterou a todos os naturais proteinogenic aminoácidos28. A propensão de agregação teórica destas proteínas pode ser analisado usando dois algoritmos diferentes bioinformatic (AGGRESCAN e TANGO31,32). Em ambos os casos, esta análise processa uma gradação progressiva das tendências de agregação, atribuindo, como regra geral, os maiores valores de resíduos hidrofóbicos e a mais baixa para aqueles carregados e polares (figura 1B, 1C).
Para controlar o estado intracelular de agregação de diferentes variantes de Aβ42 experimentalmente, o experimento descrito requer uma transformação de um plasmídeo, codificação de Aβ42 e fundido a GFP (figura 1A), sob o controle da galactose-inducible GAL1, em S. cerevisiae. Células de levedura, expressando Aβ42 variantes após um período de indução de 16 h podem ser visualizadas sob um microscópio de fluorescência. Esta visualização torna possível confirmar a formação do PI em 10 dos 20 variantes da coleção analisada. O número e tamanho dos agregados fluorescentes diferem de variante para variante (Figura 2). Figura 2A mostra a quantificação de PI de um total de 500 células em cada uma das duas culturas independentes. Aqui, podemos observar um excelente acordo entre previsto e na vivo Propriedades de agregação.
Para resolver-se a formação de agregados de proteína pode desencadear estresse oxidativo neste sistema de célula de modelo, este protocolo usa FC para monitorar a celular fluorescência de GFP juntamente com a fluorescência da sonda fluorogenic como um indicador de oxigênio reativo produção de espécies (ROS). A Figura 3 ilustra o procedimento e obteve resultados para mutantes Gln e Ile, que correspondem as variantes de Aβ42 homogeneamente distribuídas e formadoras de PI, respectivamente.
Primeiro, a população de células analisadas é fechado (P1) no ponto FSC-A vs CCD-A trama para remover detritos de célula a partir da análise (Figura 3A). O sinal de fluorescência da GFP vs estresse oxidativo sonda da população P1 é representado em gráficos de ponto enredo onde células fluorescentes verde são bloqueadas em P3 (Figura 3B). Figura 3 e 3D mostram os histogramas criados para obter dados estatísticos para cada variante expressa, incluindo o CV (tabela 2), de forma a quantificar a média e a mediana fluorescência de cada marcador fluorescente.
Todos os mutantes são esperados para ser expressas nos mesmos níveis, já que diferem em um único aminoácido (0,02% da sequência de Aβ42-GFP). No entanto, a maquinaria de proteostasis pode responder de uma forma diferencial de suas propensões de agregação particular. Portanto, os níveis de expressão de proteínas em extratos celulares são quantificados utilizando um anticorpo específico de Aβ (Figura 4). Vemos que, como uma tendência geral, variantes de Aβ42 formadoras de PI estão presentes em níveis inferiores aos restantes homogeneamente distribuída no citosol.
Diferenças importantes entre as variantes de Aβ42 podem ser observadas quando sua fluorescência de sonda de estresse oxidativo, níveis de proteína e propriedades de fluorescência de GFP são representadas em relação à sua capacidade de formar suas propensões intrínsecas de agregação ( e PI Figura 5). A agregação-propenso PI-formando variantes provocam muito estresse oxidativo mais baixo do que suas contrapartes mais solúveis (Figura 5A, 5B). Com estes resultados, não há nenhuma correlação óbvia entre o tamanho e o número de agregados por célula individual (Figura 2) e os níveis de estresse oxidativo. PI-formando variantes, especialmente os mutantes rolamento Trp e Phe na posição 19, estão presentes na célula a níveis inferiores aqueles distribuídos homogênea no citosol (Figura 5, 5D). A exceção é o mutante Thr, para os quais menos de 10% das células formam PI (figura 1B, 1C). Isso corresponde com o fato de que as variantes mais propensas a agregação são seletivamente desmarcadas por degradação de controle de qualidade o fermento máquinas28. Fluorescência de GFP e os níveis de proteína correlacionam-se bem para as formas de Aβ42 mais solúveis, mas não para aqueles formando PI (Figura 5E, 5F). Isto é provavelmente porque nessas populações celulares, a fluorescência vem de dois compartimentos diferentes, o citoplasma e as inclusões, e suas contribuições relativas para a total da fluorescência diferem entre mutantes34.
Figura 1 . Análise de propensão de agregação para a coleção de construções de fusão-GFP Aβ42 derivado a mutação de resíduo na posição 19 no peptídeo Aβ42 por todos os aminoácidos naturais. A. esta imagem mostra um modelo 3D da wt Aβ42 fundiu a GFP um ligador (Aβ42, cinza; GFP, verde), baseado no PDB 1EMA de proteína verde fluorescente de Aequorea victoria e o 2OTK para o peptídeo de Alzheimer Aβ, em que a cadeia lateral Phe19 de wt Aβ42 é mostrada em vermelho. O modelo é criado utilizando o software Pymol. Resíduo 19 na sequência de Aβ42 ocupa uma posição central no cluster central hidrofóbica. Os gráficos de barras são criados com duas diferentes bioinformatic preditores: B. AGGRESCAN, C. TANGO. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 . Variantes de Aβ42-GFP PI-formando em S. cerevisiae culturas induzidas por 16 h de expressão. A. O gráfico de barras indica a percentagem de células que contém um número diferente de PI, calculada a partir de um total de 500 células fluorescentes para cada variante em duas repetições biológicas. B. estas imagens são imagens de microscopia fluorescente representativa das variantes de Aβ42-GFP selecionadas (Phe, Ile, Thr, Trp). Eles foram adquiridos sob luz UV usando um filtro de excitação de GFP (450-500 nm) e uma gama de emissão (515-560 nm). A barra de escala representa 10 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 . Regime de fluxo cytometry (FC) análise óf S. cerevisiae células expressando variantes de Aβ42-GFP selecionadas. A. O gráfico mostra células de levedura gated (P1) em lotes do ponto (FSC-A vs CCD-A) onde os detritos da célula é removido da população celular. As imagens microscópicas de Gln (homogeneamente distribuída) e variantes de Ile (PI-formando) são mostradas ao lado que o ponto FC parcelas. A barra de escala representa 10 µm. B. Estas imagens de trama do ponto de dispersão representam GFP-A vs sonda estresse oxidativo no qual a população gated (P3) inclui células apenas fluorescentes, excluindo o sinal de fundo. Os histogramas de frequência de celular são de C. o sinal de GFP (amplitude FITC) condomínio fechado de P1 e D. CellROX (amplitude da APC) condomínio fechado de P3. A aquisição de células foi realizada com um citômetro de fluxo. Cada parcela representa 20.000 eventos. Q e correspondem a Gln e Ile Aβ42 mutantes, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 . Quantificação dos níveis de proteína celular. Esta figura mostra borrões ocidentais das frações da proteína total de mutantes de Aβ42-GFP após 16 h de expressão em S. cerevisiae. As variantes de PI-formando são de cor verde e aqueles distribuídos difusamente no citosol são coloridos na luz vermelha. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 . Estresse oxidativo celular, fluorescência intracelular de GFP e os níveis de proteína celular para mutantes de Aβ42-GFP determinados após 16 h de expressão em S. cerevisiae. As variantes representadas no eixo x têm ordens de acordo com suas propensões de agregação previsto pelo AGGRESCAN (painel esquerdo) ou TANGO (painel direito). As variantes de PI-formando são coloridas em verde e as variantes não-PI-formando são coloridas na luz vermelha. A. B. estes gráficos mostram os valores de fluorescência de sonda de estresse oxidativo obtidos por uma análise FC dos mutantes Aβ42-GFP. C. D. estes gráficos de barras representam os níveis de proteína conforme quantificada por uma análise de densitometria de Western blot utilizando software ImageJ. E. F. estes gráficos mostram os valores de fluorescência de GFP após uma análise FC. As barras de erro para o estresse oxidativo sonda e GFP fluorescência valores representam o coeficiente de variação (CV) das células dependentes de FC. As barras de erro para os níveis de expressão de proteínas representam ± SE (n = 3). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Canal | Fluoróforo | Comprimento de onda de excitação (nm) | Filtro passa-banda |
| FITC | GFP | 488 | 530/30 |
| APC | CellRox | 73T | 660/20 |
| PerCP | IP | 488 | 585/42 |
Tabela 1. Fonte de laser, filtros passa-banda e fluorophores usado no citômetro de fluxo.
| Fluorescência de GFP | CV | CellROX de fluorescência | CV | |
| A | 9316 | 96,4 | 1964 | 127,5 |
| C | 9709 | 91,9 | 1275 | 172.2 |
| D | 11213 | 101,7 | 3443 | 155.8 |
| E | 12256 | 101.1 | 3220 | 152.2 |
| F | 3010 | 96,1 | 1245 | 146.4 |
| G | 11541 | 97,2 | 2947 | 158 |
| H | 7895 | 98,2 | 3582 | 120.8 |
| Eu | 7365 | 97,2 | 1416 | 141,3 |
| K | 10839 | 100,4 | 3102 | 122.1 |
| L | 7605 | 96,9 | 1401 | 161,8 |
| M | 8149 | 96 | 1308 | 170.4 |
| N | 12741 | 97,5 | 3403 | 134.9 |
| P | 9768 | 102,8 | 2629 | 143.6 |
| Q | 13066 | 91,3 | 3354 | 169,9 |
| R | 8537 | 101.3 | 2839 | 127,5 |
| S | 12053 | 99,1 | 3313 | 174.3 |
| T | 10615 | 97,7 | 2213 | 107.7 |
| V | 9169 | 96,1 | 1878 | 121.7 |
| W | 1715 | 94,7 | 1531 | 100 |
| Y | 7574 | 94.5 | 1234 | 138 |
Tabela 2. Lista de valores para fluorescência de GFP e fluorescência de sonda de estresse oxidativo obtidos pela análise FC de células de levedura, expressando GFP-Aβ42 mutantes para 16 h. Esta tabela mostra a intensidade de fluorescência média (IFM) e o CV para cada mutante.
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Discussion
Uma ampla gama de doenças está ligada ao acúmulo de misfolded proteínas em depósitos celulares6,7,8,33. Muitos esforços foram feitos para desvendar os mecanismos moleculares que desencadeiam o aparecimento destas doenças usando abordagens computacionais, que não levam em concentrações de proteína de conta, ou em vitro se aproxima, em que a concentração de proteína mantém-se constante durante a reação. No entanto, dentro da célula, as proteínas são constantemente sintetizadas e degradadas em um ambiente lotado e não homogéneo. Isto explica as frequentes discrepâncias entre no silico, in vitro e na vivo Propriedades de agregação de proteínas amiloidogénicos.
Há várias razões por que modelos de celulares simples, tais como leveduras, são uma escolha razoável para estudar a agregação e associada a toxicidade de proteínas relacionadas a doenças neurodegenerativas, em um contexto mais biológico. Por exemplo, dão-na possibilidade de analisar o impacto de agregação misfolding de proteína em uma população celular intacta usando análises rápidas como o implementado aqui. No entanto, devemos considerar que os níveis oxidativos podem variar entre cepas de leveduras. Assim, para comparar entre cepas, ou mesmo entre proteínas diferentes, oxidantes e redutores, tais como TDT e diamina, devem ser usados para estabelecer uma escala de oxidação/redução.
No exemplo ilustrado neste artigo, a análise de bioinformatic, quantificação de proteína celular, imagem latente de localização de proteínas e análise simultânea de FC de atividade GFP e os níveis de estresse oxidativo foram integrados para identificar o molecular espécie responsável para os danos oxidativos eliciado reações de agregação da proteína. Os resultados demonstram que as variantes de Aβ42 mais solúveis, em vez da agregação-propenso, promover o maior estresse oxidativo. Isso aponta para a espécie diffusible, sendo o mais perigoso para a espécie Aβ42 vivo em. A baixa toxicidade de agregação variantes parece responder ao fato de que estas conformações são sequestradas em PI e a sua degradação preferencial através da maquinaria de qualidade de proteína, resultando em níveis mais baixos de proteína do que a de seus solúvel homólogos.
O método descrito não é limitado à análise do estresse oxidativo produzido por espécies de Aβ42 agregados/solúvel e também pode ser aplicado para estudar uma variedade de transtornos de proteínas de agregação. Além disso, a técnica pode ser útil para monitorar o efeito dos inibidores de agregação sobre estresse oxidativo celular, permitindo para descartar para novas aplicações clínicas aquelas moléculas que promovem a acumulação de espécies oxidativo proteína ativa. Finalmente, como uma sonda fluorogenic é disponível, a abordagem oferece oportunidades notáveis para identificar a espécie molecular responsável por outros efeitos tóxicos ligados a agregação da proteína em um rápido uma maneira fácil, fornecendo dados quantitativos.
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Acknowledgments
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast cells BY4741 | ATCC | 201388 | Genotype: MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 |
| pESC(-Ura) plasmid | Agilent Genomics | 217454 | Yeast expression plasmid with a Gal promotor. Selectable marker URA3 |
| Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements | Sigma | Y1501 | Powder |
| Yeast Nitrogen Base Without Amino Acids | Sigma | Y0626 | Powder |
| Raffinose | Sigma | R7630 | Powder |
| Glucose | Sigma | G7021 | Powder |
| Galactose | Sigma | G0750 | Powder |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3991 | Solution 10X |
| CellROX Deep Red Reagent | Life Technologies | C10422 | Free radical cell-permeant fluorescent sensor, non-fluorescent while in a reduced state, and exhibits bright fluorescence upon oxidation by reactive oxygen species (ROS), with absorption/emission maxima at 644/665 nm. |
| Y-PER protein extraction reagent | Thermo Scientific | 78990 | Liquid cell lysis buffer |
| Acrylamide/Bis-acrylamide | Sigma | A6050 | Solution |
| Bradford dye reagent | Bio-Rad | 5000205 | Dye reagent for one-step determination of protein concentration |
| β-amyloid antibody 6E10 | BioLegend | 803001 | Mouse IgG1. The epitope lies within amino acids 3-8 of beta amyloid (EFRHDS). |
| Goat anti-mouse IgG-HRP conjugate | Bio-Rad | 1721011 | |
| Membrane Immobilon-P, PVDF | Millipore | IPVH00010 | |
| Luminata forte | Merk | WBLUF0100 | Premixed, ready to use chemiluminescent HRP detection reagent |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride solution (PMSF) | Sigma | 93482 | Protease inhibitor. Dissolved at 0.1 M in ethanol |
| FACSCanto flow cytometer | BD Biosciences | 657338 | Equipped with a 488 nm blue laser for the detection of GFP, and 635 nm red laser / 530/30 nm BP filter and 660/20 BP filter |
| Mini Trans-Blot Electrophoresis Transfer cell | Bio-Rad | 1703930 | Protein transference system |
| Mini-PROTEAN Tetra Handcast Systems | Bio-Rad | 1658000FC | Electrophoresis system |
References
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