Summary
تجميع البروتين يتسبب الأكسدة الخلوية. ويصف هذا البروتوكول وسيلة لرصد الدول داخل الخلايا من البروتينات أميلويدوجينيك والأكسدة المرتبطة بها، باستخدام التدفق الخلوي. يتم استخدام النهج لدراسة سلوك المتغيرات القابلة للذوبان والمعرضة للتجميع من الببتيد اميلويد بيتا.
Abstract
تم المتعلقة بالبروتين ميسفولدينج والتجميع في والتشكلات اميلويد إلى ظهور وتطور العديد من الأمراض الأعصاب. ومع ذلك، لا يزال هناك القليل من المعلومات حول بروتين غير قابل للذوبان كيف تمارس المجاميع التأثيرات السمية في فيفو. بسيطة بدائية وحقيقية النواة نموذج الكائنات، مثل البكتيريا والخميرة، ساهمت إلى حد كبير فهمنا الحالي للآليات وراء تشكيل اميلويد داخل الخلايا وإكثار المجاميع، وسمية. في هذا البروتوكول، وهو وصف استخدام الخميرة كنموذج تشريح العلاقة بين تشكيل المجاميع البروتين وأثرها على الأكسدة الخلوية. الأسلوب يجمع بين الكشف عن الدولة القابلة للذوبان أو تجميعها داخل الخلايا بروتين أميلويدوجينيك مع التقدير الكمي للأضرار الأكسدة الخلوية الناتجة عن التعبير عن استخدام التدفق الخلوي (FC). وهذا النهج بسيطة وسريعة، والكمية. وتوضح الدراسة التقنية طريق مضاهاة الأكسدة الخلوية الناتجة عن مجموعة كبيرة من بيتا اميلويد الببتيد المتغيرات مع ميول التجميع الجوهرية الخاصة بهم.
Introduction
بروتيوستاسيس هو أحد المحددات أساسية لخلية عمليات الشيخوخة واللياقة البدنية. في الخلايا، والمحافظة على التوازن البروتين بمراقبة جودة البروتين المتطورة شبكات تهدف إلى ضمان ريفولدينج الصحيح لتجمعات من البروتين كونفورميرس بمرافقين و/أو بهم proteolysis المستهدفة مع عدة آليات مصانة جيدا1 ،،من23،،من45. عدد كبير من الدراسات تقديم الدعم إلى الارتباط بين ظهور وتقدم مجموعة واسعة من الأمراض التي تصيب الإنسان وفشل بروتيوستاسيس، مما يؤدي إلى ميسفولدينج البروتين والتجميع. على سبيل المثال، وجود رواسب البروتين يعتبر علامة مميزة مرضية للعديد من اضطرابات الأعصاب، مثل الزهايمر، باركنسون، وهنتنغتون الأمراض6،7،8، أمراض بريونوجينيك، وأميلويدوسيس غير التنكسية9. يقترح أن أوائل الجمعيات أوليجوميريك وبروتوفيبريلار في رد فعل التجميع هي اليسيتورس الرئيسية من سيتوتوكسيسيتي، إقامة التفاعلات الشاذة مع غيرها من البروتينات في الوسط الخلوي مزدحمة10. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن ينتقل البروتين تضمينات (PI) بين الخلايا، ونشر11،التأثير السمي على12. ولذلك، يمكن أن يكون أن تشكيل بي قد تشكل في الواقع إليه ديتوكسيفينغ يقيد وجود الأنواع الخطرة المجمعة إلى مواقع محددة في الخلية، حيث يمكن معالجتها أو المتراكمة دون الآثار الجانبية الرئيسية 13 , 14.
القياسية في المختبر النهج البيوكيميائية قدمت أفكاراً هامة في مختلف الأنواع التي تعيش على تجميع ردود الفعل وعلى خصائص15،16. بيد أن الظروف المستخدمة في هذه الاختبارات بوضوح تختلف عن تلك التي تحدث داخل الخلية، والسؤال التالي، أهميتها الفسيولوجية. بسبب حفظ ملحوظة من المسارات الخلوية مثل مراقبة جودة البروتين، أوتوفاجي، أو تنظيم17،الدولة الأكسدة الخلوية18 بين حقيقيات النوى19،20،21 ،،من2223، برز مهدها الخميرة Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) كنموذج خلوية بسيطة متميز لدراسة محددات الجزيئية لتجميع البروتين وآثارها السامة للخلايا المرتبطة بها في البيئات ذات الصلة بيولوجيا24،،من2526.
الميل تجميع البروتين سمة ترميز أصلاً في التسلسل الرئيسي. وهكذا، يمكن التنبؤ تشكيل هياكل مثل اميلويد استناداً إلى تحديد وتقييم الفاعلية لتعزيز تجميع المناطق البروتينية27. ومع ذلك، رغم نجاح خوارزميات بيوينفورماتيك للتنبؤ بخصائص التجميع في المختبر لتسلسل البروتين، هم لا تزال أبعد ما تكون عن التنبؤ بكيفية ترجمة هذه الميول في فيفو تأثير السامة للخلايا. قد تساعد الدراسات التي تتناول العلاقة بين الدولة مجمعة بروتين معين وعن الأضرار الخلوية المرتبطة بها بطريقة منهجية للالتفاف حول هذا القيد الحسابي. تناولت هذه الدراسة، مع استفادة مجموعة كبيرة من المتغيرات من بيتا اميلويد الببتيد Aβ42 متباينة في رواسب واحد فقط، ولكن عرض نطاق متواصل من تجميع المزيف في فيفو28هذا الاتصال. على وجه الخصوص، يرد وصف لنهج القائم على التيسير لتحديد الأنواع conformational المحاسبة لأضرار الأكسدة بالبروتينات المعرضة للتجميع في خلايا الخميرة. المنهجية التي توفر العديد من المزايا مثل البساطة والقدرة الإنتاجية العالية، والقياس الكمي الدقيق. مكن هذا النهج لتأكيد أن تلعب بي بدور وقائي ضد الأكسدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-الثقافات S. cerevisiae والتعبير البروتين
ملاحظة: متغيرات Aβ يحمل المزيف التجميع نسبية مختلفة بسبب طفرة في رواسب واحدة في موقف الببتيد Aβ42 (الشكل 1A) 19 (Phe19). هذه المتغيرات الببتيد الموسومة بالبروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل)، الذي يعمل ك مراسل (الشكل 1) تجميع29.
- تحويل والبلازميدات الترميز للمتغيرات Aβ42-بروتينات فلورية خضراء 20 في خلايا الخميرة مع BY4741 خلفية أبوية (ماتا له3Δ1 لوي2Δ0 التقى15Δ0 ura3Δ0)30. بلازميد كل ترميز للمسخ Aβ42 تنصهر للتجارة والنقل برابط جسجسج. البلازميدات pESC(-URA) وتشمل علامة التحديد URA329.
- إعداد متوسطة كاملة الاصطناعية دون اليوراسيل (SC-اتفاق جولة أوروغواي) مع المكونات التالية: 1.9 غرام/لتر النيتروجين الخميرة قاعدة دون اليوراسيل و 5 غرام/لتر كبريتات الأمونيوم 900 مل ddH2س جنبا إلى جنب مع 100 مل السكر 20% (w/v).
- وضع مستعمرة واحدة من خلايا الخميرة المحولة إلى 20 مل المتوسط SC-اتفاق جولة أوروغواي الذي يحتوي على 2% جلوكوز وتنمو الثقافات بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية تحت الانفعالات 210 لفة في الدقيقة.
- في اليوم التالي، تنمو الثقافات خلايا الخميرة الجديدة بتطعيم 100 ميليلتر للثقافة بين عشية وضحاها إلى 5 مل من الطازجة SC-أورا المتوسطة.
- في OD590 0.5، الطرد المركزي الثقافات في ز س 3,000 لمدة 4 دقائق وتجاهل المادة طافية وريسوسبيند الخلايا في نفس الحجم من المتوسطة SC-أورا الطازجة التي تحتوي على رافينوسي 2%.
- احتضان عند 30 درجة مئوية تحت الانفعالات 210 لفة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة. ثم الطرد المركزي الخلايا في 3,000 غ س ل 4 دقيقة وتجاهل المادة طافية. ريسوسبيند الخلايا في المتوسطة SC-أورا الطازجة التي تحتوي على اللبن 2% للحث على تعبير البروتين المؤتلف.
- بعد 16 ساعة من حمل التعبير البروتين في مقرر اتفاقية استكهولم--أورا المتوسطة التي تحتوي على اللبن 2%، الحصاد 1 مل الخلايا المستحثة في أنابيب ميكروسينتريفوجي العقيمة بالطرد المركزي في 3,000 ز س لمدة 4 دقائق.
ملاحظة: تحدث الاختلافات الأكثر صلة بالموضوع بعد فترة التعريفي لخلايا الخميرة تسبب حاء 16 التعبير عن المتغيرات Aβ42-التجارة والنقل يمكن تصور بالأسفار الفحص المجهري لتحديد توزيع المؤتلف البروتين داخل الخلايا (الشكل 2).
2-خلية تلطيخ
ملاحظة: الخلايا المستحثة بغير جديدة مطلوبة كعنصر تحكم سلبية لتحديد عتبة فلورسنت أثناء تحليل FC.
- خلايا الخميرة التي يسببها ح 16 وتحديد كثافتها الضوئية في 590 نانومتر (OD590). تمييع لهم في الملحية فوسفات عقيمة مخزنة (PBS) ل التطوير التنظيمي590 من 0.1.
- إعداد 1 × المالحة الفوسفات مخزنة على النحو التالي: أضف 8 جم من كلوريد الصوديوم، 0.2 جم بوكل، ز 1.44 غ2هبو4، وملء 0.24 ز خ2ص4 إلى 800 مل ddH2سين الحل ما يصل إلى 1 لتر من ddH2س بعد ضبط ال pH إلى 7.4 مع HCl. تصفية المخزن المؤقت عن طريق فلتر 0.2 ميكرون.
- نقل تعليق خلية وإذ تعرب عن أنابيب مناسب المسمى (12 × 75 مم مستديرة القاع البوليستيرين) وحمايتهم من الضوء. تأكد من أنهم على استعداد ليتم تحميلها على سيتوميتير تدفق للتحليل، جنبا إلى جنب مع الخلايا المستحثة بغير وغير الملون.
- إضافة المسبار الأكسدة (مثلاً، سيلروكس الأحمر العميق) لكل عينة في تركيز نهائي من 5 ميكرومتر واحتضان الخلايا عند 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في الظلام.
- بعد الحضانة، تغسل الخلايا 3 مرات مع 1 x PBS وريسوسبيند لهم في نفس حجم المخزن المؤقت قبل التحليل بنادي.
3-التدفق الخلوي التحليل
ملاحظة: استخدام إعداد FC أشعة الليزر المناسبة ومرشحات، والكشف عن بروتينات فلورية خضراء والأكسدة مسبار fluorescence إشارة. يمكن استخدام سيتوميتير تدفق مجهزة 488 نانومتر أزرق ليزر للكشف عن بروتينات فلورية خضراء وليزر نانومتر أحمر 635 للكشف عن الأكسدة مسبار الأسفار. يتم الحصول على انبعاث الأسفار للتجارة والنقل، ومسبار الأكسدة مع عامل تصفية 530/30 نانومتر BP وعامل تصفية شركة بريتيش بتروليوم 660/20، على التوالي (الجدول 1).
- انقر فوق فتح لوحة ورقة عمل جديدة وخلق المؤامرات دوت اقتناء التالية.
- حدد أداة مؤامرة مبعثر من شريط الأدوات وإنشاء مؤامرة مع المتغيرات الجانب مبعثر-المنطقة (SSC-أ) على المحور الصادي مقابل مبعثر ناحية الأمام (منتدى التعاون الأمني-أ) في مقياس خطي على المحور س.
- انقر فوق مبعثر مؤامرة أداة من شريط الأدوات وخلق مؤامرة مع المتغيرات FL1-منطقة (فيتك) على المحور ص. FL3-منطقة (APC) في مقياس لوغاريتمي على المحور ص.
- انقر فوق رمز إعدادات الصكوك . انقر فوق علامة التبويب التعويض وتعيين جميع مستويات التعويض. انقر فوق علامة التبويب اقتناء وحدد عدد إجمالي من 20,000 الأحداث التي سيتم تسجيلها.
- انقر فوق رمز معدل التدفق للتبديل معدل التدفق إلى منخفض.
- انقر فوق علامة التبويب الحصول على بدء تشغيل الخلايا المستحثة بغير، أونستاينيد وضبط الجهد في إعدادات صك من الأمام والجانب المبعثر حتى يتم توزيع السكان في الربع السفلي الأيمن الأوسط.
- انقر على أيقونة مضلع تعيين منطقة R1 حول السكان الخلية باستثناء خلية الحطام، واستخدام هذه الفئة من السكان بوابة P1 = R1 لجميع المؤامرات نقطة مضيئة وتمثيلات الرسم البياني (الشكل 3).
- لضبط الجهد PMT إشارة الأسفار، تشغيل الخلايا أونستاينيد في المؤامرة دوت FL1-FL3، ضبط المكاسب في التبويب إعداد الصك ، حتى يتم توزيع الخلايا في الربع الأيسر السفلي.
- تغيير العينة في الخلايا المستحثة لقياس fluorescence التجارة والنقل. في التبويب إعداد الصك ، تعيين المكسب في منتدى التعاون الأمني، مقابل FL1 (فيتك) عندما يتم توزيع السكان في الربع الأيسر السفلي. تعريف السكان خلية إيجابي مع بوابة (بوابة P2).
- تغيير العينة لعدم فعل الملون الخلايا لعرض الأكسدة بالأسفار في مؤامرة دوت FL3 (APC) منتدى التعاون الأمني مقابل . ضبط المكاسب حتى يتم توزيع السكان خلية في الربع العلوي الأيسر. بوابة سكان الخلية إيجابية P3.
- جعل قطعتي الرسم البياني مع الرمز المدرج التكراري لتمثيل fluorescence الخلية. لتمثيل شدة الأسفار، تأكد من FL1 (فيتك) تمثل الأسفار بروتينات فلورية خضراء في المحور س، و FL3 (APC) تمثل الأسفار في المحور الصادي، تطبيق السكان P2 و P3 في مقياس لوغاريتمي، على التوالي.
ملاحظة: الرسم البياني تراكبات طريقة جيدة لتوضيح الاختلافات بين ملفات تعريف صف خلايا معربا عن متغيرات Aβ المختلفة.
4-المؤتلف البروتين إيمونوديتيكشن
- لتحديد مستويات التعبير البروتين، حصاد ثقافات الخميرة الناجمة عن الطرد المركزي في س 4,000 ز 6 دقيقة عن ح 16، وتخزين الكريات الخلية في-80 درجة مئوية.
- ريسوسبيند الخلايا المجمعة معربا عن البروتين المؤتلف ح 16 في برنامج تلفزيوني. إعداد 200 تعليق خلية ميليلتر من كل متحولة Aβ42-التجارة والنقل ل التطوير التنظيمي590 من 20.
- لتحليل الكسر البروتين الكلي، حصد 100 ميليلتر من كل متحولة بالطرد المركزي في س 14,000 ز لمدة 20 دقيقة وريسوسبيند الكريات خلية في نفس حجم المخزن المؤقت لتحلل الخميرة Y-الواحدة (50 مم تريس-HCl pH 8.0، 1% [دمس]، 200 ملم كلوريد الصوديوم، يدتا 1 ملم تحتوي على 10 ملغ/مل SB3-14 (myr سولفوبيتيني إيستيل) وتستكمل مع فلوريد فينيلميثيلسولفونيل 1 مم (بمسف)).
- احتضان العينات عن 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة تحت الانفعالات معتدل.
- تحديد تركيز استخراج البروتين باستخدام مقايسة برادفورد. تحميل تصل إلى 5 ميكروغرام لاستخراج البروتين من كل عينة على جل التفريد الحزب الديمقراطي الصربي صفحة الاكريلاميد 15% ووصمة عار على غشاء ثنائي الفلوريد (PVDF) الفينيليدن في 100 الخامس لمدة 60 دقيقة.
- إعداد برادفورد حله في 50 مل إيثانول 95% كاشف مع 100 مغ G-250 "أخذ الأزرق الرائعة" وإضافة 100 مل حامض الفوسفوريك 85% (w/v). ثم، عندما يتم حل الصبغة تماما، تمييع المخلوط مع ddH2س إلى 1 لتر وتصفيته من خلال ورق الترشيح السيليلوز فقط قبل استخدام.
ملاحظة: الكاشف برادفورد وينبغي أن يكون الضوء براون. - إعداد معيار ألبومين المصل البقري (BSA) تتراوح ما بين 5-100 ميكروغرام من البروتين في ميليلتر 1,000 للكاشف برادفورد.
- إضافة 1-10 ميليلتر بروتين استخراج إلى 1 مل الكاشف برادفورد واحتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
- قياس امتصاص المعايير واستخراج عينات في التطوير التنظيمي595من البروتين.
- للتحليل، وجعل مؤامرة مع امتصاص القيم التي تم الحصول عليها للمعايير مقابل. ميكروغرام بروتين. اعتماداً على المنحنى المعياري، تحديد تركيزات عينات الأصلي من كمية البروتين، نظراً لحجم وتمييع، أن وجدت.
- إعداد برادفورد حله في 50 مل إيثانول 95% كاشف مع 100 مغ G-250 "أخذ الأزرق الرائعة" وإضافة 100 مل حامض الفوسفوريك 85% (w/v). ثم، عندما يتم حل الصبغة تماما، تمييع المخلوط مع ddH2س إلى 1 لتر وتصفيته من خلال ورق الترشيح السيليلوز فقط قبل استخدام.
- شطف الغشاء مع 1 × تريس مخزنة المالحة (تبس)، 0.1% 20 توين (تتبس)، وحظر استخدام اللبن المجفف الخالي 5% (w/v) في 1 x TTBS.
- لتحضير 1 لتر 10 x TBS، حل ز 24 من قاعدة تريس و 88 جرام من كلوريد الصوديوم في 900 مل ح2سدد وضبط درجة الحموضة إلى 7.6. إضافة ddH2س إلى وحدة تخزين نهائي للأم 1 لحل 1 x، مزيج الجزء 1 من 10 x الأسهم مع 9 أجزاء من ddH2o.
- احتضان الغشاء ح 1 مع 1:1,000 6E10 تضعف جسم بيتا-اميلويد الأولية، وعن ح 1 في درجة حرارة الغرفة مع عنزة جسم ثانوية تضعف الماوس المضادة مفتش HRP المتقارن 01:10، 000.
- وضع 1 مل كاشف فلوري لوميناتا باستخدام الأغشية وتحديد نطاقات بتحليل دينسيتوميتريك كما هو موضح في الخطوة 5، 2.
5-بيانات التحليل
- لتحليل البيانات التي تم الحصول عليها من لجنة التيسير، إنشاء جدول عرض متوسط كثافة الفلورسنت (MFI) والأسفار الوسيط مع الخطأ القياسي الخاص به المطابق و/أو معامل التباين (CV) للأسفار بروتينات فلورية خضراء ومستويات الأكسدة.
- انقر فوق علامة التبويب المفتش والرمز الإحصاءات لتخصيص البيانات الإحصائية المطلوبة لكل قناة.
ملاحظة: عند مقارنة المتغيرات البروتين، تحويل بيانات القيم الأسفار إلى خلفية أكثر من إضعاف أو القرار متري (RD):
في هذا المقياس، متوسط العينة هو الأسفار يعني المشكلة عينات مراقبة يعني fluorescence متوسط الخلايا المستخدمة كعنصر تحكم و SD هو الانحراف المعياري للأسفار يعني. عامل RD مؤشر أكثر دقة من قيمة مؤسسة مونتانيار، فإنه ليس فقط بحساب الفرق بين العينات ولكن أيضا حسابات لنشر البيانات. هذا الحساب على وجه التحديد ذات الصلة عند مقارنة البيانات الواردة من مختلف التجارب التي نفذت على مر الزمن. مرة واحدة قد حسبت طلقة، المستحسن استخدام الاختبار الإحصائي لتأكيد أهمية الاختلافات الملحوظة بين الخيارين البروتين.
- انقر فوق علامة التبويب المفتش والرمز الإحصاءات لتخصيص البيانات الإحصائية المطلوبة لكل قناة.
- للبروتين إيمونوديتيكشن، قياس مستويات البروتين المؤتلف بوصمة عار الغربية باستخدام البرمجيات إيماجيج.
- قبل تحليل قياس كثافة، تحويل الصور الخام الأصلي للغشاء نمواً في وضع اللون الرمادي وتنسيق ملف JPEG.
- ضبط المقطع تعيين قياسات القائمة تحليل تعني قيمة الرمادي.
- انقر فوق الأداة مستطيل من إيماجيج وتعريف منطقة الاهتمام (ROI) بحجم متسقة لتحليل قياس كثافة الفرقة. مركز كل الفرقة على صورة غشاء داخل إطار مستطيل تم إنشاؤه وسجل القياس واحداً تلو الآخر باستخدام Ctrl + M (الأمر القياس).
- قياس الخلفية المحلية المجاورة لكل الفرقة، وتطبيق نفس المنطقة العائد على الاستثمار. بعد القياس، طرح الخلفية المحلية المناظرة من كل الفرقة الفردية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويصف هذا البروتوكول كيفية توظيف مجموعة من المتغيرات 20 من الببتيد Aβ42 حيث قد تم تحور Phe19 إلى جميع الأحماض الأمينية الطبيعية قائمة28. يمكن تحليل ميول التراكم النظري لهذه البروتينات باستخدام اثنين من خوارزميات مختلفة بيوينفورماتيك (أجريسكان ورقصة التانغو من31،32). وفي كلتا الحالتين، يجعل هذا التحليل تدريجي تدرج الميول التجميع، يرجع، كقاعدة عامة، القيم القصوى للمخلفات مسعور وأقل منها مشحونة والقطبية (الشكل 1B، ج 1).
لتعقب تجريبيا الدولة التجميع داخل الخلايا لمتغيرات Aβ42 المختلفة، يتطلب التجربة وصف تحول بلازميد، الترميز ل Aβ42 وتنصهر للتجارة والنقل (الشكل 1A) تحت سيطرة GAL1 اللبن إيندوسيبلي، إلى S. cerevisiae. يمكن تصور خلايا الخميرة معربا عن المتغيرات Aβ42 بعد فترة الاستقراء من ح 16 تحت مجهر الأسفار. هذا التصور يجعل من الممكن لتأكيد تشكيل PI في 10 من 20 من المتغيرات من مجموعة تم تحليلها. يختلف عدد وحجم المجاميع الفلورسنت من متغير إلى متغير (الشكل 2). ويبين الشكل 2A الكمي PI من مجموعة من الخلايا 500 في كل من الثقافتين مستقلة. وهنا يمكن أن نلاحظ أن توقع اتفاقية ممتازة بين و في فيفو خصائص التجميع.
لمعالجة ما إذا كان يمكن أن يؤدي تشكيل المجاميع البروتين الأكسدة في هذا النظام خلية نموذج، يستخدم هذا البروتوكول FC لرصد الأسفار بروتينات فلورية خضراء الخلوية إلى جانب الأسفار المسبار فلوروجينيك كمؤشر للأكسجين التفاعلية إنتاج الأنواع (روس). الشكل 3 يوضح الإجراء والحصول على نتائج لطفرات جلن وايل، التي تتوافق مع متغيرات Aβ42 البلوتينيوم الموزعة وتشكيل بي، على التوالي.
أولاً، السكان خلية تحليل المبوب (P1) في النقطة SSC-أ من منتدى التعاون الأمني مقابل الأرض لإزالة المخلفات الخلية من التحليل (الشكل 3A). يمثل إشارة الأسفار للتجارة والنقل مقابل مسبار الأكسدة السكان P1 في الرسوم البيانية الأرض دوت فيها هي بوابات الخلايا الفلورية الخضراء في P3 (الشكل 3B). 3 الشكل و 3D عرض الرسوم البيانية التي تم إنشاؤها للحصول على بيانات إحصائية لكل متغير المعرب عنها، بما في ذلك السيرة الذاتية (الجدول 2)، بغية تحديد حجم الوسط والأسفار الوسطية لكل علامة نيون.
ويتوقع جميع طفرات أعرب عن نفس المستويات نظراً لأنهما يختلفان في واحد من الأحماض الأمينية (0.02 في المائة تسلسل Aβ42-التجارة والنقل). ومع ذلك، إليه بروتيوستاسيس يمكن الاستجابة بطريقة تفاضلية إلى ميول التجميع الخاصة بهم. ولذلك، كمياً مستويات التعبير البروتين في مقتطفات الخلوي استخدام جسم Aβ محددة (الشكل 4). ونحن نرى، كاتجاه عام، متغيرات Aβ42 تشكيل PI موجودة في مستويات أدنى من تلك التي تبقى البلوتينيوم الموزعة في سيتوسول.
يمكن ملاحظة الاختلافات الهامة بين الخيارين Aβ42 عند بهم الأسفار مسبار الأكسدة ومستويات البروتين وخصائص fluorescence بروتينات فلورية خضراء تمثل بالنسبة إلى قدرتها على تشكيل بي وبهم ميول التجميع مضمنة ( الشكل 5). أكثر تجميع المعرضة لاستخلاص المتغيرات تشكيل PI كثير الأكسدة أقل من نظرائهم أكثر قابل للذوبان (الشكل 5A، 5B). مع هذه النتائج، هناك أي ارتباط واضح بين الحجم وعدد المجاميع كل خلية فردية (الشكل 2)، ومستويات الأكسدة. تشكيل PI المتغيرات، لا سيما طفرات تحمل الحزب والفنيل ألانين في موقف 19، موجودة في الخلية عند مستويات أدنى من تلك التي وزعت المتجانسة في سيتوسول (الشكل 5، 5 د). الاستثناء لهذا هو المسخ Thr، التي تشكل أقل من 10% الخلايا بي (الشكل 1B، ج 1). وهذا يتوافق مع حقيقة أن المتغيرات الأكثر تعرضا للتجميع يتم مسح بشكل انتقائي بمراقبة جودة الخميرة تدهور الآلات28. بروتينات فلورية خضراء الأسفار ومستويات البروتين ترتبط جيدا لأشكال Aβ42 أكثر قابل للذوبان، ولكن ليس لأولئك تشكيل PI (الشكل 5E، 5F). وهذا على الأرجح لأن في هؤلاء السكان الخلوية، ويأتي الأسفار من اثنين من الأقسام المختلفة وفي سيتوسول وتضمينات، ومساهماتها النسبية في صف الإجمالي تختلف بين طفرات34.
الشكل 1 . تحليل الميل التجميع لجمع Aβ42-التجارة والنقل بنيات الانصهار مستمدة من طفرة بقايا في موقف 19 في الببتيد Aβ42 بجميع الأحماض الأمينية الطبيعية. أ. تظهر هذه الصورة نموذج ثلاثي الأبعاد من wt تنصهر Aβ42 للتجارة والنقل برابط (Aβ42, الرمادي؛ بروتينات فلورية خضراء، خضراء)، استناداً إلى 1EMA PDB للبروتينات الفلورية الخضراء من فيكتوريا أيكووريا و 2OTK للزهايمر Aβ الببتيد التي سلسلة الجانب Phe19 wt Aβ42 يظهر باللون الأحمر. يتم إنشاء النموذج باستخدام البرمجيات بيمول. بقايا 19 في تسلسل Aβ42 تحتل موقعا مركزياً في وسط الكتلة مسعور. يتم إنشاء الرسوم البيانية بار مع اثنين بيوينفورماتيك مختلفة تنبئ: ب. أجريسكان، ج. التانغو. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 . في الخيارين Aβ42-PI بروتينات فلورية خضراء-تشكيل S. cerevisiae الثقافات التي يسببها ح 16 من التعبير. أ-رسم بياني شريطي يشير إلى النسبة المئوية للخلايا التي تحتوي على عدد مختلف من PI تحسب من مجموع الخلايا الفلورسنت 500 لكل متغير في اثنان replicates البيولوجية. ب. هذه الصور صور مجهرية الفلورسنت الممثل من المتغيرات Aβ42-التجارة والنقل المحدد (الفنيل ألانين، إيل، Thr، الحزب). تم الحصول عليها تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية باستخدام عامل تصفية إثارة للتجارة والنقل (450-500 nm) ونطاق انبعاثات (515-560 نانومتر). يمثل الشريط مقياس 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 . مخطط للتدفق الخلوي (FC) تحليل سو S. cerevisiae الخلايا معربا عن المتغيرات Aβ42-التجارة والنقل المحدد. أ. ويبين الرسم البياني خلايا الخميرة المبوب (P1) في مؤامرات دوت (منتدى التعاون الأمني، مقابل SSC-أ) حيث تتم إزالة المخلفات الخلية من السكان خلية. تظهر الصور المجهرية جلن (توزع البلوتينيوم) والمتغيرات إيل (تشكيل PI) بعد ذلك إلى مؤامرات دوت FC. شريط مقياس يمثل 10 ميكرون. ب. وتمثل هذه الصور الأرض دوت مبعثر بروتينات فلورية خضراء-أ مقابل الأكسدة المسبار الذي يشمل السكان المبوب (ف-3) الخلايا فقط الفلورسنت، باستثناء الإشارة الخلفية. رسوم بيانية تردد الخلية من ج. بروتينات فلورية خضراء الإشارة (مطال فيتك) بوابات من P1 ود. سيلروكس (السعة APC) بوابات من P3. وأجرى اقتناء خلية مع سيتوميتير تدفق. ويمثل كل الأرض 20,000 الأحداث. Q وأنا تناظر طفرات جلن وايل Aβ42، على التوالي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 . التحديد الكمي لمستويات البروتين الخلوي. هذا الرقم يظهر البقع الغربية من الكسور البروتين الكلي من طفرات Aβ42-التجارة والنقل بعد 16 ساعة تعبير في S. cerevisiae. المتغيرات تشكيل PI هي الملونة باللون الأخضر وتلك التي تصطبغ الموزعة في سيتوسول الملونة في الضوء الأحمر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 . الأكسدة الخلوية والأسفار بروتينات فلورية خضراء داخل الخلايا، ومستويات البروتين الخلوي لطفرات Aβ42-بروتينات فلورية خضراء تحدد بعد 16 ساعة تعبير في سيريفيسيا س. المتغيرات الممثلة على المحور السيني صدرت وفقا لميول التجميع توقع بهم التانغو (اللوحة اليمنى) أو أجريسكان (اللوحة اليمنى). المتغيرات تشكيل PI هي الملونة باللون الأخضر والمتغيرات-PI التشكيل غير الملونة في الضوء الأحمر. أ. ب-إظهار هذه الرسوم البيانية بار القيم الأسفار مسبار الأكسدة التي حصل عليها تحليل FC طفرات Aβ42-التجارة والنقل. ج. د-تمثل هذه الرسوم البيانية بار مستويات البروتين كمياً بتحليل لطخة غربية قياس كثافة استخدام البرمجيات إيماجيج. ﻫ. و-إظهار هذه الرسوم البيانية بار القيم fluorescence بروتينات فلورية خضراء بعد تحليل FC. أشرطة الخطأ للأكسدة التحقيق، وتمثل القيم fluorescence بروتينات فلورية خضراء معامل التباين (CV) من الخلايا عن طريق بوابة نادي. أشرطة الخطأ لمستويات التعبير البروتين تمثل ± سراج الدين (n = 3). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| قناة | فلوروفوري | الإثارة الطول الموجي (نانومتر) | مرشح تمرير النطاق |
| فيتك | بروتينات فلورية خضراء | 488 | 530/30 |
| آسيا والمحيط الهادئ | سيلروكس | 635 | 660/20 |
| بيركب | الملكية الفكرية | 488 | 585/42 |
الجدول 1. مصدر الليزر، ومرشحات تمرير الفرقة، وفلوروفوريس المستخدمة في تدفق سيتوميتير.
| الأسفار بروتينات فلورية خضراء | السيرة الذاتية | ومضان سيلروكس | السيرة الذاتية | |
| A | 9316 | 96.4 | 1964 | 127.5 |
| ج | 9709 | 91.9 | 1275 | 172.2 |
| د | 11213 | 101.7 | 3443 | 155.8 |
| ه | 12256 | 101.1 | 3220 | 152.2 |
| و | 3010 | 96.1 | 1245 | 146.4 |
| ز | 11541 | 97.2 | 2947 | 158 |
| ح | 7895 | 98.2 | 3582 | 120.8 |
| أنا | 7365 | 97.2 | 1416 | 141.3 |
| ك | 10839 | 100.4 | 3102 | 122.1 |
| L | 7605 | 96.9 | 1401 | 161.8 |
| M | 8149 | 96 | 1308 | 170.4 |
| N | 12741 | 97.5 | 3403 | 134.9 |
| ف | 9768 | 102.8 | 2629 | 143.6 |
| Q | 13066 | 91.3 | 3354 | 169.9 |
| R | 8537 | 101.3 | 2839 | 127.5 |
| S | 12053 | 99.1 | 3313 | 174.3 |
| T | 10615 | 97.7 | 2213 | 107.7 |
| V | 9169 | 96.1 | 1878 | 121.7 |
| W | 1715 | 94.7 | 1531 | 100 |
| Y | 7574 | 94.5 | 1234 | 138 |
الجدول 2- قائمة القيم للأسفار بروتينات فلورية خضراء والأكسدة مسبار الأسفار التي حصل عليها نادي تحليل خلايا الخميرة معربا عن طفرات Aβ42-التجارة والنقل حاء 16 هذا الجدول يبين كثافة fluorescence يعني (MFI) والسيرة الذاتية لكل المسخ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
مجموعة واسعة من أمراض ترتبط بتراكم البروتينات تجمعات في الرواسب الخلوية6،،من78،33. وقد بذلت جهود كثيرة لكشف الآليات الجزيئية التي تؤدي إلى ظهور هذه الأمراض باستخدام النهج الحسابية التي لا تأخذ بعين الاعتبار تركيزات البروتين، أو في المختبر النهج، الذي تركيز البروتين تبقى ثابتة أثناء عملية التفاعل. ومع ذلك، داخل الخلية، البروتينات باستمرار تصنيعه والتدهور في بيئة مزدحمة وغير متجانسة. وهذا ما يفسر التناقضات متكررة بين خصائص التجميع في السيليكون، في المختبر، و في فيفو البروتينات أميلويدوجينيك.
وهناك أسباب متعددة لماذا يتم اختيار معقول لدراسة التجميع النماذج الخلوية البسيطة، مثل الخميرة، والمرتبطة سمية بروتينات التي تتصل بأمراض الأعصاب في سياق بيولوجية أكثر. على سبيل المثال، أنها تعطينا إمكانية لتحليل أثر تجميع البروتين ميسفولدينج على سكان خلوية سليمة باستخدام تحليلات سريعة مثل تلك التي نفذت هنا. ومع ذلك، ينبغي أن ننظر في أن مستويات الأكسدة قد تختلف بين سلالات الخميرة. وهكذا، مقارنة بين السلالات، أو حتى بين البروتينات المختلفة، التأكسد وتاشيب، مثل DTT ودياميني، ينبغي استخدام لإنشاء مقياس/الحد من أكسدة.
في المثال المبين في هذه المادة، بيوينفورماتيك التحليل الكمي البروتين الخلوي، أدمجت البروتين التعريب التصوير والتحليل FC المتزامن لنشاط التجارة والنقل، ومستويات الأكسدة للتعرف الجزيئية الأنواع المسؤولة عن الضرر التأكسدي أثارت ردود الفعل تجميع البروتين. النتائج تثبت أن الخيارين Aβ42 القابلة للذوبان أكثر، بدلاً من أكثر تجميع المعرضة، تعزيز الأكسدة أعلى. وهذا يشير إلى الأنواع diffusible يجري الأنواع Aβ42 أكثر خطورة في فيفو. سمية أقل من تجميع المتغيرات ويبدو أن الاستجابة لحقيقة أن هذه والتشكلات هي المحتبس في PI تدهورها التفضيلية به الآلية نوعية البروتين، ونتج عنه انخفاض مستويات البروتين مقارنة بتلك القابلة للذوبان النظراء.
الأسلوب الموصوفة لا يقتصر على تحليل الأكسدة التي تنتجها الأنواع Aβ42 المجمعة/قابل للذوبان ويمكن تطبيقها أيضا على دراسة مجموعة متنوعة من الاضطرابات تجميع البروتين. وعلاوة على ذلك، قد يكون التقنية مفيدة لرصد تأثير مثبطات التجميع على الأكسدة الخلوية، مما يسمح لتجاهل تلك الجزيئات التي تشجع تراكم البروتين النشط مؤكسد الأنواع للمزيد من التطبيقات السريرية. أخيرا، ما دامت تتوفر تحقيق فلوروجينيك، يقدم النهج فرصاً رائعة لتحديد الأنواع الجزيئية المسؤولة عن التأثيرات السمية الأخرى المرتبطة بتجميع البروتين في سريعة طريقة سهلة، توفير البيانات الكمية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast cells BY4741 | ATCC | 201388 | Genotype: MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 |
| pESC(-Ura) plasmid | Agilent Genomics | 217454 | Yeast expression plasmid with a Gal promotor. Selectable marker URA3 |
| Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements | Sigma | Y1501 | Powder |
| Yeast Nitrogen Base Without Amino Acids | Sigma | Y0626 | Powder |
| Raffinose | Sigma | R7630 | Powder |
| Glucose | Sigma | G7021 | Powder |
| Galactose | Sigma | G0750 | Powder |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3991 | Solution 10X |
| CellROX Deep Red Reagent | Life Technologies | C10422 | Free radical cell-permeant fluorescent sensor, non-fluorescent while in a reduced state, and exhibits bright fluorescence upon oxidation by reactive oxygen species (ROS), with absorption/emission maxima at 644/665 nm. |
| Y-PER protein extraction reagent | Thermo Scientific | 78990 | Liquid cell lysis buffer |
| Acrylamide/Bis-acrylamide | Sigma | A6050 | Solution |
| Bradford dye reagent | Bio-Rad | 5000205 | Dye reagent for one-step determination of protein concentration |
| β-amyloid antibody 6E10 | BioLegend | 803001 | Mouse IgG1. The epitope lies within amino acids 3-8 of beta amyloid (EFRHDS). |
| Goat anti-mouse IgG-HRP conjugate | Bio-Rad | 1721011 | |
| Membrane Immobilon-P, PVDF | Millipore | IPVH00010 | |
| Luminata forte | Merk | WBLUF0100 | Premixed, ready to use chemiluminescent HRP detection reagent |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride solution (PMSF) | Sigma | 93482 | Protease inhibitor. Dissolved at 0.1 M in ethanol |
| FACSCanto flow cytometer | BD Biosciences | 657338 | Equipped with a 488 nm blue laser for the detection of GFP, and 635 nm red laser / 530/30 nm BP filter and 660/20 BP filter |
| Mini Trans-Blot Electrophoresis Transfer cell | Bio-Rad | 1703930 | Protein transference system |
| Mini-PROTEAN Tetra Handcast Systems | Bio-Rad | 1658000FC | Electrophoresis system |
References
- Frydman, J. Folding of newly translated proteins in vivo: the role of molecular chaperones. Annual Review of Biochemistry. 70, 603-647 (2001).
- Hartl, F. U., Bracher, A., Hayer-Hartl, M. Molecular chaperones in protein folding and proteostasis. Nature. 475, 324-332 (2011).
- Wong, E., et al. Molecular determinants of selective clearance of protein inclusions by autophagy. Nature Communications. 3, (2012).
- Winkler, J., Tyedmers, J., Bukau, B., Mogk, A. Chaperone networks in protein disaggregation and prion propagation. Journal of Structural Biology. 179, 152-160 (2012).
- Glickman, M. H., Ciechanover, A. The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway: destruction for the sake of construction. Physiological Reviews. 82, 373-428 (2002).
- Dobson, C. M. Getting out of shape. Nature. 418, 729-730 (2002).
- Chiti, F., Dobson, C. M. Protein misfolding, functional amyloid, and human disease. Annual Review of Biochemistry. 75, 333-366 (2006).
- Aguzzi, A., O'Connor, T. Protein aggregation diseases: pathogenicity and therapeutic perspectives. Nature Reviews Drug Discovery. 9, 237-248 (2010).
- Rapezzi, C., et al. Transthyretin-related amyloidoses and the heart: a clinical overview. Nature Reviews Cardiology. 7, 398-408 (2010).
- Deas, E., et al. Alpha-synuclein oligomers interact with metal ions to induce oxidative stress and neuronal death in Parkinson's disease. Antioxidants & Redox Signaling. 24, 376-391 (2016).
- Brundin, P., Melki, R., Kopito, R. Prion-like transmission of protein aggregates in neurodegenerative diseases. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 301-307 (2010).
- Frost, B., Diamond, M. I.
- Arrasate, M., Mitra, S., Schweitzer, E. S., Segal, M. R., Finkbeiner, S. Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and the risk of neuronal death. Nature. 431, 805-810 (2004).
- Ross, C. A., Poirier, M. A. Opinion: what is the role of protein aggregation in neurodegeneration? Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 891-898 (2005).
- Mishra, R., Sjölander, D., Hammarström, P. Spectroscopic characterization of diverse amyloid fibrils in vitro by the fluorescent dye Nile red. Molecular BioSystems. 7, 1232-1240 (2011).
- Klunk, W. E., Jacob, R. F., Mason, R. P. Quantifying amyloid by congo red spectral shift assay. Methods in Enzymology. 309, 285-305 (1999).
- Khurana, V., Lindquist, S. Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: why cook with baker's yeast? Nature Reviews Neuroscience. 11, 436-449 (2010).
- Tenreiro, S., Outeiro, T. F. Simple is good: yeast models of neurodegeneration. FEMS Yeast Research. 10, 970-979 (2010).
- Moosavi, B., Mousavi, B., Macreadie, I. G. Yeast model of amyloid-β and Tau aggregation in Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 47, 9-16 (2015).
- Tenreiro, S., Munder, M. C., Alberti, S., Outeiro, T. F. Harnessing the power of yeast to unravel the molecular basis of neurodegeneration. Journal of Neurochemistry. 127, 438-452 (2013).
- Yang, J., Hao, X., Cao, X., Liu, B., Nyström, T. Spatial sequestration and detoxification of huntingtin by the ribosome quality control complex. eLife. 5, (2016).
- Braun, R. J., Büttner, S., Ring, J., Kroemer, G., Madeo, F. Nervous yeast: modeling neurotoxic cell death. Trends in Biochemical Sciences. 35, 135-144 (2010).
- Figley, M. D., Gitler, A. D. Yeast genetic screen reveals novel therapeutic strategy for ALS. Rare Diseases. 1, e24420 (2013).
- Cooper, A. A., et al. Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models. Science. 313, 324-328 (2006).
- Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. A yeast TDP-43 proteinopathy model: exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 6439-6444 (2008).
- Bharathi, V., et al. Use of ade1 and ade2 mutations for development of a versatile red/white color assay of amyloid-induced oxidative stress in saccharomyces cerevisiae. Yeast. 33, 607-620 (2016).
- Pallarès, I., Ventura, S. Advances in the prediction of protein aggregation propensity. Current Medicinal Chemistry. , (2017).
- Villar-Piqué, A., Ventura, S. Protein aggregation propensity is a crucial determinant of intracellular inclusion formation and quality control degradation. Biochimica et Biophysica Acta. 1833, 2714-2724 (2013).
- Navarro, S., Villar-Piqué, A., Ventura, S. Selection against toxic aggregation-prone protein sequences in bacteria. Biochimica et Biophysica Acta. 1843, 866-874 (2014).
- Morell, M., de Groot, N. S., Vendrell, J., Avilés, F. X., Ventura, S. Linking amyloid protein aggregation and yeast survival. Molecular BioSystems. 7, 1121-1128 (2011).
- Conchillo-Solé, O., et al. AGGRESCAN: a server for the prediction and evaluation of "hot spots" of aggregation in polypeptides. BMC Bioinformatics. 8, 65 (2007).
- Fernandez-Escamilla, A. M., Rousseau, F., Schymkowitz, J., Serrano, L. Prediction of sequence-dependent and mutational effects on the aggregation of peptides and proteins. Nature Biotechnology. 22, 1302-1306 (2004).
- Renner, M., Melki, R. Protein aggregation and prionopathies. Pathologie Biologie.(Paris). 62, 162-168 (2014).
- Carija, A., Navarro, S., de Groot, N. S., Ventura, S. Protein aggregation into insoluble deposits protects from oxidative stress. Redox Biology. 12, 699-711 (2017).
