खमीर में सेलुलर ऑक्सीडेटिव तनाव पर प्रोटीन एकत्रीकरण के प्रभाव का मूल्यांकन
Summary
प्रोटीन एकत्रीकरण सेलुलर ऑक्सीडेटिव तनाव में लाना । यह प्रोटोकॉल amyloidogenic प्रोटीन के intracellular राज्यों और उनके साथ जुड़े ऑक्सीडेटिव तनाव की निगरानी के लिए एक विधि का वर्णन करता है, प्रवाह cytometry का उपयोग कर । दृष्टिकोण amyloid-β पेप्टाइड के घुलनशील और एकत्रीकरण प्रवण वेरिएंट के व्यवहार का अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है ।
Abstract
प्रोटीन का खुलासा और amyloid अनुरूपता में एकत्रीकरण कई neurodegenerative रोगों की शुरुआत और प्रगति से संबंधित है । हालांकि, वहां अभी भी कैसे अघुलनशील प्रोटीन समुच्चय vivo मेंउनके विषाक्त प्रभाव डालती के बारे में थोड़ी जानकारी है । सरल prokaryotic और eukaryotic मॉडल जीवों, जैसे बैक्टीरिया और खमीर, intracellular amyloid गठन, समुच्चय प्रचार, और विषाक्तता के पीछे तंत्र की हमारी वर्तमान समझ के लिए महत्वपूर्ण योगदान दिया है । इस प्रोटोकॉल में खमीर का उपयोग प्रोटीन समुच्चय के गठन और सेलुलर ऑक्सीडेटिव तनाव पर उनके प्रभाव के बीच संबंधों को काटना करने के लिए एक मॉडल के रूप में वर्णित है । विधि ऑक्सीडेटिव प्रवाह cytometry (एफसी) का उपयोग कर अपनी अभिव्यक्ति से उत्पंन होने वाली क्षति के ठहराव के साथ एक amyloidogenic प्रोटीन के intracellular घुलनशील/एकीकृत राज्य का पता लगाने को जोड़ती है । इस दृष्टिकोण सरल, तेज, और मात्रात्मक है । अध्ययन correlating सेलुलर ऑक्सीडेटिव तनाव amyloid-β पेप्टाइड वेरिएंट का एक बड़ा सेट की वजह से उनके संबंधित आंतरिक एकत्रीकरण की प्रवृत्ति के साथ तकनीक को दिखाता है ।
Introduction
Proteostasis सेल स्वास्थ्य और उंर बढ़ने प्रक्रियाओं के एक मौलिक निर्धारक है । कोशिकाओं में, प्रोटीन homeostasis परिष्कृत प्रोटीन गुणवत्ता नियंत्रण नेटवर्क द्वारा chaperones और/या उनके कई अच्छी तरह से संरक्षित तंत्र 1 के साथ अपने लक्षित प्रोटियोलिसिस द्वारा प्रकट प्रोटीन अनुरूपता के सही खुलासा सुनिश्चित करने के उद्देश्य से बनाए रखा है ,2,3,4,5. अध्ययनों की एक बड़ी संख्या की शुरुआत और मानव रोगों की एक विस्तृत रेंज की प्रगति और proteostasis की विफलता के बीच की कड़ी को समर्थन प्रदान करते हैं, प्रोटीन का खुलासा और एकत्रीकरण के लिए अग्रणी । उदाहरण के लिए, प्रोटीन जमा की उपस्थिति कई neurodegenerative विकारों की एक रोग की पहचान माना जाता है, जैसे अल्जाइमर, पार्किंसंस, और Huntington के रोगों6,7,8, prionogenic रोग, और गैर-अपक्षय amyloidoses9. यह सुझाव दिया गया है कि शीघ्र oligomeric और protofibrillar असेंबलियों में एकत्रीकरण प्रतिक्रिया cytotoxicity के मुख्य रूप से, भीड़ सेलुलर वातावरण10में अन्य प्रोटीन के साथ ंयायपालिका बातचीत की स्थापना कर रहे हैं । इसके अलावा, प्रोटीन समावेशन (PI) कोशिकाओं के बीच संचारित किया जा सकता है, उनके विषाक्त प्रभाव11,12प्रचार । इसलिए, यह हो सकता है कि PI के गठन वास्तव में एक detoxifying तंत्र है कि कोशिका, जहां वे संसाधित किया जा सकता है या प्रमुख साइड इफेक्ट के बिना जमा कर सकते है में विशिष्ट स्थानों के लिए खतरनाक एकत्रित प्रजातियों की उपस्थिति को प्रतिबंधित गठन 13 , 14.
इन विट्रो में मानक जैव रासायनिक दृष्टिकोण विभिंन प्रजातियों कि एकत्रीकरण प्रतिक्रियाओं और उनके गुण15,16आबाद में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान की है । हालांकि, इन परख में इस्तेमाल की शर्तों सेल के भीतर होने वाली उन से स्पष्ट रूप से अलग है और, इसलिए, उनके शारीरिक प्रासंगिकता सवाल । इस तरह के प्रोटीन गुणवत्ता नियंत्रण, autophagy, या सेलुलर redox राज्य के विनियमन के रूप में सेलुलर रास्ते के उल्लेखनीय संरक्षण के कारण17,18 eukaryotes के बीच19,20,21 ,22,23, नवोदित खमीर Saccharomyces cerevisiae (एस cerevisiae) एक विशेषाधिकार प्राप्त सरल सेलुलर मॉडल के रूप में उभरा है प्रोटीन एकत्रीकरण के आणविक निर्धारकों का अध्ययन और इसके जुड़े साइटोटोक्सिक प्रभाव में जैविक रूप से प्रासंगिक वातावरण24,25,26।
प्रोटीन एकत्रीकरण प्रवृत्ति अंतर्निहित प्राथमिक अनुक्रम में इनकोडिंग सुविधा है । इस प्रकार, amyloid संरचनाओं के गठन की पहचान और एकत्रीकरण-polypeptides27में क्षेत्रों को बढ़ावा देने की शक्ति के मूल्यांकन के आधार पर भविष्यवाणी की जा सकती है । हालांकि, bioinformatic एल्गोरिथ्म की सफलता के बावजूद इन विट्रो में प्रोटीन अनुक्रम के एकत्रीकरण गुणों की भविष्यवाणी करने के लिए, वे अभी भी पूर्वानुमान से दूर कर रहे है कैसे इन प्रवृत्तियां vivo साइटोटोक्सिक प्रभाव में अनुवाद में । अध्ययनों से पता है कि एक व्यवस्थित तरीके से एक दिया प्रोटीन और उससे जुड़े सेलुलर क्षति के समग्र राज्य के बीच की कड़ी को संबोधित इस गणना सीमा को दरकिनार मदद कर सकता है । यह कनेक्शन वर्तमान अध्ययन में संबोधित किया है, amyloid के वेरिएंट का एक बड़ा सेट का लाभ ले-β पेप्टाइड aβ ४२ केवल एक ही अवशेषों में भिन्न है, लेकिन vivo28में एकत्रीकरण की एक सतत श्रृंखला प्रदर्शित. विशेष रूप से, एक एफसी-आधारित दृष्टिकोण ऑक्सीडेटिव नुकसान के लिए संरचना की पहचान करने के लिए लेखांकन में एकत्रीकरण-प्रवण प्रोटीन खमीर कोशिकाओं में वर्णित है । कार्यप्रणाली सादगी, उच्च प्रवाह क्षमता, और सटीक मात्रात्मक माप के रूप में कई फायदे प्रदान करता है । इस दृष्टिकोण यह है कि PI ऑक्सीडेटिव तनाव के खिलाफ एक सुरक्षात्मक भूमिका निभा पुष्टि करने के लिए संभव बना दिया ।
Protocol
Representative Results
Discussion
रोगों की एक विस्तृत श्रृंखला सेलुलर जमा6,7,8,३३में प्रगट प्रोटीन के संचय के लिए जुड़ा हुआ है । कई प्रयासों को आणविक तंत्र है कि इन गणना दृष्टिकोण है, जो खात?…
Acknowledgements
Materials
| Yeast cells BY4741 | ATCC | 201388 | Genotype: MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 |
| pESC(-Ura) plasmid | Agilent Genomics | 217454 | Yeast expression plasmid with a Gal promotor. Selectable marker URA3 |
| Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements | Sigma | Y1501 | Powder |
| Yeast Nitrogen Base Without Amino Acids | Sigma | Y0626 | Powder |
| Raffinose | Sigma | R7630 | Powder |
| Glucose | Sigma | G7021 | Powder |
| Galactose | Sigma | G0750 | Powder |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3991 | Solution 10X |
| CellROX Deep Red Reagent | Life Technologies | C10422 | Free radical cell-permeant fluorescent sensor, non-fluorescent while in a reduced state, and exhibits bright fluorescence upon oxidation by reactive oxygen species (ROS), with absorption/emission maxima at 644/665 nm. |
| Y-PER protein extraction reagent | Thermo Scientific | 78990 | Liquid cell lysis buffer |
| Acrylamide/Bis-acrylamide | Sigma | A6050 | Solution |
| Bradford dye reagent | Bio-Rad | 5000205 | Dye reagent for one-step determination of protein concentration |
| β-amyloid antibody 6E10 | BioLegend | 803001 | Mouse IgG1. The epitope lies within amino acids 3-8 of beta amyloid (EFRHDS). |
| Goat anti-mouse IgG-HRP conjugate | Bio-Rad | 1721011 | |
| Membrane Immobilon-P, PVDF | Millipore | IPVH00010 | |
| Luminata forte | Merk | WBLUF0100 | Premixed, ready to use chemiluminescent HRP detection reagent |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride solution (PMSF) | Sigma | 93482 | Protease inhibitor. Dissolved at 0.1 M in ethanol |
| FACSCanto flow cytometer | BD Biosciences | 657338 | Equipped with a 488 nm blue laser for the detection of GFP, and 635 nm red laser / 530/30 nm BP filter and 660/20 BP filter |
| Mini Trans-Blot Electrophoresis Transfer cell | Bio-Rad | 1703930 | Protein transference system |
| Mini-PROTEAN Tetra Handcast Systems | Bio-Rad | 1658000FC | Electrophoresis system |
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