Protein aggregering utløser mobilnettet oksidativt stress. Denne protokollen beskriver en metode for overvåking intracellulær statene amyloidogenic proteiner og oksidativt stress forbundet med dem, ved hjelp av flowcytometri. Tilnærmingen til å studere atferden til løselig og aggregering utsatt varianter av amyloid-β peptid.
Protein misfolding og aggregering i amyloid konformasjonen har vært knyttet til utbruddet og progresjon av flere nevrodegenerative sykdommer. Men det er fortsatt litt informasjon om hvordan uløselig protein aggregater utøve deres toksiske effekter i vivo. Enkel prokaryotic og eukaryotic modell organismer, som bakterier og gjær, har bidratt betydelig til vår nåværende forståelse av mekanismene bak intracellulær amyloid dannelse, aggregater forplantning, og toksisitet. I denne protokollen, er bruk av gjær beskrevet som en modell for å analysere forholdet mellom dannelsen av protein aggregater og deres innvirkning på mobilnettet oksidativt stress. Metoden kombinerer påvisning av intracellulær løselig/samlet status for en amyloidogenic protein med kvantifisering av mobilnettet oksidative skader som følge av sitt uttrykk ved hjelp av flowcytometri (FC). Denne tilnærmingen er enkel, rask og kvantitative. Studien viser teknikken ved å samkjøre mobilnettet oksidativt stress forårsaket av et stort sett av amyloid-β peptid varianter med sine respektive iboende samling propensities.
Proteostasis er en grunnleggende determinant av celle helse og aldring prosesser. I celler vedlikeholdes protein homeostase av sofistikert protein kvalitetskontroll nettverk rettet å sikre den riktige refolding av misfolded protein conformers chaperones og/eller deres målrettede proteolyse med flere godt bevarte mekanismer1 ,2,3,4,5. En rekke studier gir støtte til koblingen mellom utbruddet og utviklingen av en rekke menneskelige sykdommer og svikt i proteostasis, fører til protein misfolding og aggregering. For eksempel tilstedeværelsen av protein innskudd er ansett som en patologisk kjennetegner mange nevrodegenerative sykdommer, som Alzheimers, Parkinsons, og Huntingtons sykdommer6,7,8, prionogenic sykdommer og ikke-degenerative amyloidoses9. Det har blitt foreslått at tidlig oligomeric og protofibrillar samlinger i samling reaksjonen er de viktigste elicitors av cytotoksisitet, etablere avvikende interaksjoner med andre proteiner i overfylte mobilnettet miljø10. I tillegg kan protein Inneslutninger (PI) overføres mellom celler, spre sine toksisk effekt11,12. Derfor kan det være at dannelsen av PI kan faktisk utgjør en detoxifying mekanisme som begrenser tilstedeværelsen av farlig aggregert arter til bestemte steder i cellen, der de kan behandles eller akkumulert uten store bivirkninger 13 , 14.
Standard i vitro biokjemiske tilnærminger har gitt viktig innsikt i de ulike artene som fyller aggregering reaksjoner og deres egenskaper15,16. Men betingelsene i disse analyser er klart forskjellig fra de som forekommer i cellen, og derfor spørsmålet relevansen fysiologiske. På grunn av kjente bevaring av mobilnettet som protein kvalitetskontroll, autophagy eller regulering av mobilnettet redoks staten17,18 blant eukaryoter19,20,21 ,22,23, spirende gjær Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) har dukket opp som en privilegert enkel mobilnettet modell å studere molekylære determinanter av protein aggregering og tilknyttede cytotoksiske innvirkning på biologisk relevante miljøer24,25,26.
Protein aggregering tilbøyelighet er en funksjon iboende kodet i primære sekvensen. Dermed dannelsen av amyloid-lignende strukturer kan forutsies basert på identifisering og evaluering av styrken på aggregering-fremme regioner i polypeptides27. Men til tross for bioinformatic algoritmer å forutsi egenskapene for aggregering i vitro protein sekvenser, er de fortsatt langt fra prognoser hvordan disse propensities oversette til i vivo cytotoksiske innvirkning. Studier som tar koblingen mellom et bestemt protein aggregert staten og dens tilknyttede cellular skade på en systematisk måte kan bidra til å omgå denne beregningsorientert begrensningen. Denne tilkoblingen behandles i studien, drar nytte av en rekke varianter av amyloid-β peptid Aβ42 forskjellig fra en enkelt rester, men viser en kontinuerlig rekke aggregering propensities i vivo28. Spesielt er en FC-basert tilnærming til til conformational arten regnskap for oksidative skader brakt frem av aggregering utsatt proteiner i gjærceller beskrevet. Metodikken gir mange fordeler som enkelhet, høy gjennomstrømming evne og nøyaktig kvantitativ måling. Dette gjorde det mulig å bekrefte som PI spiller en beskyttende rolle mot oksidativt stress.
En rekke sykdommer knyttet til opphopning av misfolded proteiner i mobilnettet innskudd6,7,8,33. Mange forsøk har vært gjort å rakne molekylære mekanismer som utløser utbruddet av disse sykdommer med computational tilnærminger, som ikke tar hensyn til kontoen protein konsentrasjoner, eller i vitro tilnærminger, som protein konsentrasjonen forblir konstant under reaksjonen. Men i…
Yeast cells BY4741 | ATCC | 201388 | Genotype: MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 |
pESC(-Ura) plasmid | Agilent Genomics | 217454 | Yeast expression plasmid with a Gal promotor. Selectable marker URA3 |
Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements | Sigma | Y1501 | Powder |
Yeast Nitrogen Base Without Amino Acids | Sigma | Y0626 | Powder |
Raffinose | Sigma | R7630 | Powder |
Glucose | Sigma | G7021 | Powder |
Galactose | Sigma | G0750 | Powder |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3991 | Solution 10X |
CellROX Deep Red Reagent | Life Technologies | C10422 | Free radical cell-permeant fluorescent sensor, non-fluorescent while in a reduced state, and exhibits bright fluorescence upon oxidation by reactive oxygen species (ROS), with absorption/emission maxima at 644/665 nm. |
Y-PER protein extraction reagent | Thermo Scientific | 78990 | Liquid cell lysis buffer |
Acrylamide/Bis-acrylamide | Sigma | A6050 | Solution |
Bradford dye reagent | Bio-Rad | 5000205 | Dye reagent for one-step determination of protein concentration |
β-amyloid antibody 6E10 | BioLegend | 803001 | Mouse IgG1. The epitope lies within amino acids 3-8 of beta amyloid (EFRHDS). |
Goat anti-mouse IgG-HRP conjugate | Bio-Rad | 1721011 | |
Membrane Immobilon-P, PVDF | Millipore | IPVH00010 | |
Luminata forte | Merk | WBLUF0100 | Premixed, ready to use chemiluminescent HRP detection reagent |
Phenylmethanesulfonyl fluoride solution (PMSF) | Sigma | 93482 | Protease inhibitor. Dissolved at 0.1 M in ethanol |
FACSCanto flow cytometer | BD Biosciences | 657338 | Equipped with a 488 nm blue laser for the detection of GFP, and 635 nm red laser / 530/30 nm BP filter and 660/20 BP filter |
Mini Trans-Blot Electrophoresis Transfer cell | Bio-Rad | 1703930 | Protein transference system |
Mini-PROTEAN Tetra Handcast Systems | Bio-Rad | 1658000FC | Electrophoresis system |