Summary
כאן, אנו מציגים שיטה להנדס את הגנום של C. elegans שימוש CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins ותבניות תיקון התלויים הומולוגיה.
Abstract
חוזר palindromic באופן קבוע interspersed (CRISPR) - CRISPR - באשכולות קשורה חלבון 9 (Cas9) מערכת הגנה החיסון מסתגלת prokaryotic יש כבר גייס בתור כלי רב עוצמה עבור הנדסה מדויקת הגנום האיקריוטים. כאן, אנו מציגים שיטה מהירה ופשוטה באמצעות מדריך בודד chimeric RNAs (sgRNA) ו- CRISPR-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs) עבור הדור יעיל ומדויק של גנומית מוטציות נקודה C. elegans. אנו מתארים צינור בחירת היעד sgRNA, עיצוב התבנית תיקון מכוון הומולוגיה (HDR), CRISPR-Cas9-RNP complexing ו משלוח של אסטרטגיה genotyping המאפשרת זיהוי מהיר ועמיד חיות הערוך בצורה נכונה. הגישה שלנו מאפשרת הדור נתיישב וזיהוי של הנקודה הרצויה גנומית חיות אלא גם מקלה על האיתור של אללים אחרים מורכבים ויאסין כ 4-5 ימים עם יעילות גבוהה, עומס עבודה מופחתת ההקרנה.
Introduction
ההתקדמות הטכנולוגית האחרונות טרנספורמציה באופן קיצוני, האיצו את היכולת בדיוק מהנדס הגנום. בפרט, המערכת CRISPR-Cas9, אשר מסתמך על endonuclease מונחה RNA Cas9 לזירוז הפסקה גדיל כפול (DSB) ליד הרצף היעד עניין, בהרחבה שימש לתכנן במדויק את הגנום של רוב האורגניזמים מודל בשימוש מחקר ביו1,2,3,4. באופן משמעותי, השימוש CRISPR-Cas9 נעול הגנום עריכה אפילו במינים קשה כמו C. elegans5. בין המינים, יצירת מוטציות נקודה עם הגנום CRISPR-Cas9 המבוסס על מערכת עריכה מתבסס על שלושה רכיבים מרכזיים: 1) Cas9 endonuclease, 2) RNA מדריך יחיד (sgRNA) שמנתב את Cas9 endonuclease רצף המטרה ולאחר 3) משתמש מעוצב תבנית תיקון מכוון הומולוגיה (HDR) המכילה את edit(s) הרצוי של הריבית2.
ישנן מספר שיטות שבהן ניתן להשתמש כדי להציג את sgRNA ואת Cas9 מיקוד נוקלאז לתוך תאים כולל פלסמיד, RNA נגיפי המבוסס על משלוח שיטות6. לאחרונה, מסירה ישירה של טרום-ומורכבת sgRNA-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs) התפתחה ככלי רב עוצמה ויעיל הגנום CRISPR-Cas9 מבוססי עריכה7. מסירה ישירה של טרום-ומורכבת RNPs CRISPR-Cas9 יש מספר יתרונות ברורים, כלומר: 1) RNPs לעקוף את הצורך הסלולר תמלול, תרגום, 2) RNPs נמחקים במהירות, אשר עשוי להגדיל ירידה לפרטים על-ידי הפחתת הזמן הפנוי את המטרה המחשוף ו- 3) RNPs מכילים גורמים זרים אין DNA/RNA אשר עוקף המבוא של רצפים שאינם ילידי לתוך הגנום מארח באמצעות שילוב אקראי. יחד, סביר תכונות אלה מספקות פרץ קצר של--יעד CRISPR עריכה תוך מזעור תופעות את המטרה.
אנו מתארים פרוטוקול פשוט ויעיל עבור שינויים בייעודי לאתר גנומית C. elegans. פרוטוקול זה כולל מיקוד sgRNA oligonucleotide תקועים יחיד (ssODN) HDR תבנית, sgRNA-Cas9 RNP complexing ו משלוח, ועיצוב אסטרטגיה genotyping לצורך זיהוי חד משמעי של חיות ערוכה כראוי. באמצעות אסטרטגיה זו, לא רק השינויים הרצויים בייעודי לאתר ניתן לשחזר, אבל גם עשוי להיות התאושש מוטציות ויאסין שאינם ספציפיים אחרים. לפיכך, האסטרטגיה שלנו מאפשרת את הדור של סדרות allelic באמצעות אסטרטגיה אחת, שם הן מונו-allelic, דו-allelic, ויאסין מוטציות יכול להיווצר דור1 F.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל טיפול בבעלי חיים והתהליכים ניסיוני בעקבות המנחה של מכוני הבריאות הלאומיים ואת טיפול בעלי חיים מוסדיים שימוש הוועדה (IACUC) ב אוניברסיטת מישיגן. להשתמש בפתרונות נטולת RNase, פיפטה טיפים לאורך כל הפרוטוקול. לנקות את אזור העבודה פיפטות, צינורות, צנטריפוגה עם פתרון טיהור RNase לבצע את ההנחיות יצרן (ראה טבלת חומרים).
1. sgRNA בחירת היעד
- באמצעות דפדפן אינטרנט, פתח את דף האינטרנט: http://crispor.tefor.net8
- קלט ~ 60 בסיסים (bp) של רצף איגוף ערוך הרצוי של עניין (כלומר 30 bp 5' ו 3' של עריכה הרצוי).
- בחר את הגנום Caenorhabditis elegans מתוך התפריט הנפתח.
- בחר את מוטיב סמוך Protospacer (20 bp-הגולה - SpCas9, SpCas9-HF1, eSPCas9 1.1) מתוך התפריט הנפתח.
- לחץ על שלח. בדף התוצאות, לבחור את רצף המטרה מדורגת העליון הקרוב ערוך עניין. אם אין אתרי יעד מתאים תוך איגוף 60 bp לרצף הקלט, להרחיב את רצף שאילתה ל-100 bp (כלומר 50 bp צדי הרצוי עריכה).
- ממקור זמין, למשל synthego, להשיג sgRNA יעד של 20-מר עם המפרט הבא: 3 nmol; אין לערוך שינויים.
- עם קבלת, צנטריפוגה sgRNA lyophilized המכילה צינור-> g 12,000 x עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר. הוסף µL 60 של טה נטולת נוקלאז הצינור ולאחר בעדינות להשעות מחדש על-ידי pipetting למעלה ולמטה 15 - 20 פעמים באמצעות פיפטה P200. הריכוז הסופי הוא 50 מיקרומטר.
2. הומולוגיה מכוון לתיקון תבנית עיצוב
- עיצוב של ssODN HDR תבנית המכילה: 1) מוטציה של הריבית, 2) אתר ייחודי endonuclease הגבלה במסגרת, 3) מוטציה שקטה של אחת או שתיהן Gs בתוך הרצף הגולה פאם והזרועות 4) 50 bp 5' ו 3' הומולוגיה איגוף המוטציה הראשונה והאחרונה. (איור 1C) 9 , 10.
- אם המוטציה של הרצף פאם הגולה אינו אפשרי, להציג 5-6 מוטציות שקטות בתוך הרצף sgRNA זיהוי המטרה למנוע בתיווך sgRNA המחשוף של התבנית HDR ssODN.
- ממקור זמין, למשל idtdna, להשיג "oligonucleotide Ultramer DNA" עם הפרמטרים הבאים: קנה מידה: 4 nmol; ניסוח: כלום; טיהור: Desalting רגיל.
- עם קבלת, צנטריפוגה ssODN lyophilized המכילה צינור-> g 12,000 x עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר. בעדינות מחדש להשעות ssODN כדי ריכוז סופי של 100 מיקרומטר ddH נטולת נוקלאז2O על ידי pipetting למעלה ולמטה 15 - 20 פעמים באמצעות פיפטה P200.
3. עיצוב Genotyping תחל
- עיצוב פריימר להגדיר איגוף השינוי הגנום לייצר ~ 400-700 bp PCR אמפליקון11.
- למטב את תנאי הרכיבה PCR כדי לייצר אמפליקון יחיד, מדויקת11.
4. מכינים תערובת הזרקה
- צנטריפוגה ריאגנטים טבלה 1 -מהירות מירבית למשך 2 דקות ב 4 º C.
- לפי הסדר הרשום, להוסיף טבלה 1 ריאגנטים צינור PCR נוקלאז-חופשית.
- לערבב ביסודיות על ידי בעדינות pipetting למעלה ולמטה 10 פעמים עם P20 פיפטה.
- דגירה הזרקת מיקס 10 דקות בטמפרטורת החדר.
5. הזרקת פרוטוקול
- עומס הזרקת micropipette עם חצי אחד של הזריקה לערבב12. שמור שנותרו לערבב הזרקת במקרה שהמחט הזרקת שסותם או שובר.
- לשבור עצה micropipette כך p.s.i. ~ 20-30 מייצרת פתרון זורם12הדרגתית.
הערה: טיפים בקוטר גדול יותר באופן שלילי משפיעים על בריאות בעלי חיים ולא להקטין F1 רומא התשואה. - להזריק 10-15 צעירים תולעים בוגרות בשני הידיים האשכים במידת האפשר12. אם לא, הזרקה לתוך זרוע האשכים אחת מספיקה.
- לאפשר מוזרק לבעלי חיים (P0) להתאושש במשך 1-2 h בטמפרטורת החדר בצלחת מדיה (NGM) נמטודות צמיחה מתחילה OP50 35 מ מ. לאחר מכן, יחיד מוזרק P0 לבעלי צלחות NGM בודדים מתחילה OP50 35 מ"מ באמצעות תולעת חוט פלטינה לבחור12.
6. צלחות0 המסך P ו- s1יחיד mCherry(+) F
- יומיים לאחר זריקה, לזהות P0 הצלחות המכיל F1 רומא לבטא mCherry ב הלוע באמצעות stereomicroscope של פלורסנט (איור 1D, יום 2 - 3). בחרו 3 P0 לוחות המכילים את רוב mCherry(+) F1 בעלי החיים.
- מכל שלוש נבחרות P0 הצלחות, יחידה 8-12 mCherry(+) F1 חיות בסך 24-36-mCherry(+) F-1-s באמצעות תולעת לבחור (איור 1D, יום 2 - 3).
הערה: חיות mCherry(-) יכול גם שיוציאו מן הלוחיות P0 , אך ההסתברות של זיהוי כראוי נערך חיות הרבה נמוך (איור 2 א). - לאפשר בודדים s1F self-fertilize, להטיל ביצים במשך 1-2 ימים בטמפרטורת החדר.
7. יחיד תולעת PCR ו- Genotyping
- לאחר 1-2 ימי להטלת ביצים, להעביר את ה-F1s לתוך בודדים PCR רצועת צינור כמוסות המכילות µL 7 תולעת פירוק המאגר באמצעות איסוף תולעת (טבלה 2, איור 1D, ביום 4-5).
- צנטריפוגה המבחנות במהירות המרבית עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר, כדי להביא חיות לתחתית הצינור, ומקפיאים צינורות ב-80 מעלות צלזיוס עבור 1 h.
הערה: תולעים ניתן לאחסן ב- 80 ° C ללא הגבלת זמן. - Lyse תולעים קפואות thermocycler באמצעות התוכנית הבאה: 60 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות, 95 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, להחזיק 4 ° C.
- הגדרת ה-PCR mastermix כפי שמוצג בטבלה3.
- להוסיף µL 21 של PCR mastermix המבחנות נקי, ולאחר מכן להוסיף 4 µL של תולעת פירוק משלב 3. מערבבים היטב בעזרת פיפטה ולהפעיל PCR התוכנית לבצע את ההנחיות יצרנים (ראה טבלת חומרים).
- לטהר תגובות PCR באמצעות ערכת ה-DNA נקי ולהתרכז, ביצוע ההוראות היצרן (ראה טבלת חומרים). Elute DNA על-ידי הוספת 10 µL מים על העמודה ספין.
- הגדרת אנזים הגבלה mastermix כפי שמוצג בטבלה4.
- להוסיף 10 µL של mastermix אנזים הגבלה כל התגובה PCR נקי, תקופת דגירה של 1-2 h ב- 37 ° C13.
- נפרדים מתעכל PCR מוצרים ב- 1.5% agarose ג'ל לרוץ במהירות 120 V באמצעות 1 x טריס-אצטט-EDTA (טה) מאגר14.
8. זיהוי ואימות רצף של חיות הערוך
- לבחון דגימות אנזים מתעכל לנוכחות של להקות להצביע על פוטנציאל נערך חיות14 (איור 1D, ביום 4-5).
הערה: טען פקד N2 לזהות מוטציות ויאסין פוטנציאליים אשר יכול להיות שנצפו כמו משמרות במידה ו/או עיכול אנזים הגבלה בלתי צפויים ומורכבים פסים דפוסי. - לאחר זיהוי חיות שנערכו פוטנציאליים, להשתמש את µL 3 הנותרים של תולעת פירוק וחזור על התגובה ה-PCR. אסור לנקות או אנזים הגבלה לעכל את תגובת ה-PCR בסיום התוכנית. לטעון את תגובת ה-PCR על ג'ל agarose 1%, נפרד ולחלץ את הלהקה באמצעות ערכת חילוץ ג'ל15 (ראה טבלת חומרים).
- סנגר רצף16 הג'ל מופק הדנ א באמצעות ומהצמיגים F1 כדי לזהות חיות הערוך בצורה נכונה (איור 1 א')
הערה: Heterozygote קריאות יכיל בשכבות פסגות בשל נוכחותם של הסוג הפרוע ומתוכננים אלל. - כדי לקבל חיות homozygous מחיות מאומת משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים הערוך, יחידה 8-12 F2 חיות ולבצע שלבים 7-8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מוטציות בגן האנושי סופראוקסיד דיסמוטאז 1 (SOD1) בחשבון של משפחתית נוירודגנרטיביות, מחלה ניווניות הרסנית שמוביל תמיד לשיתוק ומוות17~ 10-20%. סופראוקסיד דיסמוטאז אנושי-1 הוא חלבון שנשמרת אבולוציונית שיתוף דמיון זהות ו- 70%-55% עם החלבון השתילות-1 C. elegans (איור 1B). כדי להדגים את הפשטות, כדאיות ויעילות של הגישה מבוססת-CRISPR-Cas9 RNP, שסימנו את הגן C. elegans השתילות-1 כדי להציג את הגרסה הקשורים למחלה G93A האנושי הגנום תולעת (איור 1 א').
להנדס את המוטציה G93A הגנום C. elegans , sgRNA נבחר אתר זיהוי של מי פאם יושבת 3 bp במעלה הזרם של codon G93 (איור 1C). עיצבנו את ssODN HDR תיקון תבנית המכילה: שינויים נוקלאוטיד 1) כדי להמיר את codon G93 A93 (GCA לשממ יניינעל ילבולגה דרשמה), 2) שינוי שקט. פאם הגולה רצף (CGG חטיבתי) כדי למנוע sgRNA Cas9-בתיווך המחשוף של תבנית HDR, 3) מוטציה שקטה (CT) את זה מציג אתר ייחודי של אנזים ההגבלה HindIII genotyping, 4) 50 bp 5' ו 3' הומולוגיה זרועות (איור 1C). ערכה פריימר PCR (F1-R1) תוכנן לייצר 592 bp PCR מוצר אחד בפקדים N2 (איור 1 א'). שילוב זריקה המכילה את sgRNA, Cas9, ssODN, של פלסמיד סמן פלורסנט (pCFJ90) היו מעורבבים יחד, מודגרות 10 דקות בטמפרטורת החדר, נטען פיפטה microinjection.
איור 1D מתארת את זרימת העבודה לאחר המיקס הזרקת נטענת של הזרקת micropipette. ביום 0, 10-15 P0 חיות הוזרקו בזרועותיו באחת או בשתי בלוטת המין באמצעות של טכניקה סטנדרטי microinjection18,19. חיות מוזרק במשך 1-2 h התאושש ואז מצופים בנפרד על צלחות NGM מתחילה OP50. לאחר 2-3 ימים, מוצלחת P0 זריקות זוהו על ידי אלה שיש להם mCherry(+) F1 רומא. הלוחות0 3 P העליון (כלומר אלה שיש להם את המספר הגדול ביותר של s1mCherry(+) F) נבחרו לאחר מכן ניתוח. מכל אלה שלוש צלחות (P0-8, P0ל-10, P0-12), 8 mCherry(+) F1s היו בחרה ללוחות NGM בודדים מתחילה OP50 35 מ"מ בסך 24 mCherry(+) F1s. לאחר 2-3 ימים של כנס (ביום 4 - 5), ה-s1F בודדים היו מועברים לתוך המבחנות המכילות מאגר פירוק תולעת, קפוא במשך 1 h ב- 80 ° c לאחר מכן, ה-F1s היו lysed לשחרר דנ א גנומי, נתון ה-PCR. המוצרים PCR היו לאחר מכן מטוהרים מתעכל עם HindIII עבור 1 h ו לרוץ על 1.5% agarose ג'ל כדי לזהות פוטנציאל נערך חיות. בבעלי חיים הערוך בצורה נכונה, עיכול HindIII חותך את המוצר PCR באורך מלא (592 bp) לתוך שתי להקות של 370 bp ו- 222 bp. אסטרטגיה זו genotyping חד משמעית מבדיל היטב בין פראי-סוג (592 bp), heterozygote (592, 370, 222 bp) ו homozygote (370, 222 bp) בעלי חיים. איור 2A ממחיש את התוצאות genotyping למען החיות mCherry(+) 24 שעות ביממה.
כדי להדגים סמן mCherry פלורסנט מעשיר ולשנותן הגנום, בחרנו גם חיות mCherry(-) 8 מכל הלוחות0 3 P. של 24 mCherry(+) F1s מוקרן (בר אדום), הכיל 10 השינוי מונו-allelic או דו-allelic (42%), 10 היו פראי סוג (42%), 3 היו indels פוטנציאליים (13%), היה כשל PCR 1 (איור 2 א). לעומת זאת, של s124 mCherry(-) F מוקרן, חיה רק 1 היה שונה בצורה נכונה (4%); ואילו, 23 היו פראי סוג (96%) (איור 2 א). איור 2B מראה chromatogram מן באורך מלא ג'ל PCR שחולצו המוצר (נ18-6), הממחיש השינויים נוקלאוטיד מדויק מעוצב בתבנית HDR ssODN סופחו בנאמנות לתוך הגנום של F homozygous הזה 1 חיים. ראוי לציין, חיות1 F 10-7, 10-8 ו- 12-3 הציג לא צפוי מידות המוצר PCR ודפוסי הגבלת תקציר סימון, רומז שהחיות האלה יכול לשאת ויאסין מורכבים מוטציות (איור 2 א). לכן, השיטה שלנו הוא לא רק מסוגל לייצר הרצוי הגנום modification(s) עם נוחות, יעילות, אמינות, אלא גם מאפשר את זיהוי ושחזור של אללים ויאסין ייחודיים העשויים לשפוך תובנה ג'ין פונקציה חשובה ובלתי צפויה.
איור 1 . CRISPR-Cas9 הנדסה של C. elegansהשתילות-1 לוקוס. (א) איור סכמטי המתאר את מבנה אקסון-אינטרון מיקומה השתילות-1 C. elegans. הבר אדום מציין המיקום של G93 ב אקסון 3. ערכת זוג פריימר יצויין על ידי החיצים האדומים (F1-R1). (B) רצף יישור של האדם וחלבונים השתילות-1 C. elegans (worm). השאריות G93 יישוב מסומן באדום. (ג) העליון, מקטע של DNA גנומי המקיפים את codon G93 מוצג כהפניה, פאם (ירוק) ואתרי יעד (כחול) sgRNA מודגשים. התחתון, הומולוגיה oligonucleotide תקועים יחיד (ssODN) ביים תבנית תיקון (HDR) מוצג המכיל: ערוך codon שינוי G93 A93, שינוי שקט המוטיב פאם כדי למנוע ביקוע על ידי המלון sgRNA-Cas9, שנה שקט להציג את אתר אנזים ההגבלה HindIII ייחודי (תיבת צהוב), איגוף 5' ו- 3' 50 bp הומולוגיה זרועות (קווים שחורים). כל נוקלאוטיד שינויים בעיצוב של ssODN הם המסומן אדום. (ד) איור סכמטי של הצינור עבור יצירת וזיהוי מוטציות נקודה מבוסס-RNP CRISPR-Cas9. ביום 0, להזריק 10-15 P0 חיות במיקס הזרקה. יום 2-3, לזהות בהצלחה מוזרק P0 בעלי-חיים על-ידי אלה המכילים פלורסנט F1 רומא, ובחר P שלוש צלחות0 עם הוא צאצא ביותר פלורסנט. מכל הלוחות0 3 P, יחיד 8 פלורסנט F1 רומא. יום 4-5, (א) שלב 1, בודדים F1s בחרה והניח לתוך המבחנות המכילות מאגר פירוק; (ב) שלב 2, לאחר הקפאה ב-80 מעלות צלזיוס, המבחנות המכילות F1 תולעים הן lysed לשחרר את הדנ א, אשר משמש תבנית ה-PCR. המוצרים PCR הם ניקו ואז מתעכל עם האנזים הגבלת ייחודי; (ג) שלב 3, אנזים מתעכל מוצרים אתה נחוש של ג'ל agarose שם פראי סוג (+ / +), משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים (m / +), homozygous (ז/ז) בעלי חיים ניתן לזהות על ידי הגבלת digest פסים דפוסי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 . Genotyping נתונים עבור עשב-1 מוטציות (G93A). (A) ג'ל תמונה של F 1 בעלי חיים שהיו בנפרד lysed, PCRed, מתעכל עם HindIII. עבור כל P0 צלחת (P0-8, P0ל-10, P0-12), נותחו 8 mCherry(+) וחיות1 8 mCherry(-) F. מונו-allelic (מספרים כחול) והן חיות שנערכו דו-allelic (מספרים אדום) נמצאו. גודל מוזז PCR מוצרים או unpredicted HindIII להקות מעוכל נמצאו גם זה מרמז על מוטציות ויאסין (מספרים צהוב). פקדים N2 מוצגים כנקודת התייחסות PCR המוצר אחיזה לשינוי גודל, אנזים ירידה לפרטים. (B) העליון, ריווח codon ותרגומים חומצת אמינו מוצגים לעיל עבור סוג בר (WT), להלן עבור G93A ששינה גדילי. ערוך הרצוי מסומן באמצעות תיבה אדומה, השינויים שקט ליצור אתר ההגבלה HindIII במסגרת מודגש על ידי תיבת צהוב. כל נוקלאוטיד מעוצב שינויים מוצגים בגופן מודגש. התחתונה, נציג chromatogram מן homozygous F1 בעלי חיים 8-6. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| מגיב | נפח | ריכוז סופי |
| ddH2O | 6.3 ΜL | ---- |
| אשלגן כלורי (4 מ) | 0.94 ΜL | 300 מ"מ |
| HEPES (0.5M) pH 7.4 | 0.5 ΜL | 20 מ מ |
| pCFJ90 (25 ng/μL) | 1.25 ΜL | 2.5 ng/μL |
| ssODN (500 ng/μL) | 1.25 ΜL | 50 ng/μL |
| sgRNA (50 μM) | 1.25 ΜL | 5 ΜM |
| Cas9 (61 μM) | 1.03 ΜL | 5 ΜM |
| נפח סופי | 12.5 ΜL | ---- |
טבלה 1. CRISPR-Cas9 RNP הזרקת שילוב. ריאגנטים כל צריך להיות מושעה מחדש ללא נוקלאז ddH2O. RNase טכניקות חינם אמור לשמש בעת טיפול ריאגנטים, בעת ביצוע המיקס הזרקה.
| מגיב | [הסופי] |
| אשלגן כלורי | 50 מ מ |
| טריס-HCl pH 8.3 | 10 מ מ |
| MgCl2 | 2.5 מ מ |
| NP-40 | 0.45% |
| Tween-20 | 0.45% |
| Proteinase K | 1 מ"ג/מ"ל |
בטבלה 2. תולעת פירוק מאגר מתכון. Proteinase K אמור להתווסף טריים לפני כל שימוש.
| מגיב | 1 x | 24 x |
| 2 X ש5 Mastermix | 12.5 ΜL | 300 ΜL |
| פריימר F1 (10 μM) | 1.25 ΜL | 30 ΜL |
| פריימר R1 (10 μM) | 1.25 ΜL | 30 ΜL |
| פירוק תולעת | 4 ΜL | ---- |
| ddH2O | 6 ΜL | 144 ΜL |
| נפח סופי | 25 ΜL | 504 ΜL |
בטבלה 3. Mastermix ה-PCR. Mastermix ה PCR אמור. להיות מעורב היטב על ידי pipetting עד שהתמיסה אחידה. 21 µL של mastermix ה-PCR צריך להתווסף המבחנות נקי, אז להוסיף 4 µL של תולעת lysate צינורות שכותרתו כראוי.
| מגיב | 1 x | 24 x |
| 10 X מאגר אנזים | 2 ΜL | 48 ΜL |
| התגובה PCR נקי | 10 ΜL | ---- |
| ddH2O | 7 ΜL | 168 ΜL |
| אנזים הגבלה (U 10/μL) | 1 ΜL | 24 ΜL |
| נפח סופי | 20 ΜL | 240 ΜL |
בטבלה 4. אנזים הגבלה Mastermix. Mastermix אנזים הגבלה אמור. להיות מעורב היטב על ידי pipetting עד שהתמיסה אחידה. 10 µL של mastermix אנזים הגבלה צריך להתווסף 10 µL של מוצר ה-PCR נקי
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מערכת CRISPR-Cas9 הוא כלי חזק ואפקטיבי בדיוק שינוי הגנום של מודל אורגניזמים. . הנה, נדגים שאת chimeric sgRNAs20 יחד עם ssODN HDR תבניות לזמינה הדור יעילה במיוחד של גנומית מוטציות נקודה C. elegans. חשוב לציין, נדגים כי משלוח RNP מייצרת יעילות העריכה גבוהה כאשר קרינה פלואורסצנטית משמש כסמן בחירה משותף, המדגיש את נוחות ואמינות של הטכניקה.
הרוב המכריע של שיטות CRISPR-Cas9 C. elegans הגנום הנדסה להסתמך על רקע גנטי מסוים או co-CRISPR אסטרטגיות1. בשיטת co-CRISPR הוכיחה להיות כלי שימושי ביותר מגבירה את הסבירות של קבלת פעולת עריכה הגנום מוצלחת. עם זאת, שיטות co-CRISPR דורשים היכרות עם פעולת עריכה לבחירה על-ידי פנוטיפ-לוקוס סמן המעשיר עבור עריכה הגנום של עניין. בעוד רב-עוצמה, היכרות עם מוטציות פנוטיפ מניבי לבחירה עשוי להיות לא רצוי אם המתח כדי לערוך או את המוטציה הנקודה הרצויה עניין עצמו תערוכות פנוטיפים שעשויים להיות הכבידו או ודוכאה על-ידי פנוטיפ סמן. יתר על כן, co-CRISPR אסטרטגיות מחייבים יוצרת מעבר של גדיל כפול נוסף לוקוס סמן שעשויים לתרום אפקטים את המטרה. כאן, אנו מציגים שיטה המשתמשת סמן ניאון ארעית לא רק משמש כדי לזהות בהצלחה מוזרק P0 בעלי-חיים, אך גם מעשיר עבור עריכות הגנום נאותה. הנתונים שלנו להפגין בשיטה זו משמעותית מעשיר לבעלי בהצלחה הערוך בהשוואה ללא-פלורסנט חיות, והוא מספק מספר יתרונות ברורים: 1) רק מיקוד sgRNA בייעודי לאתר זה נדרש, 2) צמצום 5-fold Cas9, ריכוז sgRNA, 3) זן-פנוטיפ-ובחירת העצמאות ו- 4) עומס עבודה ההקרנה נומינלית (~ 24 F1s). חזקים CRISPR-Cas9 הגנום עריכה דור1 F נצפתה בשיטה זו. ראוי לציין, האסטרטגיה מבוססי אנזים זיהוי ה-PCR-הגבלת תיאר מאפשר זיהוי חד משמעי מונו -, דו-allelic חיות שנערכו בקרב הדור1 F. לבסוף, האסטרטגיה genotyping מאפשר זיהוי של מוטציות ויאסין פוטנציאליים, אשר יכול להיות שנצפו כפי PCR הלהקה משתנה כאשר לעומת N2 שולט, כי הם גם לא רגישים תקציר הגבלה או התשואה מורכבים להקות מתי מתעכל.
כניסתו של הדור הבא רצפי יחד עם המאמצים גנומית בקנה מידה גדול הואץ הזיהוי של גרסאות גנומית הפרדת עם מחלת21. עם זאת, בדיקות פונקציונליות של פתוגניות לא הוכחו עבור רוב גרסאות במערכות הסלולר ודגם organismal. במחקר זה, שסימנו הגן השתילות-1 ב- C. elegans להציג את למד נרחב מוטציה ALS-הקשורים השתילות-1G93A . עד כה, מוטציה זו יש כבר המודל ולמד C. elegans ועכברים בעיקר באמצעות ביטוי מהונדס. למרות ביטוי של משתנים במודלים של בעלי חיים יכול לסכם מפתח הסלולר, היבטים התנהגותיים המולקולריים של המחלה, ברור יותר ויותר כי "מנה" היא גורם מקילות בקביעת פנוטיפים22. לדוגמה, העתק גבוהה מספר השתילות-1G93A עכברים נושא ~ 24 עותקים של גן המוטציה השתילות-1 האנושי התערוכה קורס המחלה מאוד מואץ בהשוואה לעכברים השתילות-1G93Adl , הנושאות רק ~ 8-10 עותקים23,24. כאן, אנחנו מוכיחים כי השיטה שלנו CRISPR-Cas9 RNP מבוססי יכול להיות מנוצל ליצירת מוטציות הקשורות משתנה האדם בגן תולעת orthologous במהירות מבלי לדרוש ביטוי מהונדס, במאמץ ליתר דיוק לשכפל את גנטי בהקשר של מחלה. השיטה שלנו מספק פלטפורמה אפשרית כדי לייצר ולבדוק גרסאות גנומית של משמעות לא ידועה בהקשר של ביטוי, שמונע את הפורמאליות ביטוי ובקרה תקינה אנדוגני. בסופו של דבר, אנחנו גם השתמשו בשיטה זו כדי לתייג אנדוגני גנים עם חלבונים פלורסנט (קרי GFP), אשר תספק כלי נוסף המדגימה כיצד משתנים משפיעים על חלבון לוקליזציה, צבירה, מחזור.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אנו מודים לחברי של המעבדה Beg לקריאה ביקורתית של כתב יד זה. זנים נמסרו על ידי המרכז גנטיקה Caenorhabditis , אשר ממומן על ידי משרד NIH תוכניות תשתית מחקר (P40 OD010440). המחקר במעבדה Beg הוא נתמך על ידי מענקים NIH (R01 NS094678), ניוון שרירים האגודה (MDA382300) כדי A.A.B.
Acknowledgments
ישנם שאין ניגודי אינטרסים הקשורים בדו ח זה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CRISPRevolution sgRNA EZ Kit | Synthego Inc. | chimeric sgRNA | |
| Nuclease-free TE | Synthego Inc. | provided with the sgRNA kit EZ kit | |
| Nuclease-free water | Synthego Inc. | provided with the sgRNA kit EZ kit | |
| 4 nmole Ultramer DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | ssODN HDR template | |
| Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLS | Integrated DNA Technologies | 1078728 | Cas9 protein |
| pCFJ90 | Addgene | 19327 | Pmyo-2::mCherry Marker Plasmid |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| DNA Clean & Concentrator | Zymo Research | D4004 | |
| Zymoclean Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4002 | |
| Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs | M0494L | |
| Proteinase K | Sigma | P2308 | |
| Glass Borosilicate Glass Micropipettes | Sutter Instruments | BF100-78-10 | OD: 1.0mm. ID: 0.78mm |
| Trizma Hydrochloride | Sigma | T5941 | |
| MgCl2 | Sigma | M2393 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| RNaseZap Decontamination Solution | Fisher Scientific | AM9780 |
References
- Dickinson, D. J., Goldstein, B. CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering. Genetics. 202, 885-901 (2016).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346, 1258096 (2014).
- Ma, D., Liu, F. Genome Editing and Its Applications in Model Organisms. Genomics Proteomics Bioinformatics. 13, 336-344 (2015).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 32, 347-355 (2014).
- Kim, H. M., Colaiacovo, M. P. CRISPR-Cas9-Guided Genome Engineering in C. elegans. Curr Protoc Mol Biol. 115, 31-31 (2016).
- Yin, H., Kauffman, K. J., Anderson, D. G. Delivery technologies for genome editing. Nat Rev Drug Discov. 16, 387-399 (2017).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 24, 1012-1019 (2014).
- Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biol. 17, 148 (2016).
- Paix, A., Folkmann, A., Seydoux, G. Precision genome editing using CRISPR-Cas9 and linear repair templates in C. elegans. Methods. , (2017).
- Prior, H., Jawad, A. K., MacConnachie, L., Beg, A. A. Highly Efficient, Rapid and Co-CRISPR-Independent Genome Editing in Caenorhabditis elegans. G3 (Bethesda). 7, 3693-3698 (2017).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. PCR: The Polymerase Chain Reaction. J Vis Exp. , (2017).
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J Vis Exp. , (2008).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests. J Vis Exp. , (2017).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. DNA Gel Electrophoresis . J Vis Exp. , (2017).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Gel Purification. J Vis Exp. , (2017).
- Estrada-Rivadeneyra, D. Sanger sequencing. FEBS J. , (2017).
- Ludolph, A. C., Brettschneider, J., Weishaupt, J. H. Amyotrophic lateral sclerosis. Curr Opin Neurol. 25, 530-535 (2012).
- Evans, T. C. WormBook. , The C. elegans Research Community, WormBook. (2006).
- Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-821 (2012).
- Boyd, S. D., et al. A Balanced Look at the Implications of Genomic (and Other "Omics") Testing for Disease Diagnosis and Clinical Care. Genes (Basel). 5, 748-766 (2014).
- Saccon, R. A., Bunton-Stasyshyn, R. K., Fisher, E. M., Fratta, P. Is SOD1 loss of function involved in amyotrophic lateral sclerosis? Brain. 136, 2342-2358 (2013).
- Acevedo-Arozena, A., et al. A comprehensive assessment of the SOD1G93A low-copy transgenic mouse, which models human amyotrophic lateral sclerosis. Dis Model Mech. 4, 686-700 (2011).
- Gurney, M. E., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264, 1772-1775 (1994).
