Summary
Her presenterer vi en metode for å ingeniør genomet C. elegans ved hjelp av CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins og homologi avhengige reparasjon maler.
Abstract
Gruppert regelmessig avbrutt palindromic gjentakelser (CRISPR) - CRISPR - tilknyttede protein 9 (Cas9) prokaryote adaptive immunsystemet forsvar har vært medforfatter valgt som et kraftig verktøy for presis eukaryote genomet engineering. Her presenterer vi en rask og enkel metode bruke chimeric enkelt guide RNAs (sgRNA) og CRISPR-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs) for effektiv og presis generering av genomisk punkt mutasjoner i C. elegans. Vi beskriver en rørledning for sgRNA Målvalg, homologi-rettet reparasjon (HDR) mal tegning, CRISPR-Cas9-RNP complexing og levering og en genotyperingteknologi strategi som gir robust og rapid identifikasjon av riktig redigerte dyr. Vår tilnærming ikke bare tillater den lettvinte generasjon og identifikasjon av ønsket genomisk punkt mutant dyr, men også forenkler påvisning av andre komplekse indel alleler i ca 4-5 dager med høy effektivitet og en redusert screening arbeidsmengde.
Introduction
Nyere teknologiske fremskritt har radikalt forvandlet og akselerert evnen til å nøyaktig ingeniør genomer. Spesielt har CRISPR-Cas9 systemet, som er avhenger av RNA-guidede endonuclease Cas9 å indusere en dobbel strand pause (DSB) nær målet sekvensen av interesse, vært mye brukt nøyaktig ingeniør genomet av flertallet av modell i biomedisinsk forskning1,2,3,4. Betydelig, bruk av CRISPR-Cas9 har ulåst genomet redigering selv i vanskelige arter som C. elegans5. Uansett art, generere punkt mutasjoner med CRISPR-Cas9 basert genomet redigering system avhengig tre kjerne-komponenter: 1) Cas9 endonuclease, 2) en enkelt hjelpelinje RNA (sgRNA) som leder Cas9 endonuclease en mål-sekvens, og 3) brukeren utformet homologi-rettet reparasjon (HDR) mal som inneholder ønsket edit(s) interesse2.
Det finnes flere metoder som kan brukes til å introdusere rettet mot sgRNA og Cas9 nuclease i cellene plasmider, RNA og viral basert levering metoder6. Nylig direkte levering av pre-kompleksbundet sgRNA-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs) har dukket opp som en kraftfull og effektiv verktøyet i CRISPR-Cas9-baserte genomet redigering7. Direkte levering av pre-kompleksbundet CRISPR-Cas9-RNPs har flere forskjellige fordeler, nemlig: 1) RNPs omgå behovet for mobilnettet transkripsjon og oversettelse, 2) RNPs fjernes raskt, som kan øke spesifisitet ved å redusere tilgjengelig tid for off-målet cleavage og 3) RNPs inneholder ingen fremmede DNA/RNA elementer som omgår innføring av ikke-innfødte sekvenser i vert genomet gjennom tilfeldige integrering. Disse attributtene sannsynlig utgjør sammen en kortvarig briste på målet CRISPR redigering samtidig minimere off-målet effekter.
Vi beskriver en enkel og effektiv protokoll for områdespesifikke genomisk endringer i C. elegans. Denne protokollen inkluderer målretting sgRNA og enkelt strandet oligonucleotide (ssODN) HDR mal tegning, sgRNA-Cas9 RNP complexing og levering, og en genotyperingteknologi strategi for utvetydig identifikasjon av riktig redigerte dyr. Bruker denne strategien, ikke bare kan de områdespesifikke endringene gjenopprettes, men andre ikke-spesifikke indel mutasjoner kan også gjenopprettes. Dermed vår strategi tillater generering av en allel serie med en enkelt strategi, der både mono-allel, bi-allel og indel mutanter kan genereres i F1 generasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr omsorg og eksperimentelle prosedyrer fulgte retningslinjen fra National Institutes of Health og dyr institusjon og bruk Committee (IACUC) ved University of Michigan. Bruk RNase-free løsninger og Pipetter tips i protokollen. Rengjør arbeidsområde, Pipetter, rør, og sentrifuge med RNase dekontaminering løsning etter produsent retningslinjene (se Materialer tabell).
1. sgRNA Målvalg
- Ved hjelp av en webleser, åpne websiden: http://crispor.tefor.net8
- Inndata ~ 60 base parene (bp) av flankerer den ønskede endringen av interesse (dvs. 30 bp 5' og 3' av ønsket Rediger).
- Velg Caenorhabditis elegans genomet fra rullegardinmenyen.
- Velg Protospacer tilstøtende motivet (20 bp-NGG - SpCas9, SpCas9-HF1, eSPCas9 1.1) fra rullegardinmenyen.
- Klikk Send. Velg topp rangert målet sekvensen nærmest Rediger rundt i resultater-siden. Hvis det er ingen passende målområder innenfor flankemanøveren 60 bp inndata sekvens, utvide spørringen sekvensen til 100 bp (dvs. 50 bp hver side av ønsket edit).
- Fra en tilgjengelig kilde, f.eks synthego, få en 20-mer målet sgRNA med følgende spesifikasjoner: 3 nmol; ingen endringer.
- Ved mottak, sentrifuge lyofilisert sgRNA som inneholder rør på > 12.000 x g i 1 min i romtemperatur. Legg 60 µL av nuclease-gratis TE til røret, og forsiktig å suspendere av pipettering opp og ned 15 - 20 ganger bruker en P200 pipette. Siste konsentrasjonen er 50 µM.
2. homologi-rettet reparasjon mal tegning
- Utforme en ssODN HDR malen inneholder: 1) mutasjon av interesse, 2) en unik i-ramme begrensning endonuclease-området, 3) en stille mutasjon av ett eller begge av Gs i NGG PAM sekvensen og 4) 50 bp 5' og 3 homologi armene flankert første og siste mutasjon. (Figur 1 c) 9 , 10.
- Hvis mutasjon av NGG PAM sekvensen ikke er mulig, innføre 5-6 stille mutasjoner i sgRNA målet anerkjennelse sekvensen å hindre sgRNA-mediert spalting av malen ssODN HDR.
- Fra en tilgjengelig kilde, f.eks idtdna, få en "Ultramer DNA oligonucleotide" med følgende parametere: skala: 4 nmol; Formuleringen: None; Rensing: Standard avsalte.
- Ved mottak, sentrifuge lyofilisert ssODN som inneholder rør på > 12.000 x g i 1 min i romtemperatur. Forsiktig å avbryte ssODN til en siste konsentrasjon av 100 µM nuclease uten ddH2O av pipettering opp og ned 15 - 20 ganger bruker en P200 pipette.
3. design genotyperingteknologi primere
- Utforme en primer sett flankert genomet endring til å generere en ~ 400-700 bp PCR amplicon11.
- Optimalisere PCR sykling forhold å produsere en enkelt og konkret amplicon11.
4. forberede injeksjon Mix
- Sentrifuge tabell 1 reagenser med maksimal hastighet i 2 minutter på 4 ° C.
- Rekkefølgen, Legg tabell 1 reagensene slik PCR nuclease-fri.
- Bland godt av pipettering forsiktig opp og ned 10 ganger med en P20 pipette.
- Inkuber injeksjon miks for 10 min ved romtemperatur.
5. injeksjon protokollen
- Last injeksjon brønnene med ca halvparten av injeksjon blande12. Lagre gjenværende injeksjon blanding injeksjon nålen tresko eller bryter.
- Bryte brønnene tips slik at ~ 20-30 PSI produserer en gradvis strømmende løsning12.
Merk: Større diameter tips negativt påvirke dyrehelse og redusere F1 avkom avkastning. - Injisere 10-15 ung voksen ormer i begge gonadal armene om mulig12. Hvis ikke, injeksjon i en gonadal arm er tilstrekkelig.
- Tillat injisert dyr (P0) å gjenopprette for 1-2 h ved romtemperatur på en OP50-seeded 35 mm Rundormer vekst medier (NGM) plate. Deretter plukke enkelt injisert P0 dyr til personlige OP50-seeded 35 mm NGM plater ved hjelp av en platina wire orm12.
6. skjermen P0 plater og enkelt mCherry(+) F1s
- To dager etter injeksjon, identifisere P0 plater som inneholder F1 avkom uttrykke mCherry i pharynx med et fluorescerende stereomicroscope (figur 1 d, dagen 2 - 3). Velg tre P0 plater som inneholder de fleste mCherry(+) F1 dyrene.
- Fra hver av de tre valgte P0 platene, enkelt 8-12 mCherry(+) F1 dyr totalt 24-36 mCherry(+) F1s med en orm plukker (figur 1 d, dagen 2 - 3).
Merk: mCherry(-) dyr kan også bli blinket fra disse P0 platene, men sannsynligheten for å identifisere riktig endret dyr er mye lavere (figur 2A). - La personlige F1s self-fertilize og legger egg i 1-2 dager ved romtemperatur.
7. enkelt orm PCR og genotyperingteknologi
- Etter 1-2 dager med egg-legging, overføre F1s i individuelle PCR stripe tube caps inneholder 7 µL av ormen lyseringsbuffer bruke en orm pick (tabell 2, figur 1 d, dag 4-5).
- Sentrifuger PCR rør med maksimal hastighet for 1 min ved romtemperatur å bringe dyr tube nederst og fryse rør ved-80 ° C i 1 time.
Merk: Ormer kan lagres ved-80 ° C på ubestemt tid. - Lyse frosne ormer i en thermocycler med følgende program: 60 ° C for 60 min, 95 ° C i 15 min 4 ° C holder.
- Oppsett PCR mastermix som vist i tabell 3.
- Legge til 21 µL av PCR mastermix i ren PCR-rør, og deretter legge 4 µL av ormen lysis fra trinn 3. Bland godt med en pipette og kjøre PCR programmet følgende produsenter retningslinjer (se Materialer tabell).
- Rense PCR reaksjoner med en DNA ren og konsentrere kit, følger du instruksjonene fra produsenten (se Materialer tabell). Elute DNA ved å legge 10 µL vann til kolonnen spinn.
- Oppsett begrensning enzymet mastermix som vist i Tabell 4.
- Legge til 10 µL av begrensning enzymet mastermix hver renset PCR reaksjon og ruge 1-2 h 37 ° C13.
- Separat fordøyd PCR-produkter på en 1,5% agarose gel kjøre på 120 V bruk 1 x Tris-acetate-EDTA (TAE) buffer14.
8. identifikasjon og sekvens verifisering av redigerte dyr
- Undersøke enzym fordøyd prøver for tilstedeværelsen av band som indikerer potensialet endret dyr14 (figur 1 d, dag 4-5).
Merk: Legg en N2 kontroll for å identifisere potensielle indel mutasjoner som kan observeres som endringer i bandet størrelse og/eller uventede og komplekse begrensning enzym fordøyelsen striper mønstre. - Etter å identifisere potensielle redigerte dyr, bruke de resterende 3 µL av ormen lyse og gjenta PCR reaksjonen. Rengjør ikke eller begrensning enzym fordøye PCR reaksjonen når programmet er fullført. Laste PCR reaksjonen på en 1% agarose gel, separat og ekstra bandet bruker en gel utvinning kit15 (se Materialer tabell).
- Sanger sekvens16 gel utdraget DNA ved hjelp av F1 primer for å identifisere riktig redigerte dyr (figur 1A)
Merk: Heterozygot leser inneholder kledde toppene av vill-type og konstruert allelet. - Å få homozygous dyr fra bekreftet heterozygote redigerte dyr, enkelt 8-12 F2 dyr og utføre trinn 7-8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mutasjoner i menneskelig superoxide dismutase 1 (SOD1) utgjør ~ 10-20% av familiær amyotrofisk lateral sklerose, en ødeleggende nevrodegenerative sykdommer som alltid fører til lammelse og død17. Menneskelige TORV-1 er et evolusjonært bevarte protein deler 55% identitet og 70% likhet med C. elegans TORV-1 protein (figur 1B). For å demonstrere den enkelhet, gjennomførbarhet og effektivitet av CRISPR-Cas9 RNP-basert tilnærming, rettet vi C. elegans torv-1 genet å innføre sykdomsassosierte menneskelige G93A varianten i ormen genomet (figur 1A).
For å ingeniør G93A mutasjon i C. elegans genomet, en sgRNA ble valgt som PAM anerkjennelse webområdet sitter 3 bp oppstrøms av G93 codon (figur 1 c). Vi utviklet en ssODN HDR reparasjon mal inneholder: 1) nukleotid endringer å konvertere G93 codon til A93 (GGA GCA), 2) en stille endring NGG PAM sekvens (CGG CAG) for å forhindre sgRNA-Cas9-mediert spalting av malen HDR, 3) en stille mutasjon (CT) som introduserer et unikt HindIII begrensning enzym sted for genotyperingteknologi og 4) 50 bp 5' og 3 homologi armene (figur 1 c). Et PCR primer sett (F1-R1) designet for å produsere ett 592 bp PCR produkt i N2 kontroller (figur 1A). En injeksjon blanding som inneholder sgRNA, ble Cas9, ssODN og en fluorescerende markør plasmider (pCFJ90) blandet sammen ruges i 10 min ved romtemperatur og lastet inn i en microinjection pipette.
Figur 1 d viser arbeidsflyten etter injeksjon blandingen er lagt inn en injeksjon brønnene. På dag 0, ble 10-15 P0 dyr injisert i en eller begge gonad armer bruker standard microinjection teknikk18,19. Injisert dyr igjen for 1-2 h og var deretter individuelt belagt på OP50-seeded NGM plater. Etter 2-3 dager, ble vellykket P0 injeksjoner identifisert av dem har mCherry(+) F1 avkom. Topp tre P0 plater (dvs. de som har flest mCherry(+) F1s) ble valgt for påfølgende analyse. Fra hver av disse tre plater (P0-8, P0-10, P0-12), 8 mCherry(+) F1s ble blinket til personlige OP50-seeded 35 mm NGM plater for totalt 24 mCherry(+) F1s. Etter 2-3 dager med egg-legging (dag 4 - 5), personlige F1s ble overført til PCR rør som inneholder ormen lyseringsbuffer og frosset 1t på-80 ° C. Deretter var F1s lysed for å frigjøre genomisk DNA, og utsatt for PCR. PCR produktene var så renset og fordøyd med HindIII 1t, og kjøre på en 1,5% agarose gel for å identifisere potensielle endret dyr. I riktig redigerte dyr, HindIII fordøyelsen kutt full lengde PCR produktet (592 bp) til to band av 370 bp og 222 bp. Denne genotyperingteknologi-strategien utvetydig skiller mellom vill-type (592 bp), heterozygot (592, 370, 222 bp) og homozygote (370, 222 bp) dyr. Figur 2A illustrerer genotyperingteknologi resultatene for 24 mCherry(+) dyr.
For å demonstrere at fluorescerende mCherry markøren beriker genomet endring, plukket vi også 8 mCherry(-) dyr fra hver av tre P0 platene. 24 mCherry(+) F1s vist (rød linje), 10 inneholdt mono-allel eller bi-allel endring (42%), 10 var wild type (42%), 3 var potensielle indeler (13%), og det var 1 PCR feil (figur 2A). Derimot 24 mCherry(-) F1s vist, var kun 1 dyr riktig modifisert (4%), mens, 23 var wild type (96%) (Figur 2A). Figur 2B viser chromatogram fra den fulle gel utdraget PCR produkt (F18-6), viser at endres presis nukleotid utformet i malen ssODN HDR var trofast innlemmet i genomet av denne homozygous F 1 dyr. Spesielt utstilt F1 dyr 10-7, 10-8 og 12-3 uventet PCR produktet størrelser og begrensning digest striper mønstre, tyder disse dyrene kan bære komplekse indel mutasjoner (figur 2A). Dermed vår metode er ikke bare generere ønsket genomet modification(s) med letthet, effektivitet og kvalitet, men også tillater identifikasjon og utvinning av unike indel alleler som kan kaste viktig og uventede innsikt gen funksjon.
Figur 1 . CRISPR-Cas9 utvikling av den C. eleganstorv-1 locus. (A) Mactac viser ekson-intron strukturen i torv-1 locus i C. elegans. Den røde linjen angir plasseringen av G93 i ekson 3. Primer par settet er bemerket av den røde piler (F1-R1). (B) sekvens justering av menneskelige og C. elegans (worm) TORV-1 proteiner. Målrettet G93 rester er uthevet i rødt. (C) øverst, en del av genomisk DNA rundt G93 codon vises som en referanse, og PAM (grønn) og sgRNA (blå) målområder utheves. Nederst, enkelt strandet oligonucleotide (ssODN) homologi regissert reparasjon (HDR) mal vises som inneholder: codon Rediger endre G93 til A93, en stille endring PAM motivet å hindre spalting av sgRNA-Cas9 komplekset, en stille endre til innføre et unikt HindIII begrensning enzym område (gul boks), og flankert 5' og 3' 50 bp homologi armene (svarte). Alle nukleotid endringer i ssODN er farget rødt. (D) skjematisk illustrasjon av rørledningen for generering og identifisere CRISPR-Cas9 RNP-baserte punkt mutanter. På dag 0, injisere 10-15 P0 dyr med injeksjon blanding. På dag 2-3, identifisere ble injisert P0 dyr av de som inneholder fluorescerende F1 avkom, og velg tre P0 plater med mest fluorescerende avkommet. Fra hver av tre P0 platene, én 8 fluorescerende F1 avkom. På dag 4-5 (a) trinn 1, personlige F1s er plukket og plassert i PCR rør som inneholder lyseringsbuffer; (b) trinn 2 er etter frysing ved-80 ° C, PCR rør som inneholder F1 ormer lysed for å løslate genomisk DNA, som brukes som en PCR-mal. PCR produktene så renset og fordøyd med unik begrensning enzymet; (c) trinn 3, enzym fordøyd produkter er løst på en agarose gel hvor vill type (+/ +), heterozygote (m / +), og homozygous (m/m) dyr kan identifiseres av begrensning digest striper mønstre. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 . Genotyperingteknologi data torv-1 (G93A) mutanter. (A) Gel bilde av F 1 dyr som var individuelt lysed, PCRed og fordøyd med HindIII. For hver P0 plate (P0-8, P0-10, P0-12), ble 8 mCherry(+) og 8 mCherry(-) F1 dyr analysert. Både mono-allel (blå tall) og bi-allel (røde tall) redigerte dyr ble gjenopprettet. Størrelse flyttet PCR produkter eller uforutsett HindIII fordøyd band gjenvunnet også som indel mutanter (gul tall). N2 kontroller vises som referanse for PCR produkt dimensjonering og enzym spesifisitet. (B) øverst, codon avstand og aminosyre oversettelser wild type (WT) vises over og under for G93A endret tråder. Den ønskede endringen er markert med en rød boks og stille endringene lage en i-ramme HindIII begrensning området er merket med en gul boks. Alle designet nukleotid endringer vises i fet skrift. Nederst, representant chromatogram fra homozygous F1 dyr 8-6. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Reagens | Volum | Siste konsentrasjon |
| ddH2O | 6.3 ΜL | ---- |
| KCl (4M) | 0.94 ΜL | 300 mM |
| HEPES (0.5M) pH 7.4 | 0,5 ΜL | 20 mM |
| pCFJ90 (25 ng/μL) | 1,25 ΜL | 2,5 ng/μL |
| ssODN (500 ng/μL) | 1,25 ΜL | 50 ng/μL |
| sgRNA (50 μM) | 1,25 ΜL | 5 ΜM |
| Cas9 (61 μM) | 1,03 ΜL | 5 ΜM |
| Siste volum | 12.5 ΜL | ---- |
Tabell 1. CRISPR-Cas9 RNP injeksjon blanding. Reagenser skal re suspendert i nuclease uten ddH2O. RNase gratis teknikker bør brukes ved håndtering av reagenser og når injeksjon mix.
| Reagens | [Ferdig] |
| KCl | 50 mM |
| Tris-HCl pH 8.3 | 10 mM |
| MgCl2 | 2.5 mM |
| NP-40 | 0.45% |
| Tween-20 | 0.45% |
| Proteinasen K | 1 mg/mL |
Tabell 2. Ormen Lysis Buffer oppskrift. Proteinasen K bør legges frisk før bruk.
| Reagens | 1 x | 24 x |
| 2 x Q5 Mastermix | 12.5 ΜL | 300 ΜL |
| Primer F1 (10 μM) | 1,25 ΜL | 30 ΜL |
| Primer R1 (10 μM) | 1,25 ΜL | 30 ΜL |
| Ormen Lysis | 4 ΜL | ---- |
| ddH2O | 6 ΜL | 144 ΜL |
| Siste volum | 25 ΜL | 504 ΜL |
Tabell 3. PCR Mastermix. The PCR mastermix bør blandes godt av pipettering til løsningen er homogen. 21 µL av PCR-mastermix skal legges til ren PCR-rør, og deretter 4 µL av personlige ormen lysate skal legges til riktig merket rør.
| Reagens | 1 x | 24 x |
| 10 x enzym Buffer | 2 ΜL | 48 ΜL |
| Renset PCR reaksjon | 10 ΜL | ---- |
| ddH2O | 7 ΜL | 168 ΜL |
| Begrensning enzym (10 U/μL) | 1 ΜL | 24 ΜL |
| Siste volum | 20 ΜL | 240 ΜL |
Tabell 4. Begrensning enzymet Mastermix. Begrensning enzymet mastermix bør blandes godt av pipettering til løsningen er homogen. 10 µL av begrensning enzymet mastermix skal legges til 10 µL av renset PCR-produkt
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CRISPR-Cas9 systemet er et kraftig og effektiv verktøy for å presist endre genomet av modellen organismer. Her viser vi at chimeric sgRNAs20 kombinert med ssODN HDR kan høyeffektive generering av genomisk punkt mutasjoner i C. elegans. Viktigere, viser vi at RNP levering produserer høy redigering effektivitet når fluorescens som en co markøren, opplyser det enkel og pålitelig teknikken.
Fleste av CRISPR-Cas9 C. elegans genomet engineering er avhengige av bestemte genetisk bakgrunner eller co-CRISPR strategier1. Metoden co-CRISPR har vist seg for å være en utrolig nyttig verktøy som øker sannsynligheten for å få en vellykket genomet redigere. Co-CRISPR metoder krever imidlertid introduserer en fenotypen-valgbar redigere på en markør locus som beriker for genomet redigering av interesse. Mens kraftig, kan introduserer valgbar fenotypen rentebærende mutasjoner være uønsket hvis belastningen redigere eller ønsket punkt mutasjon av interesse seg utstillinger fenotyper som kan bli forverret eller undertrykt markør fenotypen. Videre nødvendiggjøre co-CRISPR strategier skaper en ekstra dobbel strand pause på en markør locus som kan bidra til off-målet effekter. Her presenterer vi en metode som bruker en forbigående fluoreserende markør som ikke bare brukes til å identifisere ble injisert P0 dyr, men også beriker for riktig genomet redigeringer. Våre data viser denne metoden betydelig beriker for vellykket redigerte dyr i forhold til ikke-fluorescerende dyr, og gir flere forskjellige fordeler: 1) bare en målgruppe stedsbestemte sgRNA kreves, 2) en 5-fold reduksjon i Cas9 og sgRNA konsentrasjon, 3) belastning og fenotypen utvalg uavhengighet og 4) en nominell screening arbeidsmengde (~ 24 F1s). Robust CRISPR-Cas9 genomet redigering i F1 generasjon ble observert ved hjelp av denne metoden. Spesielt kan PCR-begrensning enzym-basert oppdagelsen strategi beskrevet utvetydig påvisning av mono - og bi-allel redigerte dyr i F1 generasjon. Endelig genotyperingteknologi strategi gjør identifisering av potensielle indel mutasjoner, som kan observeres som PCR bandet SKIFT når sammenlignet med N2 kontroller, som enten ikke utsatt for begrensning ufullstendig eller avkastning komplekse band når fordøyd.
Bruk neste generasjons sekvensering kombinert med storskala genomisk innsats har akselerert identifikasjon av genomisk varianter som skille med sykdom21. Men har funksjonelle tester av virusets ikke vist for fleste av variantene i mobilnettet og organismebiologi systemer. I denne studien vi målrettet torv-1 genet i C. elegans å presentere den mye studert ALS-assosiert TORV-1G93A mutasjon. Hittil har er denne mutasjonen modellert og studert i C. elegans og mus hovedsakelig ved hjelp av transgene overuttrykte. Selv overuttrykte varianter i dyremodeller kan recapitulate nøkkel mobilnettet, molekylær og atferdsmessige aspekter av sykdommen, er det stadig klarere at "dose" er en formildende faktor i å bestemme fenotyper22. For eksempel utstilling høy kopi nummer TORV-1G93A mus bærer ~ 24 kopier av mutant menneskelige TORV-1 genet sterkt akselererte sykdom kurs sammenlignet med TORV-1G93Adl mus, som bærer bare ~ 8-10 kopier23,24. Her viser vi at vår CRISPR-Cas9 RNP-basert metode kan benyttes for å raskt generere menneskelige variant-associated mutasjoner i orthologous orm genet uten transgene overuttrykte, i et forsøk på å gjenskape mer presist den genetiske sammenheng med sykdom. Vår metode gir en mulig plattform for å produsere og teste genomisk varianter av ukjent betydning i forbindelse med endogene regulatoriske kontroll og uttrykk som utelukker rammen av overuttrykte. Endelig har vi også brukt denne metoden for å merke endogene gener med fluorescerende proteiner (dvs. GFP), som gir et ekstra verktøy for å visualisere hvordan varianter påvirker protein lokalisering, aggregasjon og omsetning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi takker medlemmer av Beg laboratorium for kritisk lesning av dette manuskriptet. Stammene ble gitt av Caenorhabditis genetikk sentrum, som er finansiert av NIH Office forskning infrastruktur programmer (P40 OD010440). Forskning i Beg laboratoriet støttes av tilskudd fra NIH (R01 NS094678) og muskeldystrofi Association (MDA382300) til A.A.B.
Acknowledgments
Det er ingen konflikter av interesse knyttet til denne rapporten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CRISPRevolution sgRNA EZ Kit | Synthego Inc. | chimeric sgRNA | |
| Nuclease-free TE | Synthego Inc. | provided with the sgRNA kit EZ kit | |
| Nuclease-free water | Synthego Inc. | provided with the sgRNA kit EZ kit | |
| 4 nmole Ultramer DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | ssODN HDR template | |
| Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLS | Integrated DNA Technologies | 1078728 | Cas9 protein |
| pCFJ90 | Addgene | 19327 | Pmyo-2::mCherry Marker Plasmid |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| DNA Clean & Concentrator | Zymo Research | D4004 | |
| Zymoclean Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4002 | |
| Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs | M0494L | |
| Proteinase K | Sigma | P2308 | |
| Glass Borosilicate Glass Micropipettes | Sutter Instruments | BF100-78-10 | OD: 1.0mm. ID: 0.78mm |
| Trizma Hydrochloride | Sigma | T5941 | |
| MgCl2 | Sigma | M2393 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| RNaseZap Decontamination Solution | Fisher Scientific | AM9780 |
References
- Dickinson, D. J., Goldstein, B. CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering. Genetics. 202, 885-901 (2016).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346, 1258096 (2014).
- Ma, D., Liu, F. Genome Editing and Its Applications in Model Organisms. Genomics Proteomics Bioinformatics. 13, 336-344 (2015).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 32, 347-355 (2014).
- Kim, H. M., Colaiacovo, M. P. CRISPR-Cas9-Guided Genome Engineering in C. elegans. Curr Protoc Mol Biol. 115, 31-31 (2016).
- Yin, H., Kauffman, K. J., Anderson, D. G. Delivery technologies for genome editing. Nat Rev Drug Discov. 16, 387-399 (2017).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 24, 1012-1019 (2014).
- Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biol. 17, 148 (2016).
- Paix, A., Folkmann, A., Seydoux, G. Precision genome editing using CRISPR-Cas9 and linear repair templates in C. elegans. Methods. , (2017).
- Prior, H., Jawad, A. K., MacConnachie, L., Beg, A. A. Highly Efficient, Rapid and Co-CRISPR-Independent Genome Editing in Caenorhabditis elegans. G3 (Bethesda). 7, 3693-3698 (2017).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. PCR: The Polymerase Chain Reaction. J Vis Exp. , (2017).
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J Vis Exp. , (2008).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests. J Vis Exp. , (2017).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. DNA Gel Electrophoresis . J Vis Exp. , (2017).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Gel Purification. J Vis Exp. , (2017).
- Estrada-Rivadeneyra, D. Sanger sequencing. FEBS J. , (2017).
- Ludolph, A. C., Brettschneider, J., Weishaupt, J. H. Amyotrophic lateral sclerosis. Curr Opin Neurol. 25, 530-535 (2012).
- Evans, T. C. WormBook. , The C. elegans Research Community, WormBook. (2006).
- Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-821 (2012).
- Boyd, S. D., et al. A Balanced Look at the Implications of Genomic (and Other "Omics") Testing for Disease Diagnosis and Clinical Care. Genes (Basel). 5, 748-766 (2014).
- Saccon, R. A., Bunton-Stasyshyn, R. K., Fisher, E. M., Fratta, P. Is SOD1 loss of function involved in amyotrophic lateral sclerosis? Brain. 136, 2342-2358 (2013).
- Acevedo-Arozena, A., et al. A comprehensive assessment of the SOD1G93A low-copy transgenic mouse, which models human amyotrophic lateral sclerosis. Dis Model Mech. 4, 686-700 (2011).
- Gurney, M. E., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264, 1772-1775 (1994).
