Summary
Здесь мы представляем метод инженер генома C. elegans используя ТРИФОСФАТЫ-Cas9 ribonucleoproteins и гомологии зависимых ремонт шаблоны.
Abstract
Кластерный повторяется регулярно перемежаются рецидивирующий (ТРИФОСФАТЫ) - ТРИФОСФАТЫ - связанных белков прокариот адаптивной иммунной обороны системы был кооптирован как мощный инструмент для точного генома эукариот техники 9 (Cas9). Здесь мы представляем быстрый и простой метод, используя химерных одно руководство РНК (sgRNA) и ТРИФОСФАТЫ-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs) для эффективного и точного поколения геномной точечные мутации в C. elegans. Мы описываем трубопровода для sgRNA выбор цели, ориентированные на гомологии ремонт (HDR) шаблон дизайна, ТРИФОСФАТЫ-Cas9-RNP комплексообразования и доставки и генотипирования стратегия, которая обеспечивает надежное и быстрое выявление правильно отредактированный животных. Наш подход не только позволяет легким поколение и определение желаемого геномной точки мутанта животных, но также облегчает обнаружение других сложных indel аллелей в приблизительно 4-5 дней с высокой эффективностью и снижение скрининг рабочей нагрузки.
Introduction
Последние технологические достижения радикально преобразована и ускоренного способность точно инженер геномов. В частности ТРИФОСФАТЫ-Cas9 система, которая опирается на РНК руководствуясь эндонуклеазы Cas9 вызвать разрыв двойной нити (DSB) вблизи последовательности целевых объектов, представляющих интерес, широко используется для точного инженер геном большинства модельных организмов, используемых в биомедицинских исследований1,2,3,4. Существенно использование ТРИФОСФАТЫ-Cas9 разблокирована, даже в трудных видов как C. elegans5изменения генома. Независимо от вида, генерации точечные мутации с геном основанный ТРИФОСФАТЫ-Cas9, редактирования системы основывается на трех основных компонентов: 1) Cas9 эндонуклеазы, 2) одно руководство РНК (sgRNA), который руководит Cas9 эндонуклеазы в последовательности целевых объектов и 3) разработан пользователем ориентированные на гомологии ремонт (HDR) шаблон, содержащий нужную edit(s) интерес2.
Существует несколько методов, которые можно использовать для нацеливания sgRNA и Cas9 Нуклеаза в клетки, включая плазмида, РНК и доставки на основе вирусные методы6. Недавно прямые поставки pre-complexed sgRNA-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs) стала мощным и эффективным инструментом в геноме ТРИФОСФАТЫ-Cas9 основе редактирования7. Прямая доставка pre-complexed ТРИФОСФАТЫ-Cas9 RNPs имеет несколько различных преимуществ, а именно: 1) RNPs обойти необходимость клеточной транскрипции и быстро очищаются перевод, 2) RNPs, которые могут повысить специфика путем уменьшения свободного времени для пробить расщепления и 3) RNPs содержат не иностранные элементы ДНК/РНК, которые нарушают введение неместных последовательностей в геном хоста через случайные интеграции. Вместе эти атрибуты вероятно обеспечивают недолго взрыв на цель ТРИФОСФАТЫ редактирования при сведении к минимуму эффекты пробить.
Мы опишем простой и эффективный протокол для конкретных участков геномных изменений в C. elegans. Этот протокол включает в себя ориентации sgRNA и одного мель олигонуклеотида (ssODN) HDR шаблон дизайна, sgRNA-Cas9 RNP комплексообразования и доставки и генотипирования стратегию для однозначной идентификации должным образом редактировать животных. Используя эту стратегию, не только может быть восстановлена желаемых конкретных изменений, но также могут быть взысканы другие неспецифические indel мутации. Таким образом наша стратегия позволяет поколение аллельные серии, используя единую стратегию, где моно аллельные, Би аллельных и indel мутанты могут создаваться в поколении1 F.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все ухода за животными и экспериментальной процедуры после рекомендации от национальных институтов здоровья и институциональный уход за животными и использования Комитет (IACUC) в университете штата Мичиган. Использовать бесплатные РНКазы решения и Пипетка советы по всему протоколу. Очистите рабочую область, пипетки, трубы и центрифуги с решением РНКазы обеззараживания инструкций производителя (см. Таблицу материалов).
1. sgRNA выбор цели
- С помощью веб-браузера, откройте веб-страницу: http://crispor.tefor.net8
- Ввод ~ 60 пар оснований (ВР) последовательности фланкируя желаемого изменения интереса (то есть 30 bp 5' и 3' желаемого редактирования).
- Выберите Caenorhabditis elegans генома из выпадающего меню.
- Выберите Protospacer прилегающие мотив (20 bp НЭС - SpCas9, SpCas9-HF1, eSPCas9 1.1) из выпадающего меню.
- Нажмите кнопку Отправить. На странице результатов выберите Топ Ранжированные последовательности ближе к редактирования интерес. Если нет подходящей мишенью сайтов в пределах входной последовательности фланкируя 60 bp, разверните узел последовательности запроса до 100 bp (т.е. 50 bp обе стороны желаемого редактирования).
- Из доступных источников, например synthego, получить целевой sgRNA 20-mer со следующими спецификациями: 3 нмоль; никакие изменения.
- По получении, центрифуга лиофилизированные sgRNA, содержащие трубки на > g 12000 x 1 мин при комнатной температуре. 60 мкл свободной от нуклеиназы TE на трубу и аккуратно вновь приостановить, закупорить вверх и вниз 15 - 20 раз с помощью пипетки P200. Конечная концентрация составляет 50 мкм.
2. ориентированные на гомологии ремонт шаблон дизайна
- Дизайн ssODN HDR шаблон содержит: 1) мутации интерес, 2) уникальный эндонуклеазы ограничения в кадр сайт, 3) немого мутации одного или обоих из Gs в пределах последовательности NGG PAM и 4) 50 bp, 5' и 3' оружия гомологии фланговые первый и последний мутации. (Рис. 1 c) 9 , 10.
- Если мутация NGG PAM последовательности невозможно, ввести 5-6 немого мутации в sgRNA признание последовательности для предотвращения sgRNA опосредованной расщепления HDR шаблона ssODN.
- Из доступных источников, например idtdna, получить «Ultramer ДНК олигонуклеотида» со следующими параметрами: шкала: 4 нмоль; Разработка: Нет; Очистка: Стандартные обессоливания.
- По получении, центрифуга лиофилизированные ssODN, содержащие трубки на > g 12000 x 1 мин при комнатной температуре. Аккуратно вновь приостановите ssODN до конечной концентрации 100 мкм в свободной от нуклеиназы ddH2O, закупорить вверх и вниз 15 - 20 раз с помощью пипетки P200.
3. дизайн генотипирования праймеры
- Дизайн праймера, набор фланговые модификации генома для создания Ампликон ПЦР ~ 400-700 bp11.
- Оптимизируйте Велоспорт условия PCR для производства одного и конкретных ампликон11.
4. подготовить смесь инъекций
- Центрифуга Таблица 1 реагентов на максимальной скорости на 2 мин при 4 ° C.
- В указанном порядке добавьте таблицы 1 реагентов в свободной от нуклеиназы ПЦР-пробирку.
- Тщательно смешайте нежно закупорить вверх и вниз в 10 раз с P20 пипетки.
- Инкубируйте инъекции смесь для 10 мин при комнатной температуре.
5. инъекции протокол
- Загрузите микропипеткой инъекций с примерно половину смеси инъекции12. Сохраните оставшиеся инъекции смеси в случае инъекционной иглы башмаки или разрывы.
- Разбейте микропипеткой наконечник, так что ~ 20-30 МПа производит постепенного течет решение12.
Примечание: Большего диаметра советы негативно повлиять на здоровье животных и снижение урожайности потомства1 F. - Придать 10-15 молодых взрослых червей в обоих гонадной оружия если возможно12. Если не, инъекций в одну руку, гонадной является достаточным.
- Разрешите вводят животных (0P), чтобы восстановить для 1-2 ч при комнатной температуре на плите СМИ (НГМ) нематоды роста ОР50 посеян 35 мм. Впоследствии один вводили P0 животных для отдельных ОР50 посеян 35 мм NGM пластины с помощью провода платины червь выбрать12.
6. экран P0 пластины и одного mCherry(+) F1s
- Два дня впрыск, определить P0 пластины, содержащие F1 потомства, выражая mCherry в глотки, с использованием флуоресцентных стереомикроскопом (рис. 1 d, день 2 - 3). Выберите три P0 пластины, которые содержат большинство животных mCherry(+) F1 .
- От каждого из трех выбранных плит0 P, один 8-12 mCherry(+) F1 животных для в общей сложности 24-36 mCherry(+) F1s с помощью червь выбрать (рис. 1 d, день 2 - 3).
Примечание: mCherry(-) животных можно также выделить из этих плит0 P, но вероятность выявления корректно отредактировал животных гораздо ниже (рисунок 2A). - Разрешить отдельные F1s self-fertilize и откладывают яйца на 1-2 дней при комнатной температуре.
7. единственный червь ПЦР и генотипирования
- После 1-2 дней яйцекладки перевод1ф на отдельные ПЦР газа труба шапки содержащие 7 мкл буфера Lysis червя, используя забрать червя (Таблица 2, рис. 1 d, 4-5 день).
- ПЦР пробирок с максимальной скоростью за 1 мин при комнатной температуре животных на дно трубки, и заморозить трубок-80 ° C в течение 1 ч.
Примечание: Черви могут храниться при температуре-80 ° C на неопределенный срок. - Лизировать замороженных червей в Термоциклер, используя следующую программу: 60 ° C в течение 60 мин., 95 ° C в течение 15 мин., 4 ° C провести.
- Set-up mastermix PCR, как показано в таблице 3.
- 21 мкл mastermix ПЦР в чистой ПЦР трубки, а затем добавить 4 мкл лизис червя из шага 3. Смеси хорошо с помощью пипетки и запустите программу ПЦР инструкций производителей (см. Таблицу материалов).
- Очистить ПЦР-реакции, используя набор ДНК чистой и концентрат, следуя инструкциям производителя (см. Таблицу материалов). Элюировать ДНК путем добавления 10 мкл воды в столбце спина.
- Set-up mastermix энзима ограничения, как показано в таблице 4.
- 10 мкл mastermix энзима ограничения для каждой очищенных реакции PCR и инкубировать в течение 1-2 ч при 37 ° C13.
- Отдельные переваривается продуктов ПЦР на 1,5% агарозном геле на 120 V с использованием буфера Tris ацетат ЭДТА (ТЭ) 1 x14.
8. Идентификация и проверка последовательности отредактированный животных
- Проверьте образцы фермента усваиваются на наличие полос, которые показывают, что потенциал редактировать14 животных (рис. 1 d, 4-5 день).
Примечание: Загрузите элемент управления N2 для выявления потенциальных indel мутации, которые могут наблюдаться как сдвиги в группе Размер и/или Пищеварение энзима ограничения неожиданные и сложных, диапазонов моделей. - После выявления потенциальных отредактированный животных, использовать оставшиеся 3 мкл червь лизис и повторите реакции PCR. Не мойте или энзима ограничения дайджест реакции PCR после завершения программы. Загрузить реакции PCR на геле агарозы 1%, отдельный и извлекать группы с помощью геля добыча комплект15 (см. Таблицу материалов).
- Сэнгер последовательности16 гель извлечь ДНК, используя праймер F1 для идентификации правильно отредактированный животных (рис. 1A)
Примечание: Гетерозиготности читает будет содержать обложил вершины вследствие наличия дикого типа и инженерии аллеля. - Для получения гомозиготных животных из проверенных гетерозиготных отредактированная животных, один 8-12 F2 животных и выполните шаги 7-8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мутации в человека супероксиддисмутаза 1 (SOD1) составляют ~ 10-20% семейных боковой амиотрофический склероз, разрушительные нейродегенеративные болезни, которая неизменно приводит к параличу и смерти17. Человеческой SOD-1 является эволюционно сохраненных белков, обмена 55% идентичности и 70% сходство с C. elegans SOD-1 протеин (Рисунок 1B). Чтобы продемонстрировать простоту, целесообразности и эффективности подхода на основе ТРИФОСФАТЫ-Cas9 RNP, мы ориентированы C. elegans дерново-1 гена для представления связанных заболеваний человека G93A вариант в геноме червь (рис. 1A).
Инженер G93A мутации в геном C. elegans , sgRNA был выбран, чей сайт признание PAM сидит 3 bp вверх по течению от G93 кодон (рис. 1 c). Мы разработали ssODN HDR ремонт шаблон содержит: 1) нуклеотидных изменений для преобразования G93 кодон A93 (GGA ГКА), 2) немого изменения NGG PAM последовательности (СЖЖ CAG) для предотвращения sgRNA-Cas9-опосредованной расщепления HDR шаблона, 3) немого мутация (КТ), представляет уникальный сайт HindIII энзима ограничения для генотипирования и 4) 50 bp 5' и 3' гомологии оружия (рис. 1 c). Набор праймера PCR (F1-R1) был разработан для производства одного продукта PCR 592 bp в элементах управления N2 (рис. 1A). Инъекции смеси, содержащие sgRNA, Cas9, ssODN и флуоресцентных маркеров плазмида (pCFJ90) были смешаны вместе, инкубировали в течение 10 минут при комнатной температуре и загружаются в микроинъекции пипетки.
Рисунок 1 d изображает рабочего процесса после инъекции смесь загружается в микропипеткой инъекции. В день 0 10-15 P0 животных вводили в одной или обеих Гонада оружия, используя стандартные микроинъекции технику18,19. Вводят животных восстановлены для 1-2 ч и были затем индивидуально покрытием на ОР50 посеян NGM пластины. После 2-3 дня успешно P0 инъекции были определены те имея mCherry(+) F1 потомства. Топ 3 P0 пластины (т.е. тех, кто имеет наибольшее количество mCherry(+) F s1) были выбраны для последующего анализа. От каждого из этих трех пластин (-8 P0, P0-10, P0-12) 8 mCherry(+) F1s были выделены для отдельных ОР50 посеян 35 мм NGM пластины для в общей сложности 24 mCherry(+)1ф. После 2-3 дней яйцекладки (день 4 - 5) отдельные ф1были переведены в ПЦР-пробирки, содержащие буфера lysis червя и заморожены на 1 час при температуре-80 ° C. Впоследствии1ф лизированы освободить геномной ДНК и подвергается ПЦР. Продукты PCR были затем очищенный и переваривается с HindIII за 1 ч и запустить на 1,5% агарозном геле для выявления потенциальных редактировать животных. В правильно отредактированный животных, HindIII пищеварение отрубы полнометражного продукт PCR (592 bp) в две полосы 370 bp и 222 bp. Эта стратегия генотипирования однозначно дифференцирует между одичал тип (592 bp), гетерозиготности (592, 370, 222 bp) и homozygote (370, 222 bp) животных. Рисунок 2A иллюстрирует генотипирования результатов для 24 mCherry(+) животных.
Чтобы продемонстрировать, что маркер флуоресцентный mCherry обогащает для модификации генома, мы также выбрали 8 mCherry(-) животных от каждого из трех P0 пластин. 24 mCherry(+) F1s экранированный (красная полоса), 10 содержится моно аллельные или Би аллельные модификации (42%), 10 были дикого типа (42%), 3 были потенциальные indels (13%), и там был 1 ПЦР провал (рис. 2A). В отличие от этого 24 mCherry(-) F1s экранированный, только 1 животного был правильно модифицированных (4%); в то время как 23 были дикого типа (96%) (Рис. 2A). Рисунок 2B показывает Хроматограмма из полнометражных гель извлеченные продукт PCR (F18-6), демонстрируя, что точное нуклеотидных изменений разработан в шаблоне HDR ssODN были добросовестно включены в геном этой гомозиготных F 1 животное. В частности F1 животных 10-7, 10-8 и 12-3 выставлены неожиданных размеров продукта ПЦР и ограничение дайджест диапазонов моделей, предполагая, что эти животные могут нести комплекс indel мутации (рисунок 2A). Таким образом наш метод способен не только генерировать генома желаемых изменений с легкостью, эффективность и точность, но также позволяет идентификации и восстановления уникальных indel аллелей, которые могут пролить важные и неожиданные проницательность в функции гена.
Рисунок 1 . ТРИФОСФАТЫ-Cas9 техники C. elegansдерново-1 Локус. (A) Схематическая иллюстрация, изображающая Экзон Интрон структура дерново-1 локус в C. elegans. Красная полоса обозначает расположение G93 в экзона 3. Набор пара грунтовка отмечен красной стрелки (F1-R1). (B) последовательность выравнивание человека и белков SOD-1 C. elegans (червь). Целевые G93 остатков будет выделена красным цветом. (C) Top, раздел геномной ДНК, окружающих G93 кодон отображается как ссылка, и PAM (зеленый) и sgRNA (синий) целевые сайты будут выделены. Дно, гомологии единого мель олигонуклеотида (ssODN) направлена ремонт (HDR) шаблон отображается содержащий: кодон редактирования, изменения G93 A93, молчаливый изменения PAM мотив для предотвращения расщепления, sgRNA-Cas9 комплекс, молчаливый изменить ввести уникальный сайт HindIII энзима ограничения (желтом), и фланговые 5' и 3' 50 bp гомологии вооружений (черные полосы). Все изменения нуклеотидов, в ssODN, выделен красным цветом. (D) схематическая иллюстрация трубопровода для генерации и выявления ТРИФОСФАТЫ-Cas9 RNP-точка мутантов. В день 0 придать 10-15 P0 животных с впрыском смесь. На 2-3 день идентифицировать успешно вводят P0 животных, содержащие флуоресцентные F1 потомства и выберите три P0 пластины с наиболее флуоресцентные потомства. От каждого из трех P0 пластин один 8 Флюоресцентная F1 потомства. На 4-5 день, этап 1, индивидуальные ф1взял и помещены в ПЦР-пробирки, содержащие литического буфера; (b) шаг 2, после замораживания при температуре-80 ° C, ПЦР-пробирки, содержащие F1 черви являются лизированы выпустить геномной ДНК, которая используется в качестве шаблона ПЦР. Продукты PCR затем очищены и переваривается с уникальным энзима ограничения; (c) шаг 3, фермент усваиваются товары разрешаются на геле агарозы, где дикие типа (+/ +), гетерозиготной (м / +), и гомозиготных (м/м) животных могут быть идентифицированы путем ограничения дайджест диапазонов моделей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 . Генотипирование данных для дерново-1 (G93A) мутантов. (A) Гель изображение F 1 животных, которые были индивидуально лизированы, PCRed и переваривается с HindIII. Для каждого P0 плита (P0-8 P0-10, P0-12) 8 mCherry(+) и 8 mCherry(-) F1 животных были проанализированы. Моно аллельные (синие цифры) и Би аллельные (красные цифры) отредактированный животных были восстановлены. Размер смещается продукты PCR или непредвиденных HindIII усваивается полосы были также восстановлены, свидетельствует о indel мутантов (желтые номера). N2 элементы отображаются как ссылку для ПЦР продукта калибровки и фермента характерности. (B) сверху, кодон интервалов и аминокислоты переводы показано выше для дикого типа (WT) и ниже для G93A изменения пряди. Желаемого редактирования выделяется красной коробке, и молчание изменения, которые создать сайт ограничение HindIII рамы выделяются на желтом. Все разработанные нуклеотидных изменений указаны жирным шрифтом. Дно, представитель хроматограммы с гомозиготной F1 животных 8-6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Реагент | Объем | Конечная концентрация |
| ddH2O | 6.3 МКЛ | ---- |
| KCl (4 М) | 0.94 МКЛ | 300 мм |
| HEPES (0.5M) рН 7,4 | 0.5 МКЛ | 20 мм |
| pCFJ90 (25 нг/мкл) | 1,25 МКЛ | 2.5 нг/мкл |
| ssODN (500 нг/мкл) | 1,25 МКЛ | 50 нг/мкл |
| sgRNA (50 мкм) | 1,25 МКЛ | 5 МКМ |
| Cas9 (61 мкм) | 1.03 МКЛ | 5 МКМ |
| Окончательный объем | 12,5 МКЛ | ---- |
Таблицы 1. ТРИФОСФАТЫ Cas9 RNP инъекции микс. Все реагенты должны быть вновь приостановлено в свободной от нуклеиназы ddH2O. РНКазы бесплатные методы должны использоваться при обработке реагентов и когда делать инъекции микс.
| Реагент | [Последний] |
| KCl | 50 мм |
| Трис-HCl рН 8.3 | 10 мм |
| 2 MgCl | 2.5 мм |
| NP-40 | 0,45% |
| Tween-20 | 0,45% |
| Протеиназы K | 1 мг/мл |
В таблице 2. Рецепт буфера Lysis червя. Протеиназы K должны быть добавлены свежие перед каждым использованием.
| Реагент | 1 x | 24 x |
| 2 x Q5 Mastermix | 12,5 МКЛ | 300 МКЛ |
| Грунтовка F1 (10 мкм) | 1,25 МКЛ | 30 МКЛ |
| Грунтовка R1 (10 мкм) | 1,25 МКЛ | 30 МКЛ |
| Лизис червь | 4 МКЛ | ---- |
| ddH2O | 6 МКЛ | 144 МКЛ |
| Окончательный объем | 25 МКЛ | 504 МКЛ |
В таблице 3. PCR Mastermix. Mastermix PCR должна быть смешанной, хорошо закупорить до тех пор, пока решение однородной. 21 мкл ПЦР mastermix следует добавить чистый ПЦР трубки, а затем следует добавить 4 мкл отдельных червя lysate правильно помечены трубы.
| Реагент | 1 x | 24 x |
| 10 x буфер фермента | 2 МКЛ | 48 МКЛ |
| Реакция уборка PCR | 10 МКЛ | ---- |
| ddH2O | 7 МКЛ | 168 МКЛ |
| Энзима ограничения (10 U/мкл) | 1 МКЛ | 24 МКЛ |
| Окончательный объем | 20 МКЛ | 240 МКЛ |
Таблица 4 . Mastermix энзима ограничения. Mastermix энзима ограничения должна быть смешанной, хорошо закупорить до тех пор, пока решение однородной. 10 мкл mastermix энзима ограничения следует добавить 10 мкл очищенный продукт PCR
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ТРИФОСФАТЫ-Cas9 система является мощным и эффективным инструментом для точного изменения генома модельных организмов. Здесь мы демонстрируем, что химерных sgRNAs20 в сочетании с ssODN HDR шаблоны включить высокоэффективных поколения геномной точечные мутации в C. elegans. Важно отметить, что мы демонстрируем, что RNP доставки производит высокую эффективность редактирования, когда флуоресценции используется в качестве совместного выбора маркера, подчеркивая простоту и надежность техники.
Большинство методов ТРИФОСФАТЫ-Cas9 для инженерных генома C. elegans полагаются на конкретных генетических стола или co ТРИФОСФАТЫ стратегии1. Co ТРИФОСФАТЫ метод оказался невероятно полезный инструмент, который увеличивает вероятность получения успешных генома редактирования. Однако co ТРИФОСФАТЫ методы требуют введения фенотип выбор редактирования в локусе маркер, который обогащает для изменения генома интерес. В то время, как мощные, представляя выбора мутации фенотип подшипник может быть нежелательным, если напрягаться, чтобы редактировать или желаемого Точечная мутация интерес сам exhibits фенотипов, которые может быть усугубляется или подавлены фенотипом маркер. Кроме того co ТРИФОСФАТЫ стратегии требуют создания дополнительной двойной нити перерыв в локусе маркер, который может способствовать эффекты-целевой. Здесь мы представляем метод, использующий переходных люминесцентных маркер, который не только служит для идентификации успешно вводят P0 животных, но и насыщает для надлежащего генома правок. Наши данные показывают, что этот метод значительно обогащает для успешно редактировать животных по сравнению с не люминесцентные животных и предоставляет ряд отличительных преимуществ: 1) один ориентации участкам sgRNA требуется, только 2) 5 раз снижение Cas9 и sgRNA концентрация, 3) выбор напряжения и фенотип независимость и 4) Номинальный скрининг нагрузки (~ 24 F1s). Надежные ТРИФОСФАТЫ-Cas9 изменения генома в поколении1 F было отмечено, с помощью этого метода. Примечательно ПЦР ограничение на основе ферментов стратегию обнаружения описал позволяет однозначно обнаружение моно - и Би аллельные отредактированный животных в поколении1 F. Наконец, стратегия генотипирования облегчает выявление потенциальных indel мутаций, которые можно наблюдать как группа ПЦР сдвиги, когда по сравнению с N2 элементов управления, которые либо не восприимчивы к доходности комплекс или ограничение дайджест полос, когда переваривается.
Появление следующего поколения последовательности, наряду с крупных масштабах геномной усилия ускорился выявления геномной вариантов, которые отделить с болезнью21. Однако функциональные тесты патогенности не были продемонстрированы для большинства вариантов в системах сотовой и научные модели. В этом исследовании, мы ориентированы дерново-1 гена в C. elegans представить широко изучены ALS-связанные SOD-1G93A мутации. На сегодняшний день, эта мутация моделируется и учился в C. elegans и мышей, главным образом с помощью трансгенных гиперэкспрессия. Хотя гиперэкспрессия вариантов в животных моделях могут резюмировать ключ сотовой, молекулярной и поведенческие аспекты болезни, становится все более очевидным, что «доза» является смягчающим фактором в определении фенотипов22. Например высокие копии номер SOD-1G93A мышей, перевозящих ~ 24 копии мутантного гена человеческой SOD-1 экспонат болезни значительно ускоренный курс по сравнению с дерново-1G93Adl мышей, которые несут только ~ 8-10 копий23,24. Здесь мы показываем, что наш основанный ТРИФОСФАТЫ-Cas9 RNP метод может быть использован для быстро создавать человека связанные вариант мутации в гене orthologous червь без трансгенных гиперэкспрессия, в попытке более точно реплицировать генетические контекст болезни. Наш метод обеспечивает возможности платформы для производства и испытания геномной варианты неизвестное значение в контексте внутреннего регулирования и выражение, которое исключает пределы гиперэкспрессия. Наконец мы также использовали этот метод помечать эндогенного генов с флуоресцентные белки (т.е. GFP), которые обеспечат дополнительный инструмент для визуализации, как варианты влияют на локализации протеина, агрегации и оборот.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Мы благодарим членов Beg лаборатории для критических чтении этой рукописи. Штаммы были предоставлены центром генетики Caenorhabditis , который финансируется Управлением NIH инфраструктуры научно-исследовательских программ (P40 OD010440). Исследования в лаборатории Beg поддерживается грантов из низ (R01 NS094678) и ассоциации мышечной дистрофии (MDA382300) A.A.B.
Acknowledgments
Существует без конфликтов интересов, связанных к настоящему докладу.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CRISPRevolution sgRNA EZ Kit | Synthego Inc. | chimeric sgRNA | |
| Nuclease-free TE | Synthego Inc. | provided with the sgRNA kit EZ kit | |
| Nuclease-free water | Synthego Inc. | provided with the sgRNA kit EZ kit | |
| 4 nmole Ultramer DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | ssODN HDR template | |
| Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLS | Integrated DNA Technologies | 1078728 | Cas9 protein |
| pCFJ90 | Addgene | 19327 | Pmyo-2::mCherry Marker Plasmid |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| DNA Clean & Concentrator | Zymo Research | D4004 | |
| Zymoclean Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4002 | |
| Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs | M0494L | |
| Proteinase K | Sigma | P2308 | |
| Glass Borosilicate Glass Micropipettes | Sutter Instruments | BF100-78-10 | OD: 1.0mm. ID: 0.78mm |
| Trizma Hydrochloride | Sigma | T5941 | |
| MgCl2 | Sigma | M2393 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| RNaseZap Decontamination Solution | Fisher Scientific | AM9780 |
References
- Dickinson, D. J., Goldstein, B. CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering. Genetics. 202, 885-901 (2016).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346, 1258096 (2014).
- Ma, D., Liu, F. Genome Editing and Its Applications in Model Organisms. Genomics Proteomics Bioinformatics. 13, 336-344 (2015).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 32, 347-355 (2014).
- Kim, H. M., Colaiacovo, M. P. CRISPR-Cas9-Guided Genome Engineering in C. elegans. Curr Protoc Mol Biol. 115, 31-31 (2016).
- Yin, H., Kauffman, K. J., Anderson, D. G. Delivery technologies for genome editing. Nat Rev Drug Discov. 16, 387-399 (2017).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 24, 1012-1019 (2014).
- Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biol. 17, 148 (2016).
- Paix, A., Folkmann, A., Seydoux, G. Precision genome editing using CRISPR-Cas9 and linear repair templates in C. elegans. Methods. , (2017).
- Prior, H., Jawad, A. K., MacConnachie, L., Beg, A. A. Highly Efficient, Rapid and Co-CRISPR-Independent Genome Editing in Caenorhabditis elegans. G3 (Bethesda). 7, 3693-3698 (2017).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. PCR: The Polymerase Chain Reaction. J Vis Exp. , (2017).
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J Vis Exp. , (2008).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests. J Vis Exp. , (2017).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. DNA Gel Electrophoresis . J Vis Exp. , (2017).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Gel Purification. J Vis Exp. , (2017).
- Estrada-Rivadeneyra, D. Sanger sequencing. FEBS J. , (2017).
- Ludolph, A. C., Brettschneider, J., Weishaupt, J. H. Amyotrophic lateral sclerosis. Curr Opin Neurol. 25, 530-535 (2012).
- Evans, T. C. WormBook. , The C. elegans Research Community, WormBook. (2006).
- Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-821 (2012).
- Boyd, S. D., et al. A Balanced Look at the Implications of Genomic (and Other "Omics") Testing for Disease Diagnosis and Clinical Care. Genes (Basel). 5, 748-766 (2014).
- Saccon, R. A., Bunton-Stasyshyn, R. K., Fisher, E. M., Fratta, P. Is SOD1 loss of function involved in amyotrophic lateral sclerosis? Brain. 136, 2342-2358 (2013).
- Acevedo-Arozena, A., et al. A comprehensive assessment of the SOD1G93A low-copy transgenic mouse, which models human amyotrophic lateral sclerosis. Dis Model Mech. 4, 686-700 (2011).
- Gurney, M. E., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264, 1772-1775 (1994).
