C. एलिगेंस में जीनोमिक पॉइंट म्यूटेंट पैदा करने के लिए एक रैपिड और सतही पाइपलाइन का उपयोग CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins
Summary
यहाँ, हम CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins और समरूपता निर्भर मरम्मत टेम्पलेट्स का उपयोग कर C. एलिगेंस के जीनोम को इंजीनियर करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं.
Abstract
संकुल नियमित रूप से interspersed palindromic दोहराता (CRISPR)-CRISPR-जुड़े प्रोटीन 9 (Cas9) prokaryotic अनुकूली प्रतिरक्षा सुरक्षा प्रणाली को सह गया है सटीक eukaryotic जीनोम इंजीनियरिंग के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में चुना । यहां, हम एक तेजी से और सरल विधि chimeric एकल गाइड RNAs (sgRNA) और CRISPR-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs) में जीनोमिक बिंदु उत्परिवर्तनों के कुशल और सटीक पीढ़ी के लिए का उपयोग कर वर्तमान में सी. एलिगेंस। हम sgRNA लक्ष्य चयन, समरूपता-निर्देशित मरंमत (HDR) टेंपलेट डिजाइन, CRISPR-Cas9-RNP और वितरण, और एक genotyping रणनीति है कि सही ढंग से संपादित पशुओं के मजबूत और तेजी से पहचान को सक्षम बनाता है के लिए एक पाइपलाइन का वर्णन । हमारे दृष्टिकोण न केवल सतही पीढ़ी और वांछित जीनोमिक बिंदु उत्परिवर्ती पशुओं की पहचान परमिट, लेकिन यह भी उच्च दक्षता और एक कम स्क्रीनिंग कार्यभार के साथ लगभग 4-5 दिनों में अंय जटिल indel alleles का पता लगाने की सुविधा ।
Introduction
हाल ही में तकनीकी प्रगति मौलिक बदल दिया है और ठीक इंजीनियर जीनोम करने की क्षमता में तेजी लाने के । विशेष रूप से, CRISPR-Cas9 प्रणाली है, जो आरएनए-निर्देशित endonuclease Cas9 पर निर्भर करता है एक डबल किनारा तोड़ (ब्याज के लक्ष्य अनुक्रम के पास DSB) प्रेरित करने के लिए, बड़े पैमाने पर सही ढंग से इस्तेमाल किया मॉडल जीवों के बहुमत के जीनोम इंजीनियर करने के लिए इस्तेमाल किया गया है बायोमेडिकल रिसर्च1,2,3,4. गौरतलब है कि CRISPR-Cas9 के इस्तेमाल से सी. एलिगेंस5जैसी मुश्किल प्रजातियों में भी जीनोम का संपादन खुला है. प्रजातियों की परवाह किए बिना, CRISPR-Cas9 आधारित जीनोम संपादन प्रणाली के साथ बिंदु उत्परिवर्तन पैदा तीन कोर घटकों पर निर्भर करता है: 1) Cas9 endonuclease, 2) एक एकल गाइड आरएनए (sgRNA) है कि एक लक्ष्य अनुक्रम को Cas9 endonuclease निर्देशन, और 3) एक उपयोगकर्ता डिजाइन समरूपता-निर्देशित मरंमत (HDR) टेंपलेट जिसमें ब्याज2का वांछित संपादन शामिल है ।
ऐसी कई विधियाँ हैं जिनका उपयोग प्लाज्मिड, आरएनए, और वायरल-आधारित डिलीवरी पद्धतियों6सहित कक्षों में लक्ष्यीकरण sgRNA और Cas9 nuclease को लागू करने के लिए किया जा सकता है. हाल ही में, पूर्व के प्रत्यक्ष वितरण परिसर में sgRNA-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs) CRISPR-Cas9 आधारित जीनोम संपादन में एक शक्तिशाली और कुशल उपकरण के रूप में उभरा है7। पूर्व परिसर CRISPR-Cas9 RNPs के प्रत्यक्ष प्रसव के कई विशिष्ट लाभ है, अर्थात्: 1) RNPs बाईपास सेलुलर प्रतिलेखन और अनुवाद के लिए की जरूरत है, 2) RNPs तेजी से साफ कर रहे हैं, जो उपलब्ध समय को कम करने के लिए विशिष्टता बढ़ सकता है बंद लक्ष्य दरार, और 3) RNPs यादृच्छिक एकीकरण के माध्यम से मेजबान जीनोम में गैर देशी दृश्यों की शुरूआत को दरकिनार जो कोई विदेशी डीएनए/ एक साथ, इन विशेषताओं की संभावना एक अल्पकालिक-लक्ष्य CRISPR संपादन के फट रहते हैं, जबकि बंद लक्ष्य प्रभाव कम प्रदान करते हैं ।
हम C. एलिगेंसमें साइट-विशिष्ट जीनोमिक परिवर्तनों को प्रस्तुत करने के लिए एक सरल और कुशल प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं । इस प्रोटोकॉल sgRNA और एकल असहाय oligonucleotide (ssODN) HDR टेंपलेट डिजाइन, sgRNA-Cas9 RNP जटिल और वितरण, और ठीक से संपादित पशुओं की स्पष्ट पहचान के लिए एक genotyping रणनीति लक्ष्यीकरण भी शामिल है । इस रणनीति का प्रयोग, न केवल वांछित साइट विशिष्ट परिवर्तन बरामद किया जा सकता है, लेकिन अंय गैर विशिष्ट indel उत्परिवर्तनों भी बरामद किया जा सकता है । इस प्रकार, हमारी रणनीति एक allelic श्रृंखला के एक एकल रणनीति है, जहां दोनों मोनो allelic, द्वि-allelic, और indel म्यूटेंट एफ में उत्पंन किया जा सकता है का उपयोग कर के उत्पादन की अनुमति1 जनरेशन ।
Protocol
Representative Results
Discussion
CRISPR-Cas9 प्रणाली ठीक मॉडल जीवों के जीनोम को संशोधित करने के लिए एक शक्तिशाली और प्रभावी उपकरण है । यहां, हम प्रदर्शित करते है कि chimeric sgRNAs20 ssODN HDR के साथ युग्मित टेम्पलेट्स सी. एलिगेंसमें जीनोमिक बिंद…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस रिपोर्ट से संबंधित रुचि का कोई टकराव नहीं है ।
Materials
| CRISPRevolution sgRNA EZ Kit | Synthego Inc. | chimeric sgRNA | |
| Nuclease-free TE | Synthego Inc. | provided with the sgRNA kit EZ kit | |
| Nuclease-free water | Synthego Inc. | provided with the sgRNA kit EZ kit | |
| 4 nmole Ultramer DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | ssODN HDR template | |
| Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLS | Integrated DNA Technologies | 1078728 | Cas9 protein |
| pCFJ90 | Addgene | 19327 | Pmyo-2::mCherry Marker Plasmid |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| DNA Clean & Concentrator | Zymo Research | D4004 | |
| Zymoclean Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4002 | |
| Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs | M0494L | |
| Proteinase K | Sigma | P2308 | |
| Glass Borosilicate Glass Micropipettes | Sutter Instruments | BF100-78-10 | OD: 1.0mm. ID: 0.78mm |
| Trizma Hydrochloride | Sigma | T5941 | |
| MgCl2 | Sigma | M2393 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| RNaseZap Decontamination Solution | Fisher Scientific | AM9780 |
References
- Dickinson, D. J., Goldstein, B. CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering. Genetics. 202, 885-901 (2016).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346, 1258096 (2014).
- Ma, D., Liu, F. Genome Editing and Its Applications in Model Organisms. Genomics Proteomics Bioinformatics. 13, 336-344 (2015).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 32, 347-355 (2014).
- Kim, H. M., Colaiacovo, M. P. CRISPR-Cas9-Guided Genome Engineering in C. elegans. Curr Protoc Mol Biol. 115, 31-31 (2016).
- Yin, H., Kauffman, K. J., Anderson, D. G. Delivery technologies for genome editing. Nat Rev Drug Discov. 16, 387-399 (2017).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 24, 1012-1019 (2014).
- Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biol. 17, 148 (2016).
- Paix, A., Folkmann, A., Seydoux, G. Precision genome editing using CRISPR-Cas9 and linear repair templates in C. elegans. Methods. , (2017).
- Prior, H., Jawad, A. K., MacConnachie, L., Beg, A. A. Highly Efficient, Rapid and Co-CRISPR-Independent Genome Editing in Caenorhabditis elegans. G3 (Bethesda). 7, 3693-3698 (2017).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. PCR: The Polymerase Chain Reaction. J Vis Exp. , (2017).
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J Vis Exp. , (2008).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests. J Vis Exp. , (2017).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. DNA Gel Electrophoresis . J Vis Exp. , (2017).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Gel Purification. J Vis Exp. , (2017).
- Estrada-Rivadeneyra, D. Sanger sequencing. FEBS J. , (2017).
- Ludolph, A. C., Brettschneider, J., Weishaupt, J. H. Amyotrophic lateral sclerosis. Curr Opin Neurol. 25, 530-535 (2012).
- Evans, T. C. . WormBook. , (2006).
- Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-821 (2012).
- Boyd, S. D., et al. A Balanced Look at the Implications of Genomic (and Other "Omics") Testing for Disease Diagnosis and Clinical Care. Genes (Basel). 5, 748-766 (2014).
- Saccon, R. A., Bunton-Stasyshyn, R. K., Fisher, E. M., Fratta, P. Is SOD1 loss of function involved in amyotrophic lateral sclerosis?. Brain. 136, 2342-2358 (2013).
- Acevedo-Arozena, A., et al. A comprehensive assessment of the SOD1G93A low-copy transgenic mouse, which models human amyotrophic lateral sclerosis. Dis Model Mech. 4, 686-700 (2011).
- Gurney, M. E., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264, 1772-1775 (1994).
