En hurtig og letkøbt Pipeline for generering af genomisk punkt mutanter i C. elegans bruger CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins
Summary
Vi præsenterer her, en metode til at ingeniør genomet af C. elegans ved hjælp af CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins og homologi afhængige reparation skabeloner.
Abstract
De grupperede regelmæssigt spækket palindromiske gentagelser (CRISPR) – CRISPR – forbundet protein 9 (Cas9) prokaryote adaptive immun forsvarssystem har været selvsupplering som et effektivt redskab til præcise eukaryote genom engineering. Vi præsenterer her, en hurtig og enkel metode bruger kimære enkelt guide RNA’er (sgRNA) og CRISPR-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs) til den effektive og præcise generation af genomisk punktmutationer i C. elegans. Vi beskriver en pipeline for sgRNA måludvælgelser, homologi-instrueret reparation (HDR) skabelondesign, CRISPR-Cas9-RNP kompleksbindende og levering og en genotypebestemmelse strategi, der giver mulighed for robust og hurtig identifikation af korrekt redigerede dyr. Vores tilgang ikke blot tillader facile generation og identifikation af ønskede genomisk punkt mutant dyr, men også letter påvisning af andre komplekse indel alleler i ca 4-5 dage med høj effektivitet og en reduceret screening arbejdsbyrde.
Introduction
Seneste teknologiske fremskridt har radikalt forvandlet og accelereret evne til netop ingeniør genomer. Især har CRISPR-Cas9 system, som bygger på den RNA-styrede liv1975 Cas9 til at fremkalde en dobbeltstrenget pause (DSB) nær målet sekvens af interesse, været flittigt brugt til præcist ingeniør genom størstedelen af modelorganismer anvendes i biomedicinsk forskning1,2,3,4. Betydeligt, brugen af CRISPR-Cas9 har ulåst genom-redigering selv i vanskelige arter som C. elegans5. Uanset art, generere punktmutationer med den CRISPR-Cas9 baseret genom-redigering system bygger på tre centrale komponenter: 1) Cas9 endonuklease, 2) en enkelt guide-RNA (sgRNA), der dirigerer Cas9 liv1975 til en target sekvens, og 3) brugeren designet Homologi-instrueret reparation (HDR) skabelon der indeholder den ønskede edit(s) af interesse2.
Der er flere metoder, der kan bruges til at indføre de rettet mod sgRNA og Cas9 nukleasen ind i cellerne herunder plasmid, RNA og viral-baserede levering metoder6. Direkte levering af pre-kompleksbundet sgRNA-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs) har for nylig dukket op som et kraftfuldt og effektivt redskab i CRISPR-Cas9-baseret genom-redigering7. Den direkte levering af pre-kompleksbundet CRISPR-Cas9 RNPs har flere klare fordele, nemlig: 1) RNPs bypass behovet for cellulære transskription og translation, 2) RNPs er hurtigt fjernet, som kan øge specificitet ved reducerer den tilgængelige tid for off-target kavalergang og 3) RNPs indeholder ingen fremmed DNA/RNA elementer, der omgår indførelsen af ikke-hjemmehørende sekvenser i vært genomet gennem tilfældige integration. Sammen, give disse attributter sandsynligvis en kortvarig burst-mål CRISPR redigering samtidig minimere off target effekter.
Vi beskriver en enkel og effektiv protokol til at indføre lokationsspecifikke genomisk ændringer i C. elegans. Denne protokol omfatter rettet mod sgRNA og enkelt strandede oligonukleotid (ssODN) HDR skabelondesign, sgRNA-Cas9 RNP kompleksbindende og levering og en genotypebestemmelse strategi til entydig identifikation af korrekt redigerede dyr. Bruger denne strategi, ikke blot kan de ønskede lokationsspecifikke ændringer inddrives, men andre uspecifikke indel mutationer kan også inddrives. Således, vores strategi tillader generation af en allel serien ved hjælp af en enkelt strategi, hvor både mono-allel, bi-allel, og indel mutanter kan genereres i F1 generation.
Protocol
Representative Results
Discussion
CRISPR-Cas9-systemet er et stærkt og effektivt værktøj til præcist ændre genomet af modelorganismer. Vi viser her, at kimære sgRNAs20 kombineret med ssODN HDR skabeloner aktiver den højeffektive generation af genomisk punktmutationer i C. elegans. Vigtigere, vise vi at RNP levering producerer redigering højeffektiv når fluorescens bruges som fælles udvalg markør, fremhæver den lethed og pålidelighed af teknikken.
Størstedelen af CRISPR-Cas9 metode…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Der er ingen interessekonflikter, der er relateret til denne betænkning.
Materials
| CRISPRevolution sgRNA EZ Kit | Synthego Inc. | chimeric sgRNA | |
| Nuclease-free TE | Synthego Inc. | provided with the sgRNA kit EZ kit | |
| Nuclease-free water | Synthego Inc. | provided with the sgRNA kit EZ kit | |
| 4 nmole Ultramer DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | ssODN HDR template | |
| Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLS | Integrated DNA Technologies | 1078728 | Cas9 protein |
| pCFJ90 | Addgene | 19327 | Pmyo-2::mCherry Marker Plasmid |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| DNA Clean & Concentrator | Zymo Research | D4004 | |
| Zymoclean Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4002 | |
| Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs | M0494L | |
| Proteinase K | Sigma | P2308 | |
| Glass Borosilicate Glass Micropipettes | Sutter Instruments | BF100-78-10 | OD: 1.0mm. ID: 0.78mm |
| Trizma Hydrochloride | Sigma | T5941 | |
| MgCl2 | Sigma | M2393 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| RNaseZap Decontamination Solution | Fisher Scientific | AM9780 |
References
- Dickinson, D. J., Goldstein, B. CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering. Genetics. 202, 885-901 (2016).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346, 1258096 (2014).
- Ma, D., Liu, F. Genome Editing and Its Applications in Model Organisms. Genomics Proteomics Bioinformatics. 13, 336-344 (2015).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 32, 347-355 (2014).
- Kim, H. M., Colaiacovo, M. P. CRISPR-Cas9-Guided Genome Engineering in C. elegans. Curr Protoc Mol Biol. 115, 31-31 (2016).
- Yin, H., Kauffman, K. J., Anderson, D. G. Delivery technologies for genome editing. Nat Rev Drug Discov. 16, 387-399 (2017).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 24, 1012-1019 (2014).
- Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biol. 17, 148 (2016).
- Paix, A., Folkmann, A., Seydoux, G. Precision genome editing using CRISPR-Cas9 and linear repair templates in C. elegans. Methods. , (2017).
- Prior, H., Jawad, A. K., MacConnachie, L., Beg, A. A. Highly Efficient, Rapid and Co-CRISPR-Independent Genome Editing in Caenorhabditis elegans. G3 (Bethesda). 7, 3693-3698 (2017).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. PCR: The Polymerase Chain Reaction. J Vis Exp. , (2017).
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J Vis Exp. , (2008).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests. J Vis Exp. , (2017).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. DNA Gel Electrophoresis . J Vis Exp. , (2017).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Gel Purification. J Vis Exp. , (2017).
- Estrada-Rivadeneyra, D. Sanger sequencing. FEBS J. , (2017).
- Ludolph, A. C., Brettschneider, J., Weishaupt, J. H. Amyotrophic lateral sclerosis. Curr Opin Neurol. 25, 530-535 (2012).
- Evans, T. C. . WormBook. , (2006).
- Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-821 (2012).
- Boyd, S. D., et al. A Balanced Look at the Implications of Genomic (and Other "Omics") Testing for Disease Diagnosis and Clinical Care. Genes (Basel). 5, 748-766 (2014).
- Saccon, R. A., Bunton-Stasyshyn, R. K., Fisher, E. M., Fratta, P. Is SOD1 loss of function involved in amyotrophic lateral sclerosis?. Brain. 136, 2342-2358 (2013).
- Acevedo-Arozena, A., et al. A comprehensive assessment of the SOD1G93A low-copy transgenic mouse, which models human amyotrophic lateral sclerosis. Dis Model Mech. 4, 686-700 (2011).
- Gurney, M. E., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264, 1772-1775 (1994).
