Summary
在这里, 我们提出了一个方法, 以工程的基因组的C. 线虫使用 CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins 和同源依赖修复模板。
Abstract
聚簇定期穿插回文重复 (CRISPR)-CRISPR 相关蛋白 9 (Cas9) 原核自适应免疫防御系统已被联合选择作为一个强大的工具, 精确的真核基因组工程。在这里, 我们提出了一个快速和简单的方法, 使用嵌合体单导 rna (sgRNA) 和 CRISPR-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs), 以有效和精确地产生基因组点突变的C. 线虫。我们描述了一个 sgRNA 目标选择的管道, 同源定向修复 (HDR) 模板设计, CRISPR-Cas9-RNP 络合和交付, 以及一个基因分型策略, 使正确编辑的动物的健壮和快速识别。我们的方法不仅允许简单的生成和识别所需的基因突变动物, 而且还有助于在大约 4-5 天内检测其他复杂的 indel 等位基因, 效率高, 筛选工作量减少。
Introduction
最近的技术进步已经从根本上改变并加速了精确地设计基因组的能力。特别是, 依靠 RNA 引导的限制性 Cas9 在目标序列附近诱导双链断裂 (CRISPR-Cas9) 的系统, 已被广泛地用于精确地设计大多数模型生物体的基因组, 用于生物医学研究1,2,3,4。重要的是, 即使在诸如线虫5这样的困难物种中, CRISPR-Cas9 的使用也没有锁定基因组编辑。无论物种, 产生点突变与基于 CRISPR-Cas9 的基因组编辑系统依赖于三核心组件: 1) Cas9 限制性, 2) 一个单一的指南 RNA (sgRNA), 指示 Cas9 限制性到目标序列, 3) 用户设计同源定向修复 (HDR) 模板, 其中包含所需的感兴趣的编辑2。
有几种方法可用于将靶向 sgRNA 和 Cas9 核酸酶引入细胞, 包括质粒、RNA 和基于病毒的传递方法 6.最近, 在 CRISPR-Cas9-based 基因组编辑7中, 直接交付预复合 sgRNA-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs) 已成为一个强大而有效的工具。预复杂 CRISPR-Cas9 RNPs 的直接传递有几个明显的优点, 即: 1) RNPs 绕过细胞转录和翻译的需要, 2) RNPs 迅速清除, 这可能会增加特异性通过减少可用时间离靶解理和 3) RNPs 不包含外来的 DNA/RNA 元素, 通过随机积分绕过非本机序列引入宿主基因组。在一起, 这些属性可能会提供一个短暂的 CRISPR 的目标编辑, 同时尽量减少目标效果。
我们描述了一种简单有效的协议, 用于在C. 线虫中引入特定于站点的基因组变化。该协议包括目标 sgRNA 和单链寡核苷酸 (ssODN) HDR 模板设计, sgRNA-Cas9 RNP 络合和交付, 以及一个基因分型策略, 以明确识别正确编辑的动物。使用此策略, 不仅可以恢复所需的站点特定更改, 而且还可以恢复其他非特定的 indel 突变。因此, 我们的策略允许使用单一的策略生成一个二等位序列, 在这个方法中, 可以在 F1生成中生成单位、双位和 indel 突变体。
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Protocol
所有动物关心和实验规程跟随了指南从国立卫生研究院和机构动物关心和使用委员会 (IACUC) 在密执安大学。在整个协议中使用无 RNase 的解决方案和吸管提示。按照制造商指南 (请参阅材料表), 清洁工作区、吸管、管子和离心机, RNase 净化解决方案。
1. sgRNA 目标选择
- 使用 web 浏览器打开网页: http://crispor.tefor.net8
- 输入 ~ 60 基对 (bp) 的序列侧翼所需的编辑兴趣 (即30 bp 5 ' 和 3 ' 的预期编辑)。
- 从下拉菜单中选择秀丽线虫基因组。
- 从下拉菜单中选择 Protospacer 相邻的主题 (20 bp-NGG-SpCas9、SpCas9-HF1、eSPCas9 1.1)。
- 单击 "提交"。在 "结果" 页中, 选择最接近编辑兴趣的排名最高的目标序列。如果在侧翼 60 bp 输入序列中没有合适的目标站点, 请将查询序列扩展到 100 bp (即50 bp 在所需编辑的任意一侧)。
- 从可用源 (例如synthego) 获得一个20的目标 sgRNA, 其规格如下: 3 nmol;没有修改。
- 在收到后, 离心机冻干 sgRNA 含管在 > 1.2万 x g 1 分钟室温。添加60µL 的核酸酶的管, 并轻轻地重新悬浮吹打向上和向下 15-20 次使用 P200 吸管。最后浓度为50µM。
2. 同源导向修复模板设计
- 设计一个 ssODN HDR 模板, 其中包含: 1) 兴趣的变异, 2) 一个独特的框架内限制限制性站点, 3) NGG PAM 序列中的一个或两个 Gs 的无声突变, 4) 50 bp 5 ' 和 3 ' 同源武器侧翼的第一个和最后一个突变。(图 1C)9,10。
- 如果 NGG PAM 序列的突变是不可能的, 在 sgRNA 目标识别序列中引入 5-6 个无声突变, 以防止 sgRNA 介导的 ssODN HDR 模板的分裂。
- 从可用的源例如idtdna 获得一个具有以下参数的 "Ultramer DNA 寡核苷酸": 比例: 4 nmol;配方: 无;净化: 标准脱盐。
- 在收到后, 离心机冻干 ssODN 含管在 > 1.2万 x g 1 分钟室温。使用吹打吸管, 轻轻地将 ssODN 重新挂起至100µM 的最后浓度 (核酸酶 ddH 2 O), P200 15-20 倍.
3. 设计基因分型底漆
- 设计一个在基因组修改侧翼的引物集, 以生成一个〜 400-700 bp PCR 扩增子11。
- 优化 PCR 循环条件以生成单个和特定的扩增子11。
4. 准备注塑混合料
- 离心机表 1试剂的最大速度为2分钟4摄氏度。
- 按照列出的顺序, 将表 1试剂添加到无核酸酶的 PCR 管中。
- 用 P20 吸管轻轻吹打上下10次, 彻底混合。
- 在室温下孵育注射混合剂10分钟。
5. 注塑协议
- 加载注入微, 大约有一半的注入混合12。在注射针头堵塞或断裂时, 保存剩余的注射组合。
- 中断微提示, 使 ~ 20-30 每平方产生一个渐进流动的解决方案 12.
注: 较大的直径提示对动物健康有负面影响, 降低了1子代产量。 - 如果可能的话, 在两种性腺武器中注射 10-15 只幼虫 (12)。如果不是, 注射入一个性腺胳膊是充足的。
- 允许注射动物 (P0) 在 OP50-seeded 35 毫米线虫生长培养基 (NGM) 板上的室温下恢复 1-2 小时。随后, 单一注入 P0动物到单独 OP50-seeded 35 毫米 NGM 板使用白金线蠕虫挑选12。
6. 屏幕 P0板和单 mCherry (+) F1s
- 注射后两天, 识别含有 F1子代的 P0板, 使用荧光显微镜 (图 1D, 天 2-3) 表示咽 mCherry。选择0板 , 其中包含最 mCherry ( + ) F1动物。
- 从三选择的 P0板块, 单 8-12 mCherry (+) f1动物总计24-36 个 mCherry (+) f1s 使用蠕虫拾取 (图 1D, 天 2-3)。
注: mCherry (-) 动物也可以被单独从这些 P0板块, 但识别正确编辑的动物的可能性要低得多 (图 2A)。 - 允许单个 F1s 自受精, 在室温下产卵 1-2 天。
7. 单蠕虫 PCR 和基因分型
- 在产卵 1-2 天后, 使用蠕虫拾取 (表 2,图 1D, 天 4-5) 将 F1转换为单独的 PCR 带管帽, 其中含有7µL 的蠕虫裂解缓冲器。
- 离心 PCR 管以最大速度在室温下1分钟将动物带到管底, 并在-80 摄氏度冷冻管1小时。
注意: 蠕虫可以无限期地存储在-80 摄氏度。 - 溶解冷冻蠕虫在一个 thermocycler 使用以下程序:60 °c 为60分钟, 95 °c 为15分钟, 4 °c 举行。
- 设置 PCR mastermix, 如表 3所示。
- 将 pcr mastermix 的21µL 添加到干净的 pcr 管中, 然后从步骤3中添加4µL 的蠕虫裂解。混合使用吸管和运行 PCR 程序后, 制造商的指导方针 (见材料表)。
- 根据制造商的说明 (请参阅材料表), 使用 DNA 清洁浓缩试剂盒纯化 PCR 反应。洗脱 DNA 通过增加10µL 水的旋转柱。
- 设置限制酶 mastermix, 如表 4所示。
- 添加10µL 的限制酶 mastermix 的每一个清洁 PCR 反应和孵化 1-2 小时在37摄氏度13。
- 使用1x 三乙酸乙酯-EDTA (泰) 缓冲器14, 在1.5% 琼脂糖凝胶上分离消化 PCR 产物, 运行于 120 V。
8. 被编辑的动物的识别和序列验证
- 检查酶消化样品是否存在表明可能被编辑的动物14 (图 1D, 天 4-5) 的带。
注: 加载一个 N2 控制, 以确定潜在的 indel 突变, 可以观察到的变化, 在带大小和/或意外和复杂的限制酶消化带状模式。 - 在鉴定可能的被编辑的动物之后, 使用剩余的3µL 蠕虫裂解并且重复 PCR 反应。不清除或限制酶消化 PCR 反应后, 程序完成。在1% 琼脂糖凝胶上加载 PCR 反应, 用凝胶萃取套件15分离和提取带 (参见材料表)。
- 桑格序列16凝胶提取 DNA 使用 F1 底漆识别正确编辑的动物 (图 1A)
注: 杂合子读将包含覆盖的峰值由于存在的野生类型和工程的等位基因。 - 从经验证的异型编辑动物中获得纯合动物, 单 8-12 F2动物并执行步骤 7-8。
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Representative Results
人类超氧化物歧化酶 1 (SOD1) 的突变占家庭肌萎缩侧索硬化症的 10-20%, 这是一种破坏性的神经退行性疾病, 总是导致瘫痪和死亡17。人类 SOD-1 是一个进化保守的蛋白质共享55% 的身份和70% 相似性与线虫SOD-1 蛋白 (图 1B)。为了演示 CRISPR-Cas9 RNP 方法的简便性、可行性和有效性, 我们针对sod-1 线虫基因引入了蠕虫基因组中与疾病相关的人类 G93A 变体 (图 1A)。
为了在 G93A 基因组中设计突变体, 选择了一个 sgRNA, 其 PAM 识别站点位于 G93 密码子 ( 图 1C) 上游的 3 bp。我们设计了一个 ssODN HDR 修复模板, 包含: 1) 核苷酸变化转换 G93 密码子到 A93 (GGA), 2) 沉默的变化 NGG PAM 序列 (CGG CAG), 以防止 sgRNA-Cas9-mediated 分裂的 HDR 模板, 3) 无声的突变 (CT),介绍了一种独特的 HindIII 限制酶站点, 用于基因分型, 4) 50 bp 5 ' 和 3 ' 同源臂 (图 1C)。pcr 底漆集 (F1-R1) 设计用于在 N2 控件中生成单 592 bp pcr 产品 (图 1A)。含有 sgRNA、Cas9、ssODN 和荧光标记质粒 (pCFJ90) 的注射混合物混合在一起, 在室温下孵化10分钟, 并装入微注射吸管中。
图 1D描述了注入组合加载到注入微后的工作流。在0天, 10-15 P0动物注射在一个或两个性腺武器使用标准显微注射技术18,19。注射的动物恢复 1-2 小时, 然后单独镀在 OP50-seeded NGM 板上。2-3 天后, 成功的 P0注射由那些具有 mCherry (+) F1子代的人确定。为后续分析选择了前0板 (即那些具有最大数量的 mCherry ( + ) F1s ) 。从这三个板块 (P0-8, p0-10, P0-12), 8 mCherry (+) F1s 被单独地单独 OP50-seeded 35 毫米 NGM 板材一共 24 mCherry (+) F1s。2-3 天的产卵 (天 4-5), 个别 F1s 转移到 PCR 管含有蠕虫裂解缓冲和冻结1小时在-80 摄氏度。随后, F1s 被裂解, 以释放基因组 DNA, 并受到 PCR。PCR 产物被纯化和消化用 HindIII 1 小时, 并运行在1.5% 琼脂糖凝胶, 以确定潜在的编辑动物。在正确编辑的动物中, HindIII 消化将全长 PCR 产品 (592 bp) 切割成两个带 370 bp 和 222 bp。这种基因分型策略明确区分野生类型 (592 bp), 杂合子 (592, 370, 222 bp) 和纯合体 (370, 222 bp) 动物。图 2A说明了 24 mCherry (+) 动物的基因分型结果。
为了证明荧光 mCherry 标记丰富的基因组修改 , 我们也从0板块中挑选出 8 mCherry ( - ) 动物。在 24 mCherry (+) F1的筛选 (红色条) 中, 10 包含单位基因或双位基因修饰 (42%), 10 为野生型 (42%), 3 为潜在 indels (13%), 有1个 PCR 失败 (图 2A)。相比之下, 24 mCherry (-) F1的筛选, 只有1种动物被正确修改 (4%); 而, 23 是野生类型 (96%)(图 2A)。图 2B显示了从全长凝胶萃取 PCR 产品 (F18-6) 中提取的色谱, 证明在 ssODN HDR 模板中设计的精确核苷酸变化被忠实地纳入了这种纯合 F 的基因组中。1动物。值得注意的是, F1动物10-7、10-8 和12-3 展示了意想不到的 PCR 产品大小和限制摘要带模式, 表明这些动物可能携带复杂的 indel 突变 (图 2A)。因此, 我们的方法不仅能够产生理想的基因组修改 (s) 的易用性, 效率和保真度, 但也允许鉴定和恢复独特的 indel 等位基因, 可能会导致重要的和意想不到的洞察到基因功能。
图 1.CRISPR-Cas9 工程 C. 线虫sod-1 轨迹.(A)示意图, 描述 C. 线虫中sod-1轨迹的外显子-内含子结构。红条表示 G93 在外显子3中的位置。底漆对集由红色箭头 (F1-R1) 指出。(B) 人类和C. 线虫(蠕虫) SOD-1 蛋白的序列对齐。目标 G93 残留物以红色突出显示。(C) Top, 围绕 G93 密码子的一组基因组 DNA 被显示为参考, 并突出显示 PAM (绿色) 和 sgRNA 目标 (蓝色) 站点。下, 单链式寡核苷酸 (ssODN) 同源定向修复 (HDR) 模板显示包含: 密码子编辑改变 G93 到 A93, 一个无声的改变 PAM 的主题, 以防止分裂的 sgRNA-Cas9 复杂, 一个无声的变化介绍一个独特的 HindIII 限制酶站点 (黄色框), 和侧翼 5 ' 和 3 ' 50 bp 同源武器 (黑条)。ssODN 中设计的所有核苷酸变化都被高亮显示为红色。(D) 用于生成和识别基于 CRISPR-Cas9 RNP 点突变体的管线的示意图说明。在0天, 注入 10-15 P0动物与注射混合。在 2 - 3 天 , 识别成功注入了 P0动物由那些包含荧光 F1后裔 , 并且选择0板与最荧光的后裔。从每个0板块 , 单 8 荧光 F1子代。在 4-5 天, (a) 步骤1中, 将单个 F1s 选取并放入含有裂解缓冲的 PCR 管中;(b) 步骤 2, 在-80 摄氏度结冰后, 含有 F1蠕虫的 PCR 管裂解释放基因组 DNA, 用作 pcr 模板。然后用独特的限制酶对 PCR 产物进行清洗和消化;(c) 步骤 3, 酶消化产物在琼脂糖凝胶上解决, 其中野生型 (++)、异型 (米/+) 和纯合 (m/米) 动物可以通过限制性摘要带模式识别。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2. sod-1 (G93A) 变种人的基因分型数据.(A)F 的凝胶图像1单独裂解、PCRed 和 HindIII 消化的动物。对每个 P0板块 (p0-8, p0-10, p0-12), 8 mCherry (+) 和 8 mCherry (-) F1动物进行了分析。两个单位基因 (蓝色数字) 和双位基因 (红色数字) 被编辑的动物被恢复了。大小转移 PCR 产品或意想不到的 HindIII 消化带也恢复了指示 indel 突变体 (黄色数字)。N2 控制作为 PCR 产品上浆和酶特异性的参考。(B) Top、密码子间距和氨基酸翻译显示在上面, 用于野生类型 (G93A) 和下面的用于修饰的链。所需的编辑由红色框突出显示, 创建框架内 HindIII 限制站点的静默更改将由黄色框突出显示。所有设计的核苷酸变化都以粗体显示。下, 代表色谱从纯合 F1动物8-6。请单击此处查看此图的较大版本.
| 试剂 | 体积 | 最终浓度 |
| ddH2O | 6.3 ul | ---- |
| 氯化钾 (4M) | 0.94 ul | 300毫米 |
| HEPES (0.5M) pH 值7。4 | 0.5 ul | 20毫米 |
| pCFJ90 (25 ng/ul) | 1.25 ul | 2.5 ng/ul |
| ssODN (500 ng/ul) | 1.25 ul | 50 ng/ul |
| sgRNA (50 微米) | 1.25 ul | 5微米 |
| Cas9 (61 微米) | 1.03 ul | 5微米 |
| 最终音量 | 12.5 ul | ---- |
表1。CRISPR-Cas9 RNP 注射液混合。所有试剂应在无核酸酶 ddH 2 中重新挂起 O. 在处理试剂和注射混合时, 应使用 RNase 免费技术.
| 试剂 | 最后] |
| 氯化钾 | 50毫米 |
| 三盐酸 pH 值8。3 | 10毫米 |
| 氯化镁2 | 2.5 毫米 |
| NP-40 | 0.45% |
| Tween-20 | 0.45% |
| 蛋白酶 K | 1毫克/毫升 |
表2。蠕虫裂解缓冲配方。蛋白酶 K 在每次使用前应加新鲜。
| 试剂 | 1x | 24x |
| 2X Q5 Mastermix | 12.5 ul | 300 ul |
| 底漆 F1 (10 微米) | 1.25 ul | 30 ul |
| 底漆 R1 (10 微米) | 1.25 ul | 30 ul |
| 蠕虫裂解 | 4 ul | ---- |
| ddH2O | 6 ul | 144 ul |
| 最终音量 | 25 ul | 504 ul |
表3。PCR Mastermix。PCR mastermix 应混合良好, 吹打, 直到溶液是均匀的。21µL 的 pcr mastermix 应添加到清洁 pcr 管, 然后4µL 的个别蠕虫裂解应添加到正确标记的管。
| 试剂 | 1x | 24x |
| 10X. 酶缓冲剂 | 2 ul | 48 ul |
| 清洁 PCR 反应 | 10 ul | ---- |
| ddH2O | 7 ul | 168 ul |
| 限制酵素 (10 U 或 ul) | 1 ul | 24 ul |
| 最终音量 | 20 ul | 240 ul |
表4。限制酶 Mastermix。限制酶 mastermix 应混合良好, 吹打, 直到溶液是均匀的。10µL 的限制酶 mastermix 应添加到10µL 的清洁 PCR 产品
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Discussion
CRISPR-Cas9 系统是精确修改模型生物体基因组的有力而有效的工具。在这里, 我们演示了嵌合体 sgRNAs20与 ssODN HDR 模板结合在一起, 使得在C. 线虫中高效地生成基因组点突变。重要的是, 我们表明, RNP 交付产生高编辑效率时, 荧光作为一个联合选择标记, 突出的易用性和可靠性的技术。
C. 线虫基因组工程的大多数 CRISPR-Cas9 方法都依赖于特定的遗传背景或 CRISPR 策略1。CRISPR 方法已被证明是一个非常有用的工具, 增加了获得一个成功的基因组编辑的可能性。然而, CRISPR 方法需要引入一个表型可选择的编辑在一个标记的轨迹, 丰富的基因组编辑的兴趣。虽然功能强大, 引入可选择的表型-轴承突变可能是不可取的, 如果要编辑的应变或所期望的点突变本身显示的表型, 可能会加剧或抑制的标志式。此外, CRISPR 策略需要在标记轨迹上创建一个额外的双链断裂, 这可能会导致非目标效应。在这里, 我们提出一个方法, 使用瞬态荧光标记, 不仅有助于识别成功注入 P0动物, 但也丰富了正确的基因组编辑。我们的数据表明, 这种方法大大丰富了成功地编辑动物与非荧光动物相比, 并提供了几个明显的优势: 1) 只有一个针对特定地点的 sgRNA, 2) 5 倍的减少 Cas9 和sgRNA 浓度, 3) 菌株和表型选择的独立性, 和 4) 的标称筛选工作量 (~ 24 F1s)。使用此方法观察了在 F1生成中的健壮 CRISPR-Cas9 基因组编辑。值得注意的是, 基于 PCR 限制酶的检测策略可以在 F1生成中明确检测单和双位基因编辑的动物。最后, 基因分型策略有助于识别潜在的 indel 突变, 这可以观察为 PCR 带转移时, 与 N2 控制, 这是不容易受限制消化或产生复杂的波段时消化。
下一代测序的出现以及大规模基因组的努力加速了与疾病21隔离的基因组变体的识别。然而, 在细胞和生物体模型系统中, 对致病性的功能测试并没有证明大多数变种。在本研究中, 我们针对C. 线虫中的sod-1基因引入了广泛研究的 ALS 相关 SOD-1G93A突变。到目前为止, 这种突变已经被建模和研究在线虫和小鼠主要使用转基因过度表达。虽然在动物模型中过度表达的变异可能会重述疾病的关键细胞、分子和行为方面, 但越来越清楚的是, "剂量" 是确定表型22的一个情有可原的因素。例如, 高拷贝号 SOD-1G93A小鼠携带了24个变种人 SOD-1 基因的副本, 与 SOD-1G93Adl小鼠相比, 它的发病率大大加快, 这一过程只携带了 8-10 拷贝23,24。在这里, 我们证明, 我们的 CRISPR-Cas9 RNP 方法可以用来迅速产生人类变异相关突变的同源蠕虫基因不需要转基因过度, 以努力更精确地复制基因疾病的背景。我们的方法提供了一个可行的平台, 以产生和测试未知意义的基因组变体在内源性调控和表达, 这排除了过度表达的范围。最后, 我们也使用这种方法来标记内源基因与荧光蛋白 (即GFP), 这将提供一个额外的工具, 以可视化如何影响蛋白质的定位, 聚合和营业额。
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Disclosures
我们感谢乞求实验室的成员对这篇手稿的批判性阅读。菌株由由 NIH 研究基础设施项目办公室 (P40 OD010440) 资助的秀丽遗传学中心提供。在乞讨实验室的研究得到了 NIH (R01 NS094678) 和肌肉营养不良协会 (MDA382300) 提供的资助, 以 A.A.B。
Acknowledgments
没有与本报告有关的利益冲突。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CRISPRevolution sgRNA EZ Kit | Synthego Inc. | chimeric sgRNA | |
| Nuclease-free TE | Synthego Inc. | provided with the sgRNA kit EZ kit | |
| Nuclease-free water | Synthego Inc. | provided with the sgRNA kit EZ kit | |
| 4 nmole Ultramer DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | ssODN HDR template | |
| Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLS | Integrated DNA Technologies | 1078728 | Cas9 protein |
| pCFJ90 | Addgene | 19327 | Pmyo-2::mCherry Marker Plasmid |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| DNA Clean & Concentrator | Zymo Research | D4004 | |
| Zymoclean Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4002 | |
| Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs | M0494L | |
| Proteinase K | Sigma | P2308 | |
| Glass Borosilicate Glass Micropipettes | Sutter Instruments | BF100-78-10 | OD: 1.0mm. ID: 0.78mm |
| Trizma Hydrochloride | Sigma | T5941 | |
| MgCl2 | Sigma | M2393 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| RNaseZap Decontamination Solution | Fisher Scientific | AM9780 |
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