Summary
Aquí, presentamos un método para diseñar el genoma de C. elegans utilizando ribonucleoproteínas Cas9 CRISPR y plantillas de reparación dependiente de homología.
Abstract
Las repeticiones palindrómico intercaladas regularmente agrupadas (CRISPR) - CRISPR - asociaron proteína 9 (Cas9) sistema de defensa inmune adaptante procariotas ha sido cooptado como una poderosa herramienta para la ingeniería del genoma eucariota precisa. Aquí, presentamos un método rápido y sencillo usando RNAs quiméricos guía sola (sgRNA) y CRISPR Cas9 ribonucleoproteínas (RNPs) para la generación eficiente y precisa de genómicas mutaciones de punto en C. elegans. Describimos una tubería sgRNA selección de objetivos, diseño de plantilla de reparación dirigido por homología (HDR), secuestrantes de CRISPR Cas9 de RNP, entrega y una estrategia de genotipificación que permite la identificación rápida y robusta de animales correctamente editados. Nuestro enfoque no sólo permite el fácil generación y la identificación del punto deseado de genomic de animales mutantes, sino que también facilita la detección de otros alelos del complejo indel en aproximadamente 4-5 días con alta eficiencia y una proyección reducida carga de trabajo.
Introduction
Recientes avances tecnológicos han transformado radicalmente y acelera la capacidad de genomas de Ingeniero precisamente. En particular, el sistema CRISPR Cas9, que depende de la endonucleasa de RNA-dirigida Cas9 para inducir una rotura de doble cadena (DSB) cerca de la secuencia de destino de interés, se ha utilizado extensivamente para diseñar con precisión el genoma de la mayoría de organismos modelo utilizados en investigación biomédica1,2,3,4. Significativamente, el uso de CRISPR Cas9 ha desbloqueado la edición del genoma en especies difíciles como C. elegans5. Independientemente de la especie, generando mutaciones puntuales con el genoma de CRISPR-Cas9 basado en sistema de edición se basa en tres componentes básicos: 1) Cas9 endonucleasa, 2) un guía única RNA (sgRNA) que dirige la endonucleasa Cas9 para una secuencia de destino y 3) un usuario diseñado plantilla de reparación dirigido por homología (HDR) que contiene la edit(s) de interés2.
Hay varios métodos que pueden utilizar para introducir la segmentación sgRNA e Cas9 nucleasa en células como plásmido, RNA y entrega viral basado en métodos6. Recientemente, entrega directa de pre-complexed sgRNA-Cas9 ribonucleoproteínas (RNPs) ha emergido como una herramienta potente y eficaz en el genoma basado en el Cas9 CRISPR edición7. La entrega directa de pre-complexed CRISPR Cas9 RNPs tiene varias ventajas, a saber: 1) RNPs omitir la necesidad de transcripción celular y traducción 2) RNPs se eliminan rápidamente, que puede aumentar la especificidad al reducir el tiempo disponible para objetivo escote y 3) RNPs no contienen ninguna elementos extranjeros de ADN/ARN que evita la introducción de secuencias de no nativos en el genoma del anfitrión a través de la integración al azar. En conjunto, estos atributos probablemente proporcionan una breve ráfaga de objetivos CRISPR edición minimizando efectos off-target.
Se describe un protocolo sencillo y eficaz para introducir cambios genomic específico en C. elegans. Este protocolo incluye la focalización sgRNA y diseño de plantillas de informe único oligonucleótido trenzado (ssODN), secuestrantes de RNP sgRNA Cas9 y entrega y una estrategia de genotipación para la identificación inequívoca de los animales debidamente editados. Usando esta estrategia, no sólo pueden recuperar los cambios específicos del sitio que desee, pero otras mutaciones indel no específicos pueden también ser recuperados. Por lo tanto, nuestra estrategia permite la generación de una serie alélica mediante una estrategia única, donde mono-alélica, bi-alélicos y indel mutantes pueden generarse en la generación de1 F.
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Protocol
Todos los procedimientos experimentales y cuidado de los animales siguieron la pauta de los institutos nacionales de salud y el cuidado Animal institucional y Comité uso (IACUC) en la Universidad de Michigan. Usar soluciones libres de RNasa y pipetear consejos en todo el protocolo. Limpie el área de trabajo, pipetas, tubos y centrifugar con solución de Rnasa descontaminación siguiendo las pautas del fabricante (ver Tabla de materiales).
1. sgRNA selección de objetivos
- Mediante un explorador web, abra la página web: http://crispor.tefor.net8
- Entrada ~ 60 pares de bases (PB) de secuencia que flanquean la edición deseada de interés (es decir, 30 bp 5' y 3' de la edición deseada).
- Seleccione el genoma de Caenorhabditis elegans en el menú desplegable.
- Seleccione el motivo adyacente de Protospacer (bp-NGG - SpCas9, 20 SpCas9-HF1, eSPCas9 1.1) desde el menú desplegable.
- Haga clic en enviar. En la página de resultados, seleccione la secuencia de destino ordenada superior más cercana a la edición de interés. Si no hay ningún sitios de destino adecuado dentro de la secuencia de entrada de la bp 60 de flanqueo, ampliar la secuencia de consulta hasta 100 bp (es decir, 50 bp ambos lados de la edición).
- A partir de una fuente disponible, por ejemplo, synthego, obtener un 20-mer objetivo sgRNA con las siguientes especificaciones: 3 nmol; sin modificaciones.
- Tras la recepción, centrifugar sgRNA liofilizado que contienen tubo en > 12.000 x g durante 1 min a temperatura ambiente. Añadir 60 μL de TE libre de nucleasas en el tubo y Resuspenda suavemente mediante pipeteo arriba y abajo de 15 a 20 veces con una pipeta de P200. La concentración final es de 50 μm.
2. homología indica reparación plantilla diseño
- Diseñar una plantilla HDR ssODN contiene: 1) la mutación de interés, 2) un sitio único endonuclease de la restricción en-marco, 3) una mutación silenciosa de uno o ambos de los Gs dentro de la secuencia de NGG PAM y 4) 50 bp 5' y 3' homología de armas que flanquea la mutación de la primera y la última. (Figura 1) 9 , 10.
- Si no es posible la mutación de la secuencia de PAM NGG, introducir mutaciones silenciosas 5-6 dentro de la secuencia de reconocimiento de destino sgRNA para evitar escote sgRNA-mediada de la plantilla de informe de ssODN.
- A partir de una fuente disponible, por ejemplo, idtdna, obtener un "oligonucleótidos de ADN Ultramer" con los siguientes parámetros: escala: 4 nmol; Formulación: Ninguno; Purificación: La desalación estándar.
- Al recibir, de centrífuga ssODN liofilizado que contienen tubo > 12.000 x g durante 1 min a temperatura ambiente. Resuspenda suavemente ssODN a una concentración final de 100 μm en ddH libre de nucleasa2O mediante pipeteo arriba y abajo de 15 a 20 veces con una pipeta de P200.
3. diseño Primers de genotipado
- Diseño de un primer set que flanqueaban la modificación del genoma para generar un ~ 400-700 bp PCR amplicon11.
- Optimizar condiciones ciclo PCR para producir productos individuales y específicos11.
4. preparar la mezcla de inyección
- Centrífuga de mesa 1 reactivos a la velocidad máxima por 2 min a 4 ° C.
- En el orden indicado, añadir los reactivos de la tabla 1 a un tubo PCR libre de nucleasas.
- Mezclar bien mediante pipeteo suavemente hacia arriba y hacia abajo 10 veces con una pipeta de P20.
- Incubar la mezcla de inyección durante 10 min a temperatura ambiente.
5. inyección protocolo
- Micropipeta de inyección de carga con aproximadamente la mitad de la mezcla de inyección12. Guarde el resto de mezcla de inyección en caso de que la aguja se atasca o se rompe.
- Romper la punta de la micropipeta para que ~ 20-30 PSI produce un flujo gradual de solución12.
Nota: Más grande de punta negativamente afecta la salud animal y disminuir la producción de progenie F1 . - Inyectar 10 a 15 jóvenes adulto gusanos en ambos brazos gonadales si es posible12. Si no, la inyección en un brazo gonadal es suficiente.
- Permiten animales inyectados (P0) recuperar para 1-2 h a temperatura ambiente en una placa de los medios de comunicación (NGM) crecimiento nematodos OP50 semillas 35 mm. Posteriormente, solo inyectados P0 animales placas NGM individuales sembradas OP50 35 mm con un gusano de alambre de platino escoger12.
6. pantalla P0 placas y1sola mCherry(+) F s
- Después de la inyección dos días, identificar placas,0 P con progenie de1 F expresando mCherry en la faringe mediante un estereomicroscopio fluorescente (figura 1, día 2 - 3). Seleccione las placas de0 de tres P que contienen la mayoría de los animales1 mCherry(+) F.
- De cada una de las tres placas de0 de P seleccionadas, solo 8-12 mCherry(+) F1 animales para un total de 24-36 mCherry(+) F1s usando un gusano pick (figura 1, día 2 - 3).
Nota: mCherry(-) animales también pueden ser destacados de estas placas de P0 , pero la probabilidad de identificar correctamente editado animales es mucho menor (figura 2A). - Permiten individuales F1s para fertilizarse y poner huevos 1-2 días a temperatura ambiente.
7. sencillo PCR y genotipificación del gusano
- Después de 1-2 días de puesta de huevos, transferir la F1s en cada PCR tira casquillos del tubo que contiene 7 μl de tampón de lisis del gusano utilizando una púa de gusano (tabla 2, figura 1, día 4-5).
- Tubos de PCR de centrífuga a máxima velocidad durante 1 min a temperatura ambiente para traer animales a la parte inferior del tubo y la congelación de los tubos a-80 ° C durante 1 h.
Nota: Gusanos pueden ser almacenados a-80 ° C indefinidamente. - Lyse gusanos congelados en un termociclador con el siguiente programa: 60 ° C durante 60 min, 95 ° C durante 15 min, 4 ° C mantener.
- Mastermix PCR de configuración como se muestra en la tabla 3.
- Añadir 21 μl del mastermix PCR en tubos PCR limpios y luego añadir 4 μL de lisis de gusano del paso 3. Mezclar con una pipeta y ejecutar programa PCR siguiendo las pautas del fabricante (ver Tabla de materiales).
- Purificar las reacciones de PCR utilizando un kit de ADN limpio y concentrado, siguiendo las instrucciones del fabricante (ver Tabla de materiales). Eluir el ADN agregando 10 μl de agua a la columna de vuelta.
- Mastermix de enzima de la restricción de configuración como se muestra en la tabla 4.
- Añadir 10 μl de la enzima de la restricción mastermix a cada reacción de PCR limpio e incubar durante 1-2 h a 37 ° C13.
- Separado digerido productos de la PCR en un gel de agarosa 1.5% a 120 V con 1 x Tris-acetato-EDTA (TAE) buffer14.
8. identificación y verificación de la secuencia de los animales editados
- Examinar muestras de la enzima que digiere la presencia de bandas que indican potencial editado animales14 (figura 1, día 4-5).
Nota: Cargar un control de N2 para identificar posibles mutaciones indel que pueden ser observadas como cambios en el tamaño de la banda o inesperado y complejo enzimático de la restricción digestión, los patrones de bandas. - Después de identificar los posibles animales editados, utilice las restantes 3 μl de lisis de gusano y repetir la reacción de PCR. No limpie o enzimas de restricción digiere la reacción de PCR después de completar el programa. La reacción de PCR en gel de agarosa al 1%, independiente de la carga y extraer la banda utilizando un gel de extracción kit15 (ver Tabla de materiales).
- Gel de16 secuencia Sanger extrajo ADN utilizando la cartilla de F1 para identificar animales correctamente editados (figura 1A)
Nota: Lee contendrán heterocigoto overlaid picos debido a la presencia del tipo salvaje y alelo de ingeniería. - Para obtener animales homocigóticos de animales editados heterozigóticos verificados, solo 8-122 animales y realice los pasos 7-8.
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Representative Results
Mutaciones en humanos de la superóxido dismutasa 1 (SOD1) representan ~ 10-20% de la esclerosis de lateral amiotrófica, una enfermedad neurodegenerativa devastadora que invariablemente conduce a la parálisis y la muerte17. Humano SOD-1 es una proteína conservada evolutivamente compartir similitud de identidad y el 70% del 55% con la proteína SOD-1 de C. elegans (figura 1B). Para demostrar la simplicidad, viabilidad y eficacia del enfoque basado en el Cas9 CRISPR RNP, hemos concentrado en el gen sod-1 de C. elegans para la introducción de la variante humana asociada a enfermedad del G93A en el genoma del gusano (figura 1A).
Para el ingeniero la mutación G93A en el genoma de C. elegans , se eligió un sgRNA cuyo sitio de reconocimiento de PAM encuentra 3 bp aguas arriba del codón G93 (figura 1). Hemos diseñado un ssODN HDR reparación plantilla que contenga: cambios de nucleótido 1) para convertir el codón G93 A93 (GGA GCA), 2) un cambio silencioso a la PAM NGG secuencia (CAG CGG) para evitar escote sgRNA-Cas9-mediada de la plantilla HDR, 3) una mutación silenciosa (CT) que presenta un sitio único de enzima de restricción HindIII para genotipificación y 4) 50 bp 5' y 3' homología brazos (figura 1). Un sistema de la cartilla PCR (F1-R1) fue diseñado para producir un único producto PCR bp 592 en N2 controles (figura 1A). Una mezcla de inyección que contiene el sgRNA, Cas9, ssODN un plásmido marcador fluorescente (pCFJ90) se mezclan, se incubaron por 10 min a temperatura ambiente y carga en una pipeta de microinyección.
Figura 1 muestra el flujo de trabajo después de la mezcla de inyección se carga en una micropipeta de inyección. En el día 0, 10-15 P0 animales se inyectan en uno o ambos brazos de la gónada, utilizando la técnica de microinyección estándar18,19. Animales inyectados recuperaron para 1-2 h y luego fueron plateados individualmente en las placas sembradas OP50 NGM. Después de 2-3 días, inyecciones de0 P éxito fueron identificadas por los mCherry(+) F1 progenie. Las mejores placas de0 P tres (es decir, los que tienen el mayor número de mCherry(+) F1s) fueron seleccionados para el análisis posterior. De cada una de estas tres placas (P0-8, P0-10, P0-12), fueron seleccionados 8 mCherry(+) F1s a placas NGM individuales sembradas OP50 35 mm para un total de 24 mCherry(+) F1s. Después de 2-3 días de puesta de huevos (día 4 - 5), la individual F1fueron transferido a tubos PCR que contiene tampón de lisis de gusano y congelado por 1 h a-80 ° C. Posteriormente, el F1fueron lisis para liberar el ADN genómico y sometido a PCR. Los productos PCR fueron entonces purificados y digeridos con HindIII para 1 h y correr en un gel de agarosa 1,5% identificar potencial editado animales. En animales correctamente editados, HindIII digestión cortes completo producto PCR (592 bp) en dos grupos de 370 bp y 222 bp. Esta estrategia de genotipado claramente distingue entre el tipo salvaje (592 bp), heterocigoto (592, 370, 222 bp) y homocigoto (370, 222 bp) animales. Figura 2A ilustra los resultados de la genotipificación de los animales de mCherry(+) 24.
Para demostrar que el marcador fluorescente mCherry enriquece para la modificación del genoma, también elegimos 8 animales de mCherry(-) de cada una de las placas de tres P0 . De los 24 mCherry(+) F1s proyectado (barra roja), 10 contenidos modificación alélica mono o bi-alélicos (42%), 10 eran de tipo salvaje (42%), 3 eran potenciales indels (13%) y hubo 1 fracaso PCR (figura 2A). En cambio, de la 24 mCherry(-) F1s evaluados, sólo 1 animal fue correctamente modificado (4%); mientras que 23 fueron de tipo salvaje (96%) (Figura 2A). Figura 2B muestra el cromatograma de la larga duración gel extraído producto de la polimerización en cadena (F18-6), demostrando que los cambios de nucleótido exacto diseñado en la plantilla HDR ssODN fielmente fueron incorporados en el genoma de este F homocigótica 1 animal. En particular, F1 los animales 10-7, 10-8 y 12-3 exhiben tamaños inesperados del producto PCR y restricción implícita patrones de bandeo, sugiriendo que estos animales pueden llevar consigo mutaciones indel complejo (figura 2A). Así, nuestro método no sólo es capaz de generar modificaciones del genoma deseado con facilidad, eficiencia y fidelidad, pero también permite la identificación y recuperación de indel únicos alelos que pueden arrojar una visión importante e inesperada función genética.
Figura 1 . Ingeniería CRISPR Cas9 de la C. eleganssod-1 locus. (A) Ilustración esquemática que representa la estructura exón-intrón de la sod-1 lugar geométrico en C. elegans. La barra roja indica la ubicación de G93 en el exón 3. El conjunto de par de la cartilla es señalado por las flechas rojas (F1-R1). (B) secuencia de alineación de humanos y proteínas de Caenorhabditis elegans (gusano) SOD-1. Objetivo residuo G93 está resaltado en rojo. (C) parte superior, una sección de la DNA genomic que rodea el codón G93 se muestra como una referencia, y se destacan los PAM (verde) y blanco (azul) sgRNA. Inferior, la homología del oligonucleótido trenzado simple (ssODN) dirigido plantilla de reparación (HDR) se muestra que contengan: el codón editar cambiar G93 A93, un silencioso cambio en el motivo de PAM para prevenir el escote por el complejo sgRNA Cas9, un silencio cambia a introducir un sitio único de enzima de restricción HindIII (caja amarilla), y que flanquea 5' y 3' 50 homología de bp armas (barras negras). Todos los cambios de nucleótidos en el ssODN son de color rojo resaltado. (D) Ilustración esquemática de la tubería para generar e identificar a punto de RNP CRISPR Cas9 mutantes. En el día 0, inyectar0 animales de 10-15 P con mezcla de inyección. El día 2-3, identificar correctamente inyectado P0 animales por aquellas que contienen fluorescentes progenie de1 F y seleccione las placas de0 P tres con la progenie más fluorescente. De cada una de las placas de tres P0 , solo 8 fluorescente progenie de1 F. Día 4-5, (a) paso 1, F1s individuales y los colocan en tubos PCR que contiene tampón de lisis; (b) paso 2, después de la congelación a-80 ° C, tubos PCR que contiene F1 gusanos son lisis para liberar el ADN genómico, que se utiliza como una plantilla PCR. Los productos PCR son limpiados y digeridos con la enzima de restricción única; (c) paso 3, enzima digerida productos son resueltos en un gel de agarosa donde salvajes tipo (+ / +), heterocigoto (m / +), y animales homocigóticos (m/m) pueden ser identificados por digestión de restricción patrones de bandas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 . Datos de genotipado para sod-1 (G93A) mutantes. (A) Imagen de gel de F 1 los animales que eran individualmente lisada, PCRed y digerido con HindIII. Para cada placa de0 de P (P0-8, P0-10, P0-12), se analizaron 8 mCherry(+) y 8 mCherry(-) F1 animales. Mono-alélica (números azules) y bi-alélicos (números rojos) editado animales fueron recuperados. Tamaño cambió de puesto los productos PCR o unpredicted HindIII digeridos bandas también fueron recuperados que son indicativos de indel mutantes (números amarillos). N2 los controles se muestran como referencia para PCR producto tamaño y enzima especificidad. (B) arriba, espacio de codón y traducciones del aminoácido son indicadas para el tipo salvaje (WT) y a continuación para G93A modificación filamentos. La edición deseada es resaltada en una caja roja, y destacan los cambios silenciosos que crean un sitio de restricción HindIII en el marco por un cuadro amarillo. Todos los cambios de nucleótidos diseñadas se muestran en negrita. Fondo, cromatograma representativo de homocigótica F1 8-6 animales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Reactivo de | Volumen | Concentración final |
| ddH2O | 6,3 ΜL | ---- |
| KCl (4M) | ΜL DE 0.94 | 300 mM |
| PH 7.4 de HEPES (0.5M) | 0.5 ΜL | 20 mM |
| pCFJ90 (25 ng/μL) | 1.25 ΜL | 2,5 ng/μL |
| ssODN (500 ng/μL) | 1.25 ΜL | 50 ng/μL |
| sgRNA (50 μM) | 1.25 ΜL | 5 ΜM |
| Cas9 (61 μM) | 1.03 ΜL | 5 ΜM |
| Volumen final | 12.5 ΜL | ---- |
Tabla 1. CRISPR Cas9 RNP mezcla de inyección. Todos los reactivos deben ser resuspendidos en ddH libre de nucleasa2Rnasa O. deben utilizarse técnicas libres al manipular reactivos y al hacer la mezcla de inyección.
| Reactivo de | [Final] |
| KCl | 50 mM |
| Tris-HCl, pH 8.3 | 10 mM |
| MgCl2 | 2,5 mM |
| NP-40 | 0.45% |
| Tween-20 | 0.45% |
| Proteinasa K | 1 mg/mL |
Tabla 2. Receta de Buffer de lisis de gusano. Proteinasa K debe añadirse fresca antes de cada uso.
| Reactivo de | 1 x | 24 x |
| 2 x Q5 Mastermix | 12.5 ΜL | 300 ΜL |
| Primer F1 (10 μM) | 1.25 ΜL | 30 ΜL |
| Primer R1 (10 μM) | 1.25 ΜL | 30 ΜL |
| Lisis de gusano | 4 ΜL | ---- |
| ddH2O | 6 ΜL | 144 ΜL |
| Volumen final | 25 ΜL | 504 ΜL |
Tabla 3. Mastermix PCR. Mastermix el PCR se debe mezclar bien mediante pipeteo hasta que la solución es homogénea. 21 μl del mastermix de la PCR se debe agregar a los tubos PCR limpios, y luego se debe agregar 4 μL de cada gusano lisado en tubos debidamente etiquetados.
| Reactivo de | 1 x | 24 x |
| 10 x Buffer de la enzima | 2 ΜL | 48 ΜL |
| Reacción de PCR limpios | 10 ΜL | ---- |
| ddH2O | 7 ΜL | ΜL DE 168 |
| Enzima de la restricción (10 U/μL) | 1 ΜL | 24 ΜL |
| Volumen final | 20 ΜL | 240 ΜL |
Tabla 4. Mastermix de restricción enzimática. El mastermix de restricción enzima se debe mezclar bien mediante pipeteo hasta que la solución es homogénea. 10 μl del mastermix de la enzima de la restricción se debe agregar a 10 μl del producto PCR limpio
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Discussion
El sistema CRISPR Cas9 es una herramienta potente y eficaz para modificar precisamente el genoma de organismos modelo. Aquí, demostramos que eso quimérico sgRNAs20 junto con ssODN HDR plantillas permiten la generación altamente eficiente de genómicas mutaciones de punto en C. elegans. Importante aún, demostramos que entrega RNP produce alto rendimiento edición cuando la fluorescencia se utiliza como un marcador de selección Co, destacando la facilidad y la fiabilidad de la técnica.
La mayoría de los métodos para la ingeniería del genoma de C. elegans CRISPR Cas9 dependen de fondos genéticos específicos o co-CRISPR estrategias1. El método de co-CRISPR ha demostrado para ser una herramienta increíblemente útil que aumenta la probabilidad de obtener una edición exitosa del genoma. Sin embargo, los métodos co-CRISPR requieren introducir una edición fenotipo seleccionable en un locus marcador que enriquece para la edición del genoma de interés. Aunque potente, introduciendo mutaciones rodamiento de fenotipo seleccionables sea indeseable si la cepa para editar o la mutación de punto deseada de interés sí mismo exhibe fenotipos que pueden exacerbados o suprimidos por el fenotipo de marcador. Por otra parte, estrategias de co-CRISPR requieren crear una rotura de doble cadena adicional en un locus marcador que puede contribuir a efectos off-target. Aquí, presentamos un método que utiliza un marcador fluorescente transitorio que no sólo sirve para identificar con éxito inyectado P0 animales, pero también enriquece para ediciones de genoma correcto. Nuestros datos demuestran este método significativamente enriquece para animales con éxito editados en comparación con animales no fluorescente y ofrece varias ventajas: 1) sólo una focalización específica sgRNA se requiere, 2) una 5-fold reducción de Cas9 y sgRNA concentración, 3) independencia de selección de la cepa y del fenotipo y 4) una carga de trabajo nominal de detección (~ 24 F1s). Robusto CRISPR Cas9 edición del genoma en la generación de1 F se observó utilizando este método. En particular, la estrategia de detección basada en la enzima de la polimerización en cadena-restricción descrita permite la detección inequívoca de animales editadas mono y bi-alélicos en la generación de1 F. Por último, la estrategia de genotipado facilita la identificación de posibles mutaciones indel, que puede ser observado como banda PCR cambia cuando comparados a los controles de la N2, que no susceptibles a la digestión de restricción o rendimiento complejo bandas cuando digiere.
El advenimiento de la generación siguiente secuencia acompañada de esfuerzos genómicos a gran escala ha acelerado la identificación de variantes genómicas que segregan con la enfermedad21. Sin embargo, pruebas funcionales de patogenicidad no se han demostrado para la mayoría de las variantes en sistemas modelo de celular y organismo. En este estudio, hemos dirigido el gen sod-1 en C. elegans para introducir el ampliamente estudiado de SOD-1 asociada a ALSG93A mutación. Hasta la fecha, esta mutación ha sido modelada y estudiado en C. elegans y ratones principalmente usando la sobreexpresión transgénica. Aunque la sobreexpresión de variantes en los modelos animales puede recapitular clave celular, aspectos moleculares y de comportamiento de la enfermedad, es cada vez más claro que la 'dosis' es un factor atenuante para determinar fenotipos22. Por ejemplo, copia de alto número de SOD-1G93A ratones llevar ~ 24 copias del gene humano de SOD-1 mutado exhibe curso de la enfermedad considerablemente acelerado en comparación con ratones de la SOD-1G93Adl , que llevan sólo 8-10 copias23,24. Aquí, demostramos que nuestro método basado en el Cas9 RNP CRISPR puede ser utilizado para rápidamente generar humanas variante asociada a mutaciones en el gen de gusano orthologous sin necesidad de que la sobreexpresión transgénica, en un esfuerzo por replicar más precisamente la genética contexto de la enfermedad. Nuestro método proporciona una plataforma viable para producir y probar variantes genómicas de la significación desconocida en el contexto del control regulador endógeno y de expresión, que excluye los confines de la sobreexpresión. Por último, también hemos utilizado este método para seleccionar genes endógenos con proteínas fluorescentes (es decir, GFP), que proporcionarán una herramienta adicional para la visualización de cómo las variantes afectan facturación, agregación y localización de la proteína.
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Disclosures
Agradecemos a los miembros del laboratorio Beg de lectura crítica de este manuscrito. Las cepas fueron proporcionadas por el centro de genética de Caenorhabditis , que es financiado por los NIH oficina de programas de infraestructura de investigación (P40 OD010440). Investigación en el laboratorio de Beg es apoyada por becas del NIH (R01 NS094678) y Asociación de la Distrofia Muscular (MDA382300) a A.A.B.
Acknowledgments
Hay no hay conflictos de intereses relacionados con este informe.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CRISPRevolution sgRNA EZ Kit | Synthego Inc. | chimeric sgRNA | |
| Nuclease-free TE | Synthego Inc. | provided with the sgRNA kit EZ kit | |
| Nuclease-free water | Synthego Inc. | provided with the sgRNA kit EZ kit | |
| 4 nmole Ultramer DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | ssODN HDR template | |
| Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLS | Integrated DNA Technologies | 1078728 | Cas9 protein |
| pCFJ90 | Addgene | 19327 | Pmyo-2::mCherry Marker Plasmid |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| DNA Clean & Concentrator | Zymo Research | D4004 | |
| Zymoclean Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4002 | |
| Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs | M0494L | |
| Proteinase K | Sigma | P2308 | |
| Glass Borosilicate Glass Micropipettes | Sutter Instruments | BF100-78-10 | OD: 1.0mm. ID: 0.78mm |
| Trizma Hydrochloride | Sigma | T5941 | |
| MgCl2 | Sigma | M2393 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| RNaseZap Decontamination Solution | Fisher Scientific | AM9780 |
References
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