Summary
أظهرت مختلف العقاقير النوكليوتيد (AONs) للحث على إدراج إكسون (تعديل الوصلة) وإنقاذ التعبير الجالي لضمور العضلات الشوكي (SMA). هنا، يمكننا وصف بروتوكول لايون ليبوترانسفيكشن للحث على إدراج إكسون في الجينات SMN2 وأساليب التقييم تحديد الكفاءة في SMA الليفية المريض.
Abstract
ضمور العضلات الشوكي (SMA)، أمراض عصبية قاتلة الناجمة عن فقدان SMN1، يمثل حالة فريدة من نوعها في المجال العقاقير اليغنوكليوتيد (أيون)-بوساطة العلاج. بينما الطفرات SMN1 المسؤولة عن المرض، AONs استهداف مواقع كاتم الصوت (ISS) الوصلة إينترونيك في SMN2، بما في ذلك نوسينيرسين التي وافقت عليها إدارة الأغذية والعقاقير، تبين أن استعادة التعبير الجالي والتخفيف من الأعراض. حاليا، العديد من الدراسات التي تشمل العلاج بايون ل SMA التركيز على التحقيق في رواية أيون كيمياء استهداف SMN2 التي قد تكون أكثر فعالية وأقل سمية من نوسينيرسين. هنا، نحن وصف بروتوكول للتقييم في المختبر لإدراج إكسون باستخدام ليبوترانسفيكشن AONs متبوعاً بالنسخ العكسي تفاعل البوليميراز المتسلسل (RT-PCR) والكمية البلمرة المتسلسل (qPCR) النشاف الغربية. ويمكن استخدام هذا الأسلوب لأنواع مختلفة من أيون كيمياء. باستخدام هذا الأسلوب، نظهر أن AONs تتألف من الأحماض النووية مؤمنة التناوب (لناس) والنيوكليوتيدات الحمض الخلوي الصبغي (LNA/DNA ميكسميرس) يؤدي إلى كفاءة SMN2 إكسون إدراج واستعادة للبروتين الجالي في تركيزات منخفضة للغاية، وبالتالي، LNA/ الحمض النووي على أساس ميكسمير النوكليوتيد العقاقير قد تكون استراتيجية علاجية جذابة لعلاج الربط العيوب الناجمة عن الأمراض الوراثية. في المختبر تقييم الأسلوب الموصوفة هنا سريعة وسهلة وحساسة بما يكفي لاختبار AONs رواية مختلفة.
Introduction
ضمور العضلات الشوكي (SMA) اضطراب عصبي عضلي فادح الموروثة في نمط مقهورة جسمية. ويتميز بتدهور الخلايا العصبية الحركية والجذع تدريجيا واطرافهم العضلات شلل1،2. غالبية الحوادث SMA سبب طفرة متماثل في الجينات البقاء على قيد الحياة للخلايا العصبية الحركية 1 (SMN1)3. الجين البقاء على قيد الحياة للخلايا العصبية الحركية 2 (SMN2) تكرار معكوس من SMN1، وتسلسل متطابقة تقريبا تختلف حسب القواعد الخمس فقط4،5. تحول ج-إلى تي في SMN2 الواقعة في إكسون 7 يجعل الجين لا يعمل تقريبا نظراً للطفرة تؤدي إلى إكسون الأساسية 7 استبعادهم في ما يقرب من 90 في المائة من SMN2 المحاضر الحرفية (الشكل 1). لا يمكن أن تعوض مرناس SMN2 إكسون 7 في عداد المفقودين للدالة SMN1 لأن ناتجها البروتين غير مستقرة وتتحلل سريعاً.
العلاج بالعقاقير برزت مؤخرا كاستراتيجية واعدة جداً لعلاج SMA6. الموافقة الأخيرة على نوسينيرسين من "الولايات المتحدة للأغذية" والدواء (FDA) إتاحته أول دواء لعلاج SMA7. نوسينيرسين هو 18-مير العقاقير اليغنوكليوتيد (أيون) مع تعديل 2 '-O-ميثوكسييثيل (وزارة التربية والتعليم) والعمود الفقري فوسفوروثيواتي. المخدرات يستهدف كاتم الصوت الربط إينترونيك N1 (المحطة الفضائية الدولية-N1) يقع في إنترون 7 الجين SMN2 . ملزمة نوسينيرسين إلى محطة الفضاء الدولية-N1 يعزز الانتعاش وظيفية كاملة الطول الجالي البروتين التعبير من الجينات SMN2 الذاتية بحمل إكسون 7 إدراج (الشكل 1)8،9،10 . حاليا، العديد من الدراسات التي تشمل العلاج بايون ل SMA التركيز على التحقيق في كيمياء أيون الرواية التي قد تكون أكثر فعالية وأقل سمية من نوسينيرسين. وقد ثبت أن AONs مع كيمياء أخرى أيضا كفاءة الحث على إدراج إكسون في SMN2 إكسون 7 في المختبر و في فيفو11،،من1213.
مؤمن من الأحماض النووية (لناس) هي النظير الحمض النووي الريبي معدلة كيميائيا تحتوي على جسر الميثيلين الاتصال 4-الكربون مع 2 '-الأكسجين داخل ال14،فرانس الهيكل (الشكل 1ب)15. بالمقارنة مع السلطات الوطنية المعينة أو الكشف، لناس زيادة تقارب للربط لتسلسل الحمض النووي الريبي مكملة ولها فائدة مضافة ليجري شديدة المقاومة ل nucleases الذاتية. تم تطبيق الكيمياء LNA لاستخدامها كمجسات للأسفار في الموقع التهجين (الأسماك) وفي قبكر16،17. كما أنها تستخدم لتنظيم التعبير الجيني في المختبر و في فيفوعلى حد سواء. AONs جابمير مزيج من جزيئات الحامض النووي الذين تقطعت بهم السبل-واحد يحف به عدة لناس في نهايات 3 'و 5'. نهدم التعبير الجيني بالربط مكملة مرناس المستهدفة، مما أدى إلى أن يتحلل من "ح رناسي" المنشط18. ميكسميرس LNA/الحمض النووي هي AONs التي تتكون من الحمض النووي النيوكليوتيدات تدمج ما بين لناس. قدم في هذا الاتجاه أنهم ربط ميرنا تمنع عن وظيفة (LNA-أنتيمير)19. وصلت بعض LNA-أنتيميرس التطوير السريري. للحصول على أمثلة، ميرافيرسين (أنتيمير-122) أنتيمير LNA الذي يمنع مير-122 لعلاج الإصابة بالتهاب الكبد الوبائي وهي عدة "المرحلة الثانية من" التجارب السريرية الجارية حاليا19،20. في الآونة الأخيرة، وقد ثبت أن ميكسميرس LNA/الحمض النووي يمكن أن تعدل أيضا الجيش الملكي النيبالي الربط21. ويمكن ربط تسلسل محدد من مرناً وحمل إكسون تخطي في إدراج ديستروفين مرناً واكسون في SMN2 مرناً في المختبر13،22.
في هذه المقالة، نحن مخطط منهجية لاستحثاث إكسون إدراج استخدام AONs وتقييم كفاءة المستويات الرنا والبروتين. لتجسيد هذا الأسلوب، استخدمنا ميكسميرس LNA/الحمض النووي استهداف المحطة الفضائية الدولية-N1 في إنترون 7 من SMN2. AONs transfected في خلايا المريض SMA قبل ليبوترانسفيكتيون الناجمة عن إدراج إكسون 7 في النهائي SMN2 نسخة و upregulation من إنتاج البروتين الجالي. واحدة من مزايا استخدام ميكسميرس LNA/الحمض النووي للحث على إدراج إكسون أن تركيز فعال تعداء أقل بكثير من غيرها كيمياء13. يمكن استخدام هذا الأسلوب للعديد من AONs الأخرى باستثناء ليغومرات morpholino فوسفورودياميداتي (بالرصدات)، التي، بسبب تهمة محايدة، بحاجة إلى إدخال الخلايا عن طريق الالتقام الناجمة عن الكاشف تعداء المشارك إندو-بورتر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-خلية ثقافة
- SMA ثقافة الليفية المريض في المتوسطة النمو (دولبيكو لتعديل النسر متوسطة 1:1-12 (لحم الخنزير) مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS) والبنسلين 0.5%/ستربتوميسين) في حاضنة2 CO في 37 درجة مئوية.
- تحديد تركيز الخلية باستخدام عداد الآلي خلية وتمييع الخلايا إلى 1 × 105 خلايا/مل في المتوسطة النمو، ثم البذور على اللوحة المناسبة. استخدام لوحات 12-جيدا (1 مل كل بئر) RT-PCR أو qPCR.
- احتضان لوحات ل 24 ساعة في حاضنة2 CO في 37 درجة مئوية.
2-LNA/الحمض النووي ميكسمير تعداء
- ضمان كونفلوينسي خلية حوالي 65-80% لكفاءة تعداء الأمثل.
- ذوبان الجليد 10 ميكرومترات LNA/الحمض النووي ميكسميرس ببطء على الجليد.
- في أنبوب 1.5 مل، تحضير حلاً x mixmer 20 بإضافة ميكسميرس للمحرومين من المصل وسائل الإعلام لكي يصل الحجم النهائي إلى 50 ميكروليتر.
- مزيج ميكسمير الحل مع 50 ميكروليتر من المحرومين من المصل الوسائط التي تحتوي على 3% تعداء كاشف (نسبة 1:1).
- احتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- إضافة 900 المتوسطة ميكروليتر المحرومين من المصل مع 5% FBS لكل أنبوبة.
- نضح الوسائط القديمة من اللوحة واستبدال مع 1 مل من محلول ميكسمير LNA/الحمض النووي يحتوي على الكاشف تعداء.
- احتضان الخلايا ح 24-48 في 37 درجة مئوية في حاضنة2 CO.
3. استخراج الحمض النووي الريبي
- إزالة المتوسطة وإضافة 1 مل كاشف ثيوسيانات-الفينول-كلوروفورم جوانيدينيوم للخلايا. أغسل الجزء السفلي شكل جيد عدة مرات مع جوانيدينيوم ثيوسيانات-الفينول-كلوروفورم وأنه جمع في أنابيب 1.5 مل.
- دوامة في عالية السرعة 30 ثانية ومخزن في-80 درجة مئوية ح 1 أو بين عشية وضحاها.
- ذوبان الجليد العينات في درجة حرارة الغرفة ودوامه جيدا.
- إضافة 200 ميليلتر كلوروفورم، اهتز بشدة لمدة 15 ثانية، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق.
- أجهزة الطرد المركزي في 12,000 س ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- جمع مسح الأعلى المرحلة مائي في أنبوب جديد. تأكد من تجنب جمع أي من الطور البيني الأبيض الذي يشكل بين المراحل العليا والسفلي.
- إضافة 500 ميليلتر الايزوبروبانول وميليلتر 1 8 ميكروغرام/ميليلتر الجليكوجين (الحمض النووي الريبي الصف). دوامة لمدة 10 ق واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق أو في-20 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- الطرد المركزي في 12,000 س ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية، وإزالة كل من المادة طافية. وسوف تشكل بيليه أبيض في الجزء السفلي من الأنبوب.
- إضافة 1 مل الباردة 75% إيثانول وأجهزة الطرد المركزي في 7,500 س ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
- إزالة كافة الإيثانول وجاف بيليه في درجة حرارة الغرفة حتى يتم ترك لا الإيثانول في الأنبوب.
- حل بيليه في 30 ميليلتر الدناز/رناسي المياه مجاناً، واحتضان لمدة 10 دقائق عند 60 درجة مئوية.
- قياس تركيز الجيش الملكي النيبالي باستخدام جهاز المطياف الضوئي (في 260 nm)، وضبط تركيز الحمض النووي الريبي إلى 50 نانوغرام/ميليلتر.
4-الخطوة واحد RT-PCR لقياس معدل SMN2 إدراج إكسون
- ميليلتر 12.5 مزيج من 2 × RT-PCR رد فعل المخزن المؤقت، مزيج ميليلتر 1.0 لأنزيم RT-PCR خطوة واحدة، 0.5 ميليلتر من كل التمهيدي (SMN2 إلى الأمام:-كتجككتككاتتككتكتج 5 '-3'، عكس SMN2 : 5 '-تجتجتكاتتاجتجكتجكتك-3'، جابده إلى الأمام: تكككتجاجكتجاكججاج 5 '-3'، عكس جابده : 5 '-جاجاجتتجتكجكتجت-3'، 2 ميليلتر من مجموع الحمض النووي الريبي (50 نانوغرام/ميليلتر)، والماء المقطر 8.5 ميليلتر رناسي/الدناز الحرة.
- بعد أن يتم تصنيعه كدنا عند 50 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، تبدأ تفاعل PCR. تضخيم إكسون SMN2 6-8 مع 30 بكر دورات (94 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 68 درجة مئوية ل 25 s). تضخيم جابده مع 20 PCR دورات (94 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، 60 درجة مئوية لمدة 30 ق، 68 درجة مئوية 20 s).
- إضافة 5 ميكروليتر 6 × تحميل صبغ للمنتج PCR، وتحميل 5 ميليلتر من الخليط 2% [اغروس] هلام وتشغيلها لمدة 40 دقيقة في 100 V.
- صورة للهلام وتحليلها باستخدام برنامج إيماجيج.
- قياس كثافة طول العصابات وعصابات Δ7. حساب معدل الشمول إكسون 7 بقيمة كثافة (طول)/(طول + Δ7 SMN2).
5-الكمية بكر (قبكر) لقياس معدل SMN2 إدراج إكسون
- لتوليف كدنا، مزيج 1 ميليلتر dT اليغو، 1 دنتبس ملم 10 ميليلتر، وميليلتر 11 مجموع الحمض النووي الريبي (50 نانوغرام/ميليلتر). احتضان عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- وضع العينات في الثلج وإضافة 4 ميليلتر 5 × المخزن المؤقت و 1 ميليلتر 0.1 M DTT 1 ميليلتر رناسي مثبط المنتسخة العكسية ميليلتر 1 لكل عينة.
- احتضان عند 50 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة، والحرارة تصل إلى 80 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة لوقف رد الفعل. ويمكن تخزين كدنا في-20 درجة مئوية.
- تمييع كدناس مع المياه خالية من رناسي (1:5 إضعاف). ميكس 10 ميليلتر 2 x ميكس الإنزيم qPCR "الأخضر سيبر"، 0.8 التمهيدي 10 ميكرون كل ميليلتر (كامل طول SMN2 إلى الأمام: عكس SMN2 5-جكتاتكاتاكتجكتاتاتاتججتتت-3، كامل طول: 5-كتكتاتجككاجكاتتكتككتات-3, Δ7 SMN2 إلى الأمام: 5- TCTGGACCACCAATAATTCCCC-3′، Δ7 SMN2 عكس: 5 '-أتجككاجكاتتككاتاتاتاجكك-3, جابده إلى الأمام: 5-جكااتككاتجكاككجت-3'، عكس جابده : 5 '-أججاتكتكجكتككتجا-3)، 3 ميليلتر المخفف كدنا، والمياه خالية من رناسي ميليلتر 5.4.
- بدء رد فعل قبكر. استخدام الشروط: 95 درجة مئوية لمدة 30 s، ثم دورة 40 مكررة إلى 95 درجة مئوية ل 5 s و 60 درجة مئوية 20 s.
- حساب التعبير النسبي ل كامل طول SMN2 إلى جابده أو Δ7 SMN2، وتطبيع للخلايا غير المعالجة مع خوارزمية ΔΔCt.
6-الغربية النشاف
- إزالة تعداء المتوسطة من الخلايا، وتغسل مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) مرة واحدة.
- إضافة 100 ميليلتر تحلل العازلة مع مثبط البروتياز.
- فصل الخلايا من الجزء السفلي من كل بئر استخدام مكشطة خلية عقيم، وجمع في أنابيب 1.5 مل. احتضان العينات في الثلج لمدة 30 دقيقة.
- تمر الخلية ليستي إبرة 21-ز 10 مرات لسحق الخلايا.
- الطرد المركزي في 20,800 س ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية وجمع المادة طافية في أنابيب 1.5 مل جديدة. ويمكن تخزين العينة في ثلاجة عميق-80 درجة مئوية.
- تحديد تركيز البروتين باستخدام مجموعة "أدوات مقايسة البروتين اتفاق التعاون الأساسي"، وضبط التركيز إلى 1.0 ميكروغرام/ميليلتر.
- مزيج 5 ميليلتر عينات و 5 ميليلتر 2 × الصوديوم دوديسيل كبريتات (SDS) عينة العازلة (الحزب الديمقراطي الصربي 10%؛ ونسبة 14% 0.5M HCl تريس الحل، pH 6.7؛ 1% 0.5 م يدتا-2Na الأسهم الحل، pH 8.0؛ 20% والغليسيرول؛ وصبغ بروموفينول الأزرق 0.004%، 5% β-ميركابتوثانول) والحرارة عند 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
- تحميل العينات إلى نسبة % 4-12 مكررا-تريس "البروتين" والهلام وتشغيل لح 1 في 150 الخامس.
- نقع ورقة تصفية سميكة في المخزن المؤقت لكل: (اﻷنود تتركز المخزن المؤقت: 0.3 M تريس-HCl، 20% ميثانول؛ اﻷنود المخزن المؤقت: 0.03 م تريس-HCl، 20% ميثانول؛ الكاثود المخزن المؤقت: 25 مم تريس، 20% ميثانول، 40 مم 6-n الأمينية-hexanoic حامض، والحزب الديمقراطي الصربي 0.01 ٪).
- نقع غشاء ثنائي الفلوريد (PVDF) الفينيليدن في الميثانول ل 20 ثانية، ثم نقلها إلى المخزن المؤقت اﻷنود.
- حجته الجل بعد الحزب الديمقراطي الصربي صفحة مع المخزن المؤقت السالب لمدة 5-10 دقيقة تحت التحريض.
- ضع أوراق التصفية والأغشية PVDF والهلام على آلة blotting شبه جاف، على النحو التالي: تتركز المخزن المؤقت اﻷنود اﻷنود الورق/الورق/PVDF/بروتين غشائي المخزن المؤقت هلام/الكاثود ورقة المخزن المؤقت (الشكل 2).
- تغطية المكدس وبدء النقل في 20 الخامس لمدة 30 دقيقة.
- بعد النقل، شطف غشاء PVDF مع ببست (برنامج تلفزيوني مع 0.05% 20 توين) مرة واحدة.
- كتلة الغشاء في درجة حرارة الغرفة مدة 30 دقيقة في 5% مسحوق اللبن المقشود حله في ببست أو عند 4 درجة مئوية لبين عشية وضحاها.
- تضعف جسم المضادة-الجالي ماوس المنقي وجسم أرنب كوفيلين المضادة للمضيفين في مسحوق الحليب المقشود 5% في ببست. احتضان الغشاء في ذلك ح 1 في درجة حرارة الغرفة أو في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
- أغسل 3 مرات مع ببست لمدة 10 دقائق.
- تمييع الأجسام المضادة الثانوية (الماوس المضادة مترافق HRP الماعز والأرانب المضادة IgG (H + L)) للمضيفين في مسحوق الحليب المقشود 5% في ببست. احتضانها ح 1 في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
- يغسل الغشاء 3 مرات مع ببست لمدة 10 دقائق.
- الكشف عن إشارة الفرقة استخدام تشيميلومينيسسينسي الغربية كيت الكشف عن النشاف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
استخدام SMA المريض الخلايا الليفية، ونحن استهدفت منطقة المحطة الفضائية الدولية-N1 كاتم الصوت في إنترون 7 الجين SMN2 مع ثمانية ميكسميرس LNA/الحمض النووي العقاقير المختلفة التي تم transfected بتركيز 5 في شمال البحر الأبيض المتوسط (الشكل 3). كل من ميكسميرس الواردة فوسفوروثيواتيد تعديل العمود الفقري مما مكنها من مقاومة تدهور نوكلاس. لتقييم فعالية ميكسميرس، بمعدل إكسون SMN2 كان كمياً إدراج 7 RT-PCR واستخدام كبسولة تفجير محددة إلى SMN2qPCR. إدراج كفاءة إكسون 7 تراوحت من 78-98 في المائة عند transfected مع ميكسميرس #1-5 في خلايا المريض (الشكل 4أ، ب)، بينما تعداء استخدام ميكسميرس #6-8 في نفس الجرعة لم تسفر عن أي اختلاف كبير بالمقارنة مع عنصر التحكم. الحصول على النتائج من تحليل qPCR أيضا عرض أن ارتفع كمية كامل طول مرناً SMN2 نسخة من ميكسميرس #1-3 والعلاجات #5 بالمقارنة مع عنصر التحكم (الشكل 4ج).
وبالإضافة إلى ذلك، أظهرت نتائج النشاف الغربية تعداء أن استخدام ميكسميرس #1-5 مستويات أعلى تمكين الجالي التعبير البروتين في الخلايا الليفية المريض (1، 5-زيادة 1.9-fold من عنصر التحكم، الرقم 5). العلاج استخدام ميكسميرس #6-8 لم يسفر إجراء تغيير في مستوى التعبير الجالي البروتين في الخلايا. تبين هذه البيانات أن تعداء LNA/الحمض النووي ميكسميرس #1-5 الحث على إدراج إكسون 7 SMN2 كفاءة في SMA الليفية المريض.
الشكل 1 : أنتيسينسي بوساطة إكسون إدراج استراتيجية لعلاج SMA. (أ) انتقال ج-إلى تي في إكسون 7 من SMN2 يؤدي إلى تخطي إكسون 7 في حوالي 90% نصوص SMN2 . هذه النصوص هي الخروج من الإطار وهي سرعة التدهور في الخلايا. النوكليوتيد العقاقير (AONs) ربط كاتم الصوت الربط إينترونيك N1 (المحطة الفضائية الدولية-N1)، الذي يؤدي إلى إدراج إكسون في SMN2. يمكن أن تنتج مرناس SMN2 7-وشملت إكسون الوظيفية الجالي البروتين. (ب) الهياكل الكيميائية للحمض النووي الريبي وفوسفوروثيواتيد LNA. العمود الفقري كامل من ميكسميرس نحن المستخدمة في هذه المقالة فوسفوروثيواتيد للحيلولة دون تدهور. وقد تم تعديل هذا الرقم من توزنيك et.al. 13- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : طريقة نقل شبه الجافة لغربي النشاف. ركزت ورقة تصفية سميكة غارقة المخزن المؤقت اﻷنود (Con.)، وورقة تصفية سميكة غارقة في المخزن المؤقت اﻷنود، وغشاء PVDF وهلام وورقة تصفية سميكة غارقة في المخزن المؤقت الكاثود مكدسة بين لوحات اثنين من جهاز blotting شبه الجاف. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : LNA/الحمض النووي ميكسمير تسلسل لإدراج إكسون 7 SMN2. قاعدة الحمض النووي: G، A, T, قاعدة LNA جيم (أحمر): + G + A, T + جيم فوسفوروثيواتيد الحمض النووي الأساسية: ز * A * T *،، ج *. قاعدة LNA فوسفوروثيواتيد (أحمر): ز *، + + + A *، + T *، ج *. ويرد هذا الرقم من توزنيك et.al. 13- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : نتائج تمثيلية RT-PCR و qPCR لتقييم فعالية ميكسميرس LNA/الحمض النووي- تعداء ميكسميرس #1-5 يؤدي إلى إدراج إكسون 7 SMN2 بمعدل أعلى بكثير من تعداء وهمية. () RT-PCR SMN2 و جابده في SMA الليفية المريض عقب تعداء 5 نانومتر تركيز. الشريط العلوي: إكسون 7-وشملت كامل طول SMN2 مرناً. الشريط السفلي: إكسون 7-استبعاد SMN2 مرناً. (ب) التحليل الكمي من SMN2 إكسون 7 إدراج في معاملة ميكسمير الليفية SMA استخدام الرايت-بكر. (ج) التعبير النسبية تحليل كامل طول SMN2 إلى جابده تقاس باستخدام قبكر. تم تطبيع البيانات إلى خلايا غير المعالجة بالتحكم. تمثل أشرطة الخطأ ± متوسط الانحراف المعياري (ثلاث تجارب مستقلة). أحادي الاتجاه ANOVA مع دونيت وأجرى العديد من التجارب المقارنة. م: موك التحكم، NT: غير المعالجة، ح: مراقبة صحية تنتجها الخلايا الليفية الخلايا، باء: فارغة. ويرد هذا الرقم من توزنيك et.al. 13- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 : نتائج تمثيلية النشاف الغربي لقياس التعبير البروتين الجالي. تعداء ميكسميرس LNA/الحمض النووي يزيد من إنتاج البروتين الجالي. (أ) غربي النشاف الجالي وكوفيلين (تحميل عنصر التحكم) الخلايا الليفية المريض SMA صحية وتعامل ميكسمير. (ب) إضعاف زيادة في مستويات البروتين الجالي ميكسمير تعامل الخلايا الليفية SMA. تعداء ميكسميرس #1-5 في 5 نانومتر تركيز يزيد بشكل ملحوظ إنتاج البروتينات الجالي. تم تطبيع البيانات إلى نسبة الجالي/كوفيلين في عدم تعامل SMA الليفية. تمثل الأشرطة يعني ± الانحراف المعياري (أربع تجارب مستقلة). أحادي الاتجاه ANOVA مع دونيت وأجرى العديد من التجارب المقارنة. م: موك التحكم، NT: غير المعالجة. ويرد هذا الرقم من توزنيك et.al. 13- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في المختبر تقييم الأسلوب الموصوفة هنا سريعة وسهلة وحساسة بما يكفي لاختبار AONs مختلف. هذا البروتوكول قابلاً للتطبيق على نطاق واسع لتخطي إكسون وإدراج جينات أخرى ومختلف أنواع الخلايا. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن ترانسفيكتيد معظم أيون كيمياء (باستثناء موظفي) باستخدام هذا الأسلوب. AONs يمكن تنظيم الربط من قبل-مرناً من الجينات الذاتية وأدخلت اصطناعياً على حد سواء، ويمكن أن يشترك transfected مع بلازميد ناقلات تحمل الجينات المستهدفة.
خطوة حاسمة لهذا الأسلوب أن كونفلوينسي خلية ينبغي أن يكون حوالي 65-80% عندما يتم transfected AONs في الخلايا الليفية. هذا الشرط قد تكون مختلفة بالنسبة لأنواع الخلايا الأخرى. تركيز أفضل من AONs تعداء أيضا يمكن أن تكون مختلفة (0.5-100 نانومتر)، وتبعاً لتسلسل المستهدفة وأنواع الخلايا.
هذا الأسلوب لا يخلو المزالق المحتملة. على سبيل المثال، تتحدد فعالية ميكسميرس تسلسل ميكسميرس وتكوينها LNA/الحمض النووي. للمحطة الفضائية الدولية-N1، ميكسمير، التي تتألف من لناس مع الحمض النووي يجري الاستعاضة عن LNA في كل موقف النوكليوتيدات الثالث، كان أكثر فعالية من ميكسمير مع تسلسل مكافئ مع استبدال الحمض النووي في كل أخرى النوكليوتيدات أو كل-LNA اليغنوكليوتيد13 . ومع ذلك، قد يكون هذا مختلفة بالنسبة لتسلسل المستهدفة الأخرى. ولذلك، من الضروري تحسين تسلسل ميكسميرس LNA/الحمض النووي وتقييم فعالية ميكسميرس على مستوى الحمض النووي الريبي قبل المضي قدما. يجب أن يكون العمود الفقري كامل من ميكسميرس فوسفوروثيواتيد لمنع التدهور. بالإضافة إلى ذلك، على الرغم من أن يمكن استخدام هذا الأسلوب بوساطة ليبوترانسفيكشن تعداء لمعظم أيون كيمياء، لا يمكن استخدامه محايدة لتهمة فوسفورودياميداتي morpholino ليغومرات (بالرصدات)، حيث يتطلب ليبوترانسفيكشن سلبا على النوكليوتيد مشحونة. لأساليب تعداء مكتب إدارة المشاريع، انظر في أماكن أخرى23،،من2425.
على الرغم من أن هذا الأسلوب مفيد لاختبار AONs الرواية، لا الخص نموذج الخلية تنتجها الخلايا الليفية SMA في فيفو الظروف في مجملها. نماذج حيوانية يمكن أن تخدم كمصدر هام لاختبار في فيفو والمامونية26.
لتخطي إكسون/إدراج، يمكن استخدام مكتب إدارة المشاريع والتعديل 2 '-O-ميثوكسييثيل (2' وزارة التربية والتعليم) بدلاً من LNA/الحمض النووي ميكسميرس27،28. بيد أن تركيز هذه كيمياء تعداء الأمثل هي عادة كثير29،أعلى30. بسبب كفاءة أفضل بالمقارنة مع كيمياء العقاقير الأخرى، يمكن استخدام LNA/الحمض النووي القائم على ميكسمير العقاقير النوكليوتيد استراتيجية علاجية جذابة لعلاج الربط العيوب الناجمة عن الأمراض الوراثية في المستقبل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
يشكر المؤلفون نيكول مكروري للحصول على مساعدة التجارب. هذا العمل كان تدعمها جامعة ألبرتا كلية الطب وطب الأسنان، منحة بحثية مؤسسة البحوث SMA سليبتشوك، المعاهد الكندية للبحوث الصحية (استوفوا)، أصدقاء أموال البحث غاريت كومينغ، العصبي توبين جلالة أموال البحث العلمي، أن كندا ضمور العضلات، ومؤسسة كندا للابتكار، والمؤسسة ألبرتا والتعليم المتقدم، والنساء والأطفال معهد البحوث الصحية (وتشري).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SMA Fibroblasts | Coriell NIGMS human genetic cell repository | GM03813 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher | 11320033 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F1051 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher | 25300062 | |
| Serum-deprived media | Thermo Fisher | 31985070 | |
| Transfection reagent | Thermo Fisher | 15338100 | |
| guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform (TRIzol) | Thermo Fisher | 15596-018 | |
| RT-PCR Primers | Sequence 5' to 3' | ||
| SMN2 forward: | CTGCCTCCATTTCCTTCTG | ||
| SMN2 reverse: | TGGTGTCATTTAGTGCTGCTC | ||
| GAPDH forward: | TCCCTGAGCTGAACGGGAAG | ||
| GAPDH reverse: | GGAGGAGTTTGGTCGCTGT | ||
| qPCR Primers | |||
| full-length SMN2 forward: | GCTATCATACTGGCTATTATATGGGTTTT | ||
| full-length SMN2 reverse: | CTCTATGCCAGCATTTCTCCTTAAT | ||
| GAPDH forward: | GCAAATTCCATGGCACCGT | ||
| GAPDH reverse: | AGGGATCTCGCTCCTGGAA | ||
| Chloroform | Sigma-Aldrich | P3803 | |
| Glycogen, RNA grade | Thermo Fisher | R0551 | |
| ImageJ Software | |||
| Protease cocktail inhibitor | Roche | 11836153001 | |
| Cathode Buffer | 0.025 M Tris base + 40 mM 6-aminocaproic acid + 20% Methanol | ||
| Anode Buffer | 0.03 M Tris Base + 20% Methanol | ||
| Concentred Anode Buffer | 0.3 M Tris base + 20% Methanol | ||
| Beta Mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | |
| PVDF membrane | GE | 10600021 | |
| Loading/sample buffer for Western blotting | NuPage Invitrogen | NP007 | |
| One-Step RT-PCR kit | Qiagen | 210210 | |
| dNTPs | Clontech | 3040 |
References
- Iascone, D. M., Henderson, C. E., Lee, J. C. Spinal muscular atrophy: from tissue specificity to therapeutic strategies. F1000Prime Rep. 7, 4 (2015).
- Touznik, A., Lee, J. J., Yokota, T. New developments in exon skipping and splice modulation therapies for neuromuscular diseases. Expert Opin Biol Ther. 14 (6), 809-819 (2014).
- Lefebvre, S., et al. Identification and Characterization of a Spinal Muscular Atrophy-Determining Gene. Cell. 80 (1), 155-165 (1995).
- Lorson, C. L., Hahnen, E., Androphy, E. J., Wirth, B. A single nucleotide in the SMN gene regulates splicing and is responsible for spinal muscular atrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (11), 6307-6311 (1999).
- Monani, U. R., et al. A single nucleotide difference that alters splicing patterns distinguishes the SMA gene SMN1 from the copy gene SMN2. Hum Mol Genet. 8 (7), 1177-1183 (1999).
- Lee, J. J., Yokota, T. Antisense therapy in neurology. J Pers Med. 3 (3), 144-176 (2013).
- Aartsma-Rus, A. FDA Approval of Nusinersen for Spinal Muscular Atrophy Makes 2016 the Year of Splice Modulating Oligonucleotides. Nucleic Acid Ther. 27 (2), 67-69 (2017).
- Hua, Y., et al. Peripheral SMN restoration is essential for long-term rescue of a severe spinal muscular atrophy mouse model. Nature. 478 (7367), 123-126 (2011).
- Hua, Y., Vickers, T. A., Baker, B. F., Bennett, C. F., Krainer, A. R. Enhancement of SMN2 exon 7 inclusion by antisense oligonucleotides targeting the exon. PLoS Biol. 5 (4), 73 (2007).
- Passini, M. A., et al. Antisense oligonucleotides delivered to the mouse CNS ameliorate symptoms of severe spinal muscular atrophy. Sci Transl Med. 3 (72), (2011).
- Hammond, S. M., et al. Systemic peptide-mediated oligonucleotide therapy improves long-term survival in spinal muscular atrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (39), 10962-10967 (2016).
- Porensky, P. N., et al. A single administration of morpholino antisense oligomer rescues spinal muscular atrophy in mouse. Hum Mol Genet. 21 (7), 1625-1638 (2012).
- Touznik, A., Maruyama, R., Hosoki, K., Echigoya, Y., Yokota, T. LNA/DNA mixmer-based antisense oligonucleotides correct alternative splicing of the SMN2 gene and restore SMN protein expression in type 1 SMA fibroblasts. Sci Rep. 7 (1), 3672 (2017).
- Obika, S., et al. Synthesis of 2'-O,4'-C-methyleneuridine and -cytidine. Novel bicyclic nucleosides having a fixed C-3,-endo sugar puckering. Tetrahedron Letters. 38 (50), 8735-8738 (1997).
- Singh, S. K., Nielsen, P., Koshkin, A. A., Wengel, J. LNA (locked nucleic acids): synthesis and high-affinity nucleic acid recognition. Chemical Communications. (4), 455-456 (1998).
- Navarro, E., Serrano-Heras, G., Castano, M. J., Solera, J. Real-time PCR detection chemistry. Clin Chim Acta. 439, 231-250 (2015).
- Urbanek, M. O., Nawrocka, A. U., Krzyzosiak, W. J. Small RNA Detection by in Situ Hybridization Methods. Int J Mol Sci. 16 (6), 13259-13286 (2015).
- Wahlestedt, C., et al. Potent and nontoxic antisense oligonucleotides containing locked nucleic acids. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (10), 5633-5638 (2000).
- Rupaimoole, R., Slack, F. J. MicroRNA therapeutics: towards a new era for the management of cancer and other diseases. Nat Rev Drug Discov. 16 (3), 203-222 (2017).
- Lanford, R. E., et al. Therapeutic silencing of microRNA-122 in primates with chronic hepatitis C virus infection. Science. 327 (5962), 198-201 (2010).
- Shimo, T., Maruyama, R., Yokota, T. Designing Effective Antisense Oligonucleotides for Exon Skipping. Methods Mol Biol. 1687, 143-155 (2018).
- Shimo, T., et al. Design and evaluation of locked nucleic acid-based splice-switching oligonucleotides in vitro. Nucleic Acids Res. 42 (12), 8174-8187 (2014).
- Nguyen, Q., Yokota, T. Immortalized Muscle Cell Model to Test the Exon Skipping Efficacy for Duchenne Muscular Dystrophy. J. Pers. Med. 7 (4), 13 (2017).
- Echigoya, Y., et al. Quantitative Antisense Screening and Optimization for Exon 51 Skipping in Duchenne Muscular Dystrophy. Mol Ther. , (2017).
- Saito, T., et al. Antisense PMO found in dystrophic dog model was effective in cells from exon 7-deleted DMD patient. PLoS One. 5 (8), 12239 (2010).
- Donnelly, E. M., et al. Characterization of a murine model of SMA. Neurobiol Dis. 45 (3), 992-998 (2012).
- Lim, K. R., Maruyama, R., Yokota, T. Eteplirsen in the treatment of Duchenne muscular dystrophy. Drug Des Devel Ther. 11, 533-545 (2017).
- Paton, D. M. Nusinersen: antisense oligonucleotide to increase SMN protein production in spinal muscular atrophy. Drugs Today (Barc). 53 (6), 327-337 (2017).
- Prakash, T. P., et al. Comparing in vitro and in vivo activity of 2'-O-[2-(methylamino)-2-oxoethyl]- and 2'-O-methoxyethyl-modified antisense oligonucleotides. J Med Chem. 51 (9), 2766-2776 (2008).
- Aoki, Y., et al. Bodywide skipping of exons 45-55 in dystrophic mdx52 mice by systemic antisense delivery. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (34), 13763-13768 (2012).
