Summary
Olika antisense oligonukleotider (AONs) har visat sig inducera exon integration (splice modulering) och rädda SMN uttryck för spinal muskelatrofi (SMA). Här beskriver vi ett protokoll för AON lipotransfection att framkalla exon integration i SMN2 genen och utvärderingsmetoder att avgöra effekten hos SMA patienternas fibroblaster.
Abstract
Spinal muskelatrofi (SMA), en dödlig neurologisk sjukdom som orsakas av förlust av SMN1, presenterar ett unikt fall i fältet av antisense oligonukleotiden (AON)-medierad terapi. Medan SMN1 mutationer ansvarar för sjukdomen, inklusive FDA-godkända nusinersen, AONs inriktning intronic skarv ljuddämpare (ISS) platser i SMN2, har visat att återställa SMN uttryck och lindra symtomen. För närvarande, många studier med AON terapi för SMA fokuserar på utreda roman AON kemier inriktning SMN2 som kan vara mer effektiva och mindre giftigt än nusinersen. Här beskriver vi ett protokoll för in vitro- utvärdering av exon integration med lipotransfection av AONs följt av polymeraskedjereaktion för omvänd Transkription (RT-PCR), kvantitativa polymeras-kedjereaktion (qPCR) och Western blotting. Denna metod kan användas för olika typer av AON kemiska sammansättningar. Med den här metoden visar vi att AONs består av omväxlande låst nukleinsyror (LNAs) och DNA nukleotider (LNA/DNA mixmers) leda till effektiva SMN2 exon integration och restaurering av SMN protein vid en mycket låg koncentration och därför LNA / DNA mixmer-baserade antisense oligonukleotider kan vara en attraktiv terapeutisk strategi att behandla skarvning defekter orsakade av genetiska sjukdomar. In vitro- utvärderingsmetoden som beskrivs här är snabb, lätt och känslig nog för testning av olika roman AONs.
Introduction
Spinal muskelatrofi (SMA) är en dödlig neuromuskulär sjukdom ärvs på ett autosomalt recessivt mönster. Det kännetecknas av nedbrytningen av motoriska nervceller och progressiva bål och extremiteter muskler förlamning1,2. Majoriteten av SMA förekomster är på grund av en homozygot mutation i survival motor neuron 1 (SMN1) gen3. Överlevnad motorneuronen 2 (SMN2) genen är en inverterad dubblett av SMN1, och har en nästan identisk sekvens avviker endast fem baser4,5. En C-till-T övergång i SMN2 ligger i exon 7 gör genen nästan nonfunctional eftersom mutationen leder till att väsentliga exon 7 utesluts i nästan 90% av SMN2 avskrifter (figur 1en). SMN2 mRNA saknas exon 7 kan inte kompensera för funktionen SMN1 eftersom dess proteinprodukt är instabila och bryts ned snabbt.
Antisense terapi nyligen uppstått som en mycket lovande strategi för behandling av SMA6. Senaste godkännande av nusinersen av US Food and Drug Administration (FDA) gjorde det första läkemedel tillgängliga för behandling av SMA7. Nusinersen är en 18-mer antisense oligonukleotiden (AON) med en 2 '-O-methoxyethyl ändring (MOE) och en phosphorothioate ryggrad. Drogen riktar intronic skarvning ljuddämparen N1 (ISS-N1) ligger i intron 7 av SMN2 -genen. Bindning av nusinersen till ISS-N1 främjar återhämtningen av funktionella fullängds SMN proteinuttryck från endogena SMN2 -genen genom att inducera exon 7 integration (figur 1en)8,9,10 . För närvarande, många studier med AON terapi för SMA fokuserar på utreda roman AON kemiska sammansättningar som kan vara mer effektiva och mindre giftigt än nusinersen. Det har visats att AONs med andra kemiska sammansättningar också effektivt inducerar exon integration i SMN2 exon 7 både in vitro- och in-vivo11,12,13.
Det är kemiskt modifierade RNA analoger som innehåller en metylen-bro som förbinder 4′ -kol med 2′ -syre inom furanose struktur (figur 1b)14,15låst nukleinsyror (LNAs). Jämfört med DNAs eller RNAs, LNAs har en ökad affinitet för bindning till kompletterande RNA sekvenser och har fördelen av att vara mycket resistent mot endogena nukleaser. LNA kemi har tillämpats för användning som sonder för fluorescens i situ hybridisering (FISH) och qPCR16,17. Också, den används för att reglera genuttrycket både in vitro- och in vivo. GapmeR AONs är en kombination av enkelsträngat DNA-molekyler flankerad av flera LNAs 5′ och 3′ ändar. De slå ner genuttryck av bindande kompletterar riktade mRNA, vilket får dem att brytas ned av den aktiverade RNase H18. LNA/DNA mixmers är AONs som består av DNA nukleotider integrerad mellan LNAs. Presenteras i denna inriktning kan de binda miRNA hämma dess funktion (LNA-antimiR)19. Vissa LNA-antimiRs har nått klinisk utveckling. För exempel, miravirsen (AntimiR-122) är en LNA-antimiR som hämmar miR-122 för att behandla hepatit C-infektion och flera Fasii kliniska prövningar är för närvarande pågår19,20. Det har nyligen visats att LNA/DNA mixmers också kan modulera RNA skarvning21. Det kan binda en specifik sekvens av mRNA och inducera exon hoppa i dystrofin mRNA och exon inkludering i SMN2 mRNA in vitro-13,22.
I den här artikeln beskriver vi en metod för induktion av exon integration använder AONs och utvärdering av effekten på RNA och protein nivåer. För att exemplifiera denna metod, använde vi den LNA/DNA mixmers inriktning ISS-N1 i intron 7 av SMN2. AONs transfekterade i SMA patientens celler av lipotransfection inducerad exon 7 integration i den slutliga SMN2 avskrift och uppreglering av SMN proteinproduktion. En av fördelarna med att använda LNA/DNA mixmers för att framkalla exon införande är att den effektiva koncentrationen av transfection är betydligt lägre än övriga kemier13. Denna metod kan användas för många andra AONs utom phosphorodiamidate morpholino oligomerer (PMOs), som på grund av deras neutrala avgift, behöver komma in i cellerna genom endocytos induceras av Endo-Porter samtidig transfection reagensen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. cell kultur
- Kultur SMA patienternas fibroblaster i odlingsmedium (Dulbeccos modifierad Eagle medium 1: 1 F-12 (Ham) med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 0,5% penicillin/streptomycin) i en CO2 inkubator vid 37 ° C.
- Bestämma cellkoncentrationen med en automatisk cell räknare och späd cellerna till 1 x 105 celler/mL i odlingsmedium, då utsäde på lämpliga plattan. Använd 12-brunnar (1 mL per brunn) för RT-PCR eller qPCR.
- Inkubera plattorna för 24 h i en CO2 inkubator vid 37 ° C.
2. LNA/DNA mixmer transfection
- Se till att cell konfluens på runt 65-80% för optimal transfection effektivitet.
- Tina 10 μM LNA/DNA mixmers långsamt på is.
- I en 1,5 mL tub, Bered en 20 x mixmer genom att lägga till mixmers serum-berövade media så att den slutliga volymen når 50 μL.
- Blanda mixmer lösningen med 50 μl serum-berövade media som innehåller 3% transfection reagens (1:1 ratio).
- Inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur.
- Lägga till 900 μl serum-berövade medium med 5% FBS till varje rör.
- Aspirera gamla media från plattan och ersätta med 1 mL LNA/DNA mixmer lösning innehållande transfection reagensen.
- Inkubera cellerna för 24-48 timmar vid 37 ° C i en CO2 inkubator.
3. RNA-extraktion
- Ta bort mediet och tillsätt 1 mL guanidinium kaliumtiocyanat-fenol-kloroform reagens till cellerna. Tvätta botten av de väl flera gånger med guanidinium kaliumtiocyanat-fenol-kloroform och samla in det i 1,5 mL tuber.
- Vortex med hög hastighet för 30 s och förvaras vid-80 ° C för 1 tim eller över natten.
- Tina proverna vid rumstemperatur och vortex väl.
- Tillsätt 200 µL kloroform, skaka kraftigt för 15 s, och odla i rumstemperatur i 3 min.
- Centrifugera vid 12 000 x g under 15 minuter vid 4 ° C.
- Samla in högsta klart vattenfasen i en ny tub. Se till att undvika att samla någon av vita interphasen som bildas mellan de övre och nedre faserna.
- Tillsätt 500 µL isopropanol och 1 µL 8 µg/µL glykogen (RNA grad). Virvel för 10 s och inkubera i rumstemperatur i 10 min eller vid-20 ° C över natten.
- Centrifugera vid 12 000 x g i 10 minuter vid 4 ° C och ta bort alla av supernatanten. En vit pellet bildar på botten av röret.
- Tillsätt 1 mL kall 75% etanol och centrifugera vid 7 500 x g under 5 minuter vid 4 ° C.
- Ta bort alla etanol och torka pelleten i rumstemperatur tills ingen etanol finns kvar i röret.
- Lös upp pelleten i 30 µL DNAS/RNase gratis vatten och inkubera i 10 min vid 60 ° C.
- Mäta RNA-koncentrationen med en spektrofotometer (på 260 nm), och justera RNA-koncentrationen till 50 ng/µL.
4. ett steg RT-PCR för att mäta andelen exon inkludering av SMN2
- Blanda 12,5 µL av 2 x RT-PCR-reaktion buffert, 1,0 µL av one-step RT-PCR enzym blanda, 0,5 µL av varje grundfärg (SMN2 framåt: 5'-CTGCCTCCATTTCCTTCTG-3', SMN2 omvänd: 5'-TGGTGTCATTTAGTGCTGCTC-3', GAPDH framåt: 5'-TCCCTGAGCTGAACGGGAAG-3', GAPDH omvänd: 5'-GGAGGAGTTTGGTCGCTGT-3', 2 µL av total-RNA (50 ng/µL), och 8,5 µL RNase/DNAS-free destillerat vatten.
- Efter cDNA syntetiseras vid 50 ° C under 15 minuter, starta PCR-reaktionen. Förstärka den SMN2 exon 6-8 med 30 PCR-cykler (94 ° C för 15 s, 60 ° C under 30 s, 68 ° C för 25 s). Förstärka GAPDH med 20 PCR-cykler (94 ° C för 15 s, 60 ° C under 30 s, 68 ° C för 20 s).
- Tillsätt 5 μl 6 x laddar dye till PCR-produkten, och läsa in 5 µL av blandningen i en 2% agarosgel och köra i 40 min vid 100 V.
- Bild gelen och analysera den med ImageJ programvara.
- Mäta intensiteten i hellånga band och Δ7 band. Beräkna exon 7 integration av intensitet värde (fullängds) / (fullängds + Δ7 SMN2).
5. kvantitativ PCR (qPCR) att mäta andelen exon inkludering av SMN2
- För cDNA syntes, blanda 1 µL Oligo dT, 1 µL 10 mM dNTP, och 11 µL totalt RNA (50 ng/µL). Inkubera vid 65 ° C i 5 min.
- Placera proverna på is och tillsätt 4 µL 5 x buffert, 1 µL 0,1 M DTT, 1 µL RNase inhibitor och 1 µL omvänt transkriptas till varje prov.
- Inkubera vid 50 ° C i 60 min och Värm upp till 80 ° C i ca 10 min att stoppa reaktionen. CDNA kan förvaras vid-20 ° C.
- Späd cDNAs med RNase-fritt vatten (spädningen 1:5). Blanda 10 µL 2 x SYBR Green qPCR enzym mix, 0.8 µL 10 µM varje primer (fullängds SMN2 framåt: 5′-GCTATCATACTGGCTATTATATGGGTTTT-3′, fullängds SMN2 omvänd: 5′-CTCTATGCCAGCATTTCTCCTTAAT-3′, Δ7 SMN2 framåt: 5′ - TCTGGACCACCAATAATTCCCC-3′, Δ7 SMN2 omvänd: 5′-ATGCCAGCATTTCCATATAATAGCC-3′, GAPDH framåt: 5′-GCAAATTCCATGGCACCGT-3′, GAPDH omvänd: 5′-AGGGATCTCGCTCCTGGAA-3′), 3 µL utspädd cDNA och 5,4 µL RNase-gratis vatten.
- Starta qPCR reaktionen. Använda villkor: 95 ° C i 30 s, sedan en 40 cykel upprepa vid 95 ° C för 5 s och 60 ° C för 20 s.
- Beräkna det relativa uttrycket för fullängds SMN2 till GAPDH eller Δ7 SMN2och normalisera till de icke-behandlade cellerna med ΔΔCt algoritmen.
6. Western blotting
- Ta bort transfection medium från celler och tvätta med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) en gång.
- Tillsätt 100 μl lyseringsbuffert med en proteashämmare.
- Lossa cellerna från botten av varje brunn med hjälp av en steril cell skrapa, och samla in 1,5 mL rören. Inkubera prover på is i 30 min.
- Passera cell lysate 21-G nål 10 gånger för att krossa cellerna.
- Centrifugera vid 20,800 x g i 15 minuter vid 4 ° C och samla in supernatanten i nya 1,5 mL rör. Provet kan förvaras i en-80 ° C frys.
- Bestämma proteinkoncentration använder ett BCA Protein Assay Kit och justera koncentrationen till 1,0 µg/µL.
- Blanda 5 µL prov och 5 µL 2 x sodium dodecyl sulfate (SDS) prov buffert (10% SDS; 14% 0,5 M Tris-HCl-lösning, pH 6,7; 1% 0,5 M EDTA-2Na stamlösning, pH 8,0; 20% Glycerol; 0,004% bromofenolblått dye, 5% β-merkaptoetanol) och värme vid 70 ° C i 10 min.
- Läsa in proverna i en 4-12% Bis-Tris Protein gels och kör för 1 h 150 V.
- Blöt en tjock filterpapper i varje buffert: (koncentrerad anod buffert: 0,3 M Tris-HCl, 20% metanol; anod buffert: 0,03 M Tris-HCl, 20% metanol; katod buffert: 25 mM Tris, 20% metanol, 40 mM 6-amino-n-hexanoic syra, 0,01% SDS).
- Blötlägg ett polyvinylidene kryptondifluorid (PVDF) membran i metanol för 20 s, sedan överföra den till anoden bufferten.
- Temperera gelen efter SDS-PAGE med katod bufferten för 5-10 min under agitation.
- Placera filtrerpapper, PVDF membran och gelen på en halvtorr blotting maskin, enligt följande: koncentrerad anod buffert papper/anod buffert papper/PVDF/membranprotein gel/katod buffert papper (figur 2).
- Täcka stacken och starta överföringen på 20 V i 30 min.
- Efter överföringen, skölj PVDF membranet med PBST (PBS med 0,05% Tween-20) en gång.
- Blockera membranet i rumstemperatur i 30 min i 5% skummjölkspulver upplöstes i PBST eller vid 4 ° C för övernattning.
- Späd en renad mus anti-SMN antikropp och en kanin-anti-Cofilin-antikropp till 1:10,000 i 5% skummjölkspulver i PBST. Inkubera membranet i det för 1 h i rumstemperatur eller vid 4 ° C över natten.
- Tvätta 3 gånger med PBST i 10 min.
- Späd sekundära antikroppar (HRP-konjugerad get antimus och anti-kanin IgG (H + L)) till 1:10,000 i 5% skummjölkspulver i PBST. Inkubera i 1 h i rumstemperatur i mörkret.
- Tvätta membranet 3 gånger med PBST i 10 min.
- Upptäcka band signalen med chemiluminescence Western blotting upptäckt kit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med SMA patienternas fibroblaster, riktade vi regionen ISS-N1 ljuddämpare i intron 7 av SMN2 genen med åtta olika antisense LNA/DNA mixmers som var transfekterade vid en koncentration av 5 nM (figur 3). Var och en av mixmers innehöll en modifierad phosphorothioated ryggrad som gjorde det möjligt för dem att motstå nuclease-nedbrytning. För att utvärdera effekten av mixmers, graden av SMN2 exon kvantifierades 7 integration genom RT-PCR och qPCR med primers som är specifika för SMN2. Inkludering effektiviteten i exon 7 varierade från 78-98% när transfekterade med mixmers #1-5 i patientens celler (figur 4a, b), medan transfection utnyttja mixmers #6-8 på samma dos resulterade inte i någon signifikant skillnad jämfört med kontrollen. Resultaten från qPCR-analys visas också som mängden fullängds SMN2 mRNA avskrift betydligt ökade mixmers #1-3 och #5 behandlingar jämfört med kontroll (figur 4c).
Dessutom resultatet av de Western blotting visade att transfection använda mixmers #1-5 aktiverade högre nivåer av SMN proteinuttryck i patienternas fibroblaster (en 1,5 - 1.9-fold ökning från kontrollen, figur 5). De behandlingar som med hjälp av mixmers #6-8 resulterade inte i en förändring av SMN protein uttryck nivån i cellerna. Dessa data visar att transfection LNA/DNA mixmers #1-5 inducerar den SMN2 exon 7 integration effektivt i SMA patienternas fibroblaster.
Figur 1 : Strategi för integrering av antisense-medierad exon att behandla SMA. (a) en C-till-T övergång i exon 7 av SMN2 leder till att hoppa av exon 7 i cirka 90% av SMN2 avskrifter. Dessa avskrifter är ute-av-frame och har snabbt försämrats i cellerna. Antisense oligonukleotider (AONs) binder intronic skarvning ljuddämparen N1 (ISS-N1), som inducerar exon integration i SMN2. Exon 7-ingår SMN2 mRNA kan producera funktionella SMN protein. (b) kemiska strukturer av RNA och phosphorothioated LNA. De hela ryggrader av den mixmers som vi använde i denna artikel är phosphorothioated att förhindra nedbrytning. Denna siffra har ändrats från Touznik et.al. 13. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2 : Halvtorr överföringsmetod för Western blotting. Ett tjockt filter papper indränkt i koncentrerade (m.) anod buffert, tjocka filterpapper indränkt i anoden buffert, PVDF membran, en gel och en tjock filterpapper indränkt i katoden buffert är staplade mellan de två plattorna i en halvtorr blotting maskin. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : LNA/DNA mixmer sekvens för SMN2 exon 7 integration. DNA bas: G, A, T, C. LNA base (röd): + G, + A + T, + C. Phosphorothioated DNA bas: G * A * T *, C *. Phosphorothioated LNA base (röd): + G *, A *, + T *, + C *. Denna siffra är Reproducerad från Touznik et.al. 13. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4 : Representativa resultat av RT-PCR och qPCR för att utvärdera effekten av den LNA/DNA-mixmers. Transfection av mixmers #1-5 leder till SMN2 exon 7 integration på en betydligt högre takt än de håna transfection. (en) RT-PCR SMN2 och GAPDH i SMA patienternas fibroblaster efter transfection vid koncentration av 5 nM. Övre band: exon 7-ingår fullängds SMN2 mRNA. Nedre band: exon 7-uteslutna SMN2 mRNA. (b), kvantitativ analys av SMN2 exon 7 integration i mixmer-behandlade SMA fibroblaster med RT-PCR. (c), relativ uttryck analys av fullängds SMN2 till GAPDH uppmätt med qPCR. Data var normaliserade till icke-behandlade kontroll celler. Felstaplar representera medelvärde ± standardavvikelse (tre oberoende experiment). Envägs ANOVA med Dunnetts flera jämförelsetest utfördes. M: håna kontroll, NT: icke-behandlade, H: frisk kontroll fibroblast celler, B: tomt. Denna siffra är Reproducerad från Touznik et.al. 13. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 5 : Representativa resultat av Western blotting för att mäta SMN proteinuttryck. Transfection av den LNA/DNA mixmers ökar SMN proteinproduktion. (a) Western blotting av SMN och Cofilin (lastning kontroll) av friska och mixmer-behandlade SMA patienternas fibroblaster. (b) faldig ökning av SMN proteinnivåer av mixmer-behandlade SMA fibroblaster. Transfection av mixmers #1-5 vid koncentration av 5 nM ökar avsevärt produktionen av SMN protein. Data var normaliserade till förhållandet mellan SMN/Cofilin i icke-behandlade SMA fibroblaster. Staplarna representerar medelvärde ± standardavvikelse (fyra oberoende experiment). Envägs ANOVA med Dunnetts flera jämförelsetest utfördes. M: håna kontroll, NT: icke-behandlade. Denna siffra är Reproducerad från Touznik et.al. 13. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In vitro- utvärderingsmetoden som beskrivs här är snabb, lätt och känslig nog för testning av olika AONs. Detta protokoll är allmänt tillämpliga på exon hoppa och integrering av andra gener och olika celltyper. Dessutom kan de flesta AON kemier (utom PMOs) vara transfekterade med denna metod. AONs kan reglera skarvning av pre-mRNA från både endogena och artificiellt införda gener, och kan vara co transfekterade med plasmid vektorer bär riktade gener.
Ett avgörande steg i denna metod är att den cellen konfluens bör ligga runt 65-80% när AONs är transfekterade in fibroblaster. Detta tillstånd kan vara annorlunda för andra celltyper. Den bästa koncentrationen av AONs för transfection kan också vara olika (0,5 - 100 nM), beroende på riktade sekvenser och celltyper.
Denna metod är inte utan potentiella fallgropar. Till exempel bestäms effekten av mixmers av sekvenserna av mixmers och LNA/DNA sammansättning. ISS-N1 var en mixmer, som består av LNAs med DNA ersätts LNA vid varje tredje nukleotid-position, effektivare än en mixmer med en motsvarande sekvens med DNA substitution på varje andra nukleotid eller all-LNA oligonukleotiden13 . Detta kan dock vara annorlunda för andra mål sekvenser. Därför är det nödvändigt att optimera sekvenser av LNA/DNA mixmers och utvärdera effekten av mixmers på RNA-nivå innan du går vidare. De hela ryggrader av mixmers bör phosphorothioated att förhindra nedbrytning. Dessutom, även om denna lipotransfection-medierad transfection metod kan användas för de flesta AON kemiska sammansättningar, det kan inte användas för laddning-neutral phosphorodiamidate morpholino oligomerer (PMOs), eftersom lipotransfection kräver negativt laddade oligonukleotider. För PMO transfection metoder, se någon annanstans23,24,25.
Även om denna metod är användbar för testning roman AONs, SMA fibroblast cell modell inte sammanfatta i vivo villkor i sin helhet. Djurmodeller kan fungera som en viktig källa att testa den i vivo effekt och säkerhet26.
För exon hoppa/integration, kan PMO och 2 '-O-methoxyethyl modifiering (2' MOE) användas i stället för LNA/DNA mixmers27,28. Den optimala koncentrationen av dessa kemiska sammansättningar för transfection är dock vanligen mycket högre29,30. På grund av bättre effekt jämfört med andra antisense kemier, kan LNA/DNA mixmer-baserade antisense oligonukleotider användas i en attraktiv terapeutisk strategi att behandla skarvning defekter orsakade av genetiska sjukdomar i framtiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Nicole McRorie för hjälp med experimenten. Detta arbete stöds av University of Alberta fakulteten av läkemedel och tandvård, Slipchuk SMA forskning stiftelsen forskningsbidrag, den kanadensiska institut för hälsa forskning (CIHR), vänner av Garrett Cumming forskningsmedel, HM Toupin neurologisk Vetenskap forskningsmedel, Kanadas muskeldystrofi, Kanada Stiftelsen för Innovation, Alberta Enterprise och avancerad utbildning, och kvinnor och barns hälsa Research Institute (WCHRI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SMA Fibroblasts | Coriell NIGMS human genetic cell repository | GM03813 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher | 11320033 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F1051 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher | 25300062 | |
| Serum-deprived media | Thermo Fisher | 31985070 | |
| Transfection reagent | Thermo Fisher | 15338100 | |
| guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform (TRIzol) | Thermo Fisher | 15596-018 | |
| RT-PCR Primers | Sequence 5' to 3' | ||
| SMN2 forward: | CTGCCTCCATTTCCTTCTG | ||
| SMN2 reverse: | TGGTGTCATTTAGTGCTGCTC | ||
| GAPDH forward: | TCCCTGAGCTGAACGGGAAG | ||
| GAPDH reverse: | GGAGGAGTTTGGTCGCTGT | ||
| qPCR Primers | |||
| full-length SMN2 forward: | GCTATCATACTGGCTATTATATGGGTTTT | ||
| full-length SMN2 reverse: | CTCTATGCCAGCATTTCTCCTTAAT | ||
| GAPDH forward: | GCAAATTCCATGGCACCGT | ||
| GAPDH reverse: | AGGGATCTCGCTCCTGGAA | ||
| Chloroform | Sigma-Aldrich | P3803 | |
| Glycogen, RNA grade | Thermo Fisher | R0551 | |
| ImageJ Software | |||
| Protease cocktail inhibitor | Roche | 11836153001 | |
| Cathode Buffer | 0.025 M Tris base + 40 mM 6-aminocaproic acid + 20% Methanol | ||
| Anode Buffer | 0.03 M Tris Base + 20% Methanol | ||
| Concentred Anode Buffer | 0.3 M Tris base + 20% Methanol | ||
| Beta Mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | |
| PVDF membrane | GE | 10600021 | |
| Loading/sample buffer for Western blotting | NuPage Invitrogen | NP007 | |
| One-Step RT-PCR kit | Qiagen | 210210 | |
| dNTPs | Clontech | 3040 |
References
- Iascone, D. M., Henderson, C. E., Lee, J. C. Spinal muscular atrophy: from tissue specificity to therapeutic strategies. F1000Prime Rep. 7, 4 (2015).
- Touznik, A., Lee, J. J., Yokota, T. New developments in exon skipping and splice modulation therapies for neuromuscular diseases. Expert Opin Biol Ther. 14 (6), 809-819 (2014).
- Lefebvre, S., et al. Identification and Characterization of a Spinal Muscular Atrophy-Determining Gene. Cell. 80 (1), 155-165 (1995).
- Lorson, C. L., Hahnen, E., Androphy, E. J., Wirth, B. A single nucleotide in the SMN gene regulates splicing and is responsible for spinal muscular atrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (11), 6307-6311 (1999).
- Monani, U. R., et al. A single nucleotide difference that alters splicing patterns distinguishes the SMA gene SMN1 from the copy gene SMN2. Hum Mol Genet. 8 (7), 1177-1183 (1999).
- Lee, J. J., Yokota, T. Antisense therapy in neurology. J Pers Med. 3 (3), 144-176 (2013).
- Aartsma-Rus, A. FDA Approval of Nusinersen for Spinal Muscular Atrophy Makes 2016 the Year of Splice Modulating Oligonucleotides. Nucleic Acid Ther. 27 (2), 67-69 (2017).
- Hua, Y., et al. Peripheral SMN restoration is essential for long-term rescue of a severe spinal muscular atrophy mouse model. Nature. 478 (7367), 123-126 (2011).
- Hua, Y., Vickers, T. A., Baker, B. F., Bennett, C. F., Krainer, A. R. Enhancement of SMN2 exon 7 inclusion by antisense oligonucleotides targeting the exon. PLoS Biol. 5 (4), 73 (2007).
- Passini, M. A., et al. Antisense oligonucleotides delivered to the mouse CNS ameliorate symptoms of severe spinal muscular atrophy. Sci Transl Med. 3 (72), (2011).
- Hammond, S. M., et al. Systemic peptide-mediated oligonucleotide therapy improves long-term survival in spinal muscular atrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (39), 10962-10967 (2016).
- Porensky, P. N., et al. A single administration of morpholino antisense oligomer rescues spinal muscular atrophy in mouse. Hum Mol Genet. 21 (7), 1625-1638 (2012).
- Touznik, A., Maruyama, R., Hosoki, K., Echigoya, Y., Yokota, T. LNA/DNA mixmer-based antisense oligonucleotides correct alternative splicing of the SMN2 gene and restore SMN protein expression in type 1 SMA fibroblasts. Sci Rep. 7 (1), 3672 (2017).
- Obika, S., et al. Synthesis of 2'-O,4'-C-methyleneuridine and -cytidine. Novel bicyclic nucleosides having a fixed C-3,-endo sugar puckering. Tetrahedron Letters. 38 (50), 8735-8738 (1997).
- Singh, S. K., Nielsen, P., Koshkin, A. A., Wengel, J. LNA (locked nucleic acids): synthesis and high-affinity nucleic acid recognition. Chemical Communications. (4), 455-456 (1998).
- Navarro, E., Serrano-Heras, G., Castano, M. J., Solera, J. Real-time PCR detection chemistry. Clin Chim Acta. 439, 231-250 (2015).
- Urbanek, M. O., Nawrocka, A. U., Krzyzosiak, W. J. Small RNA Detection by in Situ Hybridization Methods. Int J Mol Sci. 16 (6), 13259-13286 (2015).
- Wahlestedt, C., et al. Potent and nontoxic antisense oligonucleotides containing locked nucleic acids. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (10), 5633-5638 (2000).
- Rupaimoole, R., Slack, F. J. MicroRNA therapeutics: towards a new era for the management of cancer and other diseases. Nat Rev Drug Discov. 16 (3), 203-222 (2017).
- Lanford, R. E., et al. Therapeutic silencing of microRNA-122 in primates with chronic hepatitis C virus infection. Science. 327 (5962), 198-201 (2010).
- Shimo, T., Maruyama, R., Yokota, T. Designing Effective Antisense Oligonucleotides for Exon Skipping. Methods Mol Biol. 1687, 143-155 (2018).
- Shimo, T., et al. Design and evaluation of locked nucleic acid-based splice-switching oligonucleotides in vitro. Nucleic Acids Res. 42 (12), 8174-8187 (2014).
- Nguyen, Q., Yokota, T. Immortalized Muscle Cell Model to Test the Exon Skipping Efficacy for Duchenne Muscular Dystrophy. J. Pers. Med. 7 (4), 13 (2017).
- Echigoya, Y., et al. Quantitative Antisense Screening and Optimization for Exon 51 Skipping in Duchenne Muscular Dystrophy. Mol Ther. , (2017).
- Saito, T., et al. Antisense PMO found in dystrophic dog model was effective in cells from exon 7-deleted DMD patient. PLoS One. 5 (8), 12239 (2010).
- Donnelly, E. M., et al. Characterization of a murine model of SMA. Neurobiol Dis. 45 (3), 992-998 (2012).
- Lim, K. R., Maruyama, R., Yokota, T. Eteplirsen in the treatment of Duchenne muscular dystrophy. Drug Des Devel Ther. 11, 533-545 (2017).
- Paton, D. M. Nusinersen: antisense oligonucleotide to increase SMN protein production in spinal muscular atrophy. Drugs Today (Barc). 53 (6), 327-337 (2017).
- Prakash, T. P., et al. Comparing in vitro and in vivo activity of 2'-O-[2-(methylamino)-2-oxoethyl]- and 2'-O-methoxyethyl-modified antisense oligonucleotides. J Med Chem. 51 (9), 2766-2776 (2008).
- Aoki, Y., et al. Bodywide skipping of exons 45-55 in dystrophic mdx52 mice by systemic antisense delivery. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (34), 13763-13768 (2012).
