Summary
Ulike antisense oligonucleotides (AONs) har vist seg å indusere ekson inkludering (skjøte modulation) og redde SMN uttrykk for spinal muskel atrofi (SMA). Her beskriver vi en protokoll for AON lipotransfection å indusere ekson inkludering i SMN2 genet og metodene evaluering å bestemme effekt i SMA pasienter fibroblaster.
Abstract
Spinal muskel atrofi (SMA), en dødelig nevrologisk sykdom forårsaket av tap av SMN1, presenterer et spesielt tilfelle i feltet antisense oligonucleotide (AON)-mediert terapi. Mens SMN1 mutasjoner er ansvarlig for sykdommen, inkludert FDA-godkjente nusinersen, AONs målretting intronic skjøte lyddemper (ISS) områder i SMN2, har blitt vist å gjenopprette SMN uttrykk og forbedre symptomer. Foreløpig mange studier som involverer AON terapi for SMA fokus på gransker romanen AON kjemikalier målretting SMN2 som kan være mer effektive og mindre giftige enn nusinersen. Her beskriver vi en protokoll for i vitro evaluering av ekson inkludering med lipotransfection av AONs etterfulgt av polymerasekjedereaksjons for omvendt transkripsjon (RT-PCR), kvantitativ polymerasekjedereaksjons (qPCR) og vestlige blotting. Denne metoden kan brukes for ulike typer AON kjemikalier. På denne måten, viser vi at AONs består av vekslende låst nucleic syrer (LNAs) og DNA nukleotider (LNA/DNA mixmers) føre til effektiv SMN2 ekson inkludering og restaurering av SMN protein veldig lav konsentrasjon, og derfor LNA / DNA mixmer-baserte antisense oligonucleotides kan være en attraktiv terapeutiske strategi å behandle skjøting feilene forårsaket av genetiske sykdommer. I vitro evaluering metoden beskrevet her er rask, enkel og følsom nok for testing av ulike roman AONs.
Introduction
Spinal muskel atrofi (SMA) er en dødelig nevromuskulær lidelse arvet en autosomal recessiv mønster. Det er preget av nedbrytning av motor neurons og progressiv bagasjerommet og lem muskler lammelser1,2. Fleste SMA forekomster er på grunn av en homozygous mutasjon i overlevelse av motor neuron 1 (SMN1) gen3. Overlevelse av motor neuron 2 (SMN2) genet er en omvendt kopi av SMN1, og har en nesten identisk sekvens ulike av bare fem baser4,5. En C-til-T overgang i SMN2 i ekson 7 gjør genet nesten ikke-fungerende fordi mutasjon fører til den viktige ekson 7 blir utelatt i nesten 90% av SMN2 transkripsjoner (figur 1en). SMN2 mRNAs mangler ekson 7 kan ikke kompensere for funksjonen SMN1 fordi protein produktet er ustabil, og er raskt forringes.
Antisense terapi nylig dukket opp som en meget lovende strategi for behandling av SMA6. Den siste godkjenningen av nusinersen av US Food and Drug Administration (FDA) gjort det første stoffet tilgjengelig for behandling av SMA7. Nusinersen er en 18-mer antisense oligonucleotide (AON) med en 2 '-O-methoxyethyl endring (MOE) og et phosphorothioate miljø. Stoffet mål intronic skjøting lyddemper N1 (ISS-N1) ligger i intron 7 av SMN2 genet. Binding av nusinersen til ISS-N1 fremmer utvinning av funksjonelle full lengde SMN protein uttrykk fra endogene SMN2 genet av inducing ekson 7 inkludering (figur 1en)8,9,10 . Foreløpig mange studier som involverer AON terapi for SMA fokus på gransker romanen AON kjemikalier som kan være mer effektive og mindre giftige enn nusinersen. Det har vist at AONs med andre kjemikalier også effektivt induserer ekson inkludering i SMN2 ekson 7 både i vitro og vivo11,12,13.
Låst nucleic syrer (LNAs) er kjemisk endret RNA analogs som inneholder en methylene bro koble 4 -karbon med 2 ' -oksygen innen furanose struktur (figur 1b)14,15. Sammenlignet med DNAs eller RNAs, LNAs har en økt affinitet for binding til utfyllende RNA sekvenser og har den ekstra fordelen av å være svært motstandsdyktig mot endogene nucleases. LNA kjemi er brukt for bruk som sonder fluorescens i situ hybridisering (fisk) og i qPCR16,17. Også det er benyttet for å regulere genuttrykk både i vitro og i vivo. GapmeR AONs er en kombinasjon av enkelt-strandet DNA molekyler flankert av flere LNAs i 5 ' og 3 ' endene. De slå ned genuttrykk ved binding utfyllende til målrettet mRNAs, forårsaker dem til å bli brutt ned av aktivert RNase H18. LNA/DNA mixmers er AONs som består av DNA nukleotider integrert mellom LNAs. Presentert i denne retningen kan de binde miRNA å hemme sin funksjon (LNA-antimiR)19. Noen LNA-antimiRs har nådd klinisk utvikling. For eksempler, miravirsen (AntimiR-122) er en LNA-antimiR som hemmer miR-122 å behandle hepatitt c og flere fase II kliniske forsøk er pågående19,20. Nylig har det vært vist at LNA/DNA mixmers kan også modulerer RNA skjøting21. Binde en bestemt sekvens av mRNA kan og indusere ekson hoppe i dystrophin mRNA og ekson inkludering i SMN2 mRNA i vitro13,22.
I denne artikkelen skissere vi en metodikk for induksjon av ekson inkludering bruker AONs og evaluering av effekten på RNA og protein. Du eksemplifiserer denne metoden, brukte vi LNA/DNA mixmers målretting ISS-N1 i intron 7 av SMN2. AONs transfekterte i SMA pasienter celler av lipotransfection indusert ekson 7 inkludering i siste SMN2 transkripsjon og oppregulering av SMN protein produksjon. En av fordelene med å bruke LNA/DNA mixmers for å indusere ekson inkludering er at effektiv konsentrasjonen for hva er betydelig lavere enn andre kjemikalier13. Denne metoden kan brukes til mange andre AONs bortsett fra phosphorodiamidate morpholino oligomers (PMOs), som, på grunn av sin nøytrale kostnad, må du angi celler gjennom endocytose indusert av Endo-Porter co transfection reagensen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. celle kultur
- Pasienten kultur SMA fibroblaster i vekst medium (Dulbeccos endret Eagle middels 1: 1 F-12 (Ham) med 10% fosterets bovin serum (FBS) og 0,5% penicillin/streptomycin) i en CO2 inkubator på 37 ° C.
- Bestemme cellen konsentrasjon bruke en automatisert celle teller og fortynne celler til 1 x 105 celler/mL i vekstmediet, så frø på riktig plate. Bruke 12-vel plater (1 mL per brønn) RT PCR eller qPCR.
- Inkuber platene 24 h i en CO2 inkubator på 37 ° C.
2. LNA/DNA mixmer transfection
- Sikre celle confluency på rundt 65-80% for optimal transfection effektivitet.
- Tine 10 μM LNA/DNA mixmers sakte på is.
- I en 1.5-mL tube, Forbered en 20 x mixmer løsning ved å legge til mixmers til serum-belastede media slik at det siste bindet når 50 μL.
- Bland mixmer løsningen med 50 μL av serum-belastede mediet som inneholder 3% transfection reagens (1:1 ratio).
- Inkuber minutter ved romtemperatur.
- Legge til 900 μL serum-belastede middels med 5% FBS til hver tube.
- Sug opp den gamle mediet fra platen og erstatte med 1 mL LNA/DNA mixmer løsning som inneholder transfection reagensen.
- Inkuber celler for 24-48 h på 37 ° C i en CO2 inkubator.
3. RNA utvinning
- Fjerne mediet og legger 1 mL av guanidinium thiocyanate-fenol-kloroform reagens til cellene. Vask nederst også flere ganger med guanidinium thiocyanate-fenol-kloroform og samle den i 1,5-mL rør.
- Vortex i høy hastighet for 30 s og butikk på-80 ° C i 1 time eller over natten.
- Tine prøvene i romtemperatur og vortex godt.
- Legge til 200 µL kloroform, rist kraftig 15 s, og Inkuber ved romtemperatur for 3 min.
- Sentrifuger 12.000 x g i 15 min på 4 ° C.
- Samle de fjerner vandige fasen i en ny tube. Sørg for å unngå å samle noen av de hvite interphase som danner mellom øvre og nedre fasene.
- Legge til 500 µL isopropanol og 1 µL 8 µg/µL glykogen (RNA grad). Vortex for 10 s og Inkuber ved romtemperatur for 10 min eller på 20 ° C over natten.
- Sentrifuge 12.000 x g i 10 min på 4 ° C og fjerne alle nedbryting. Hvit pellets vil danne nederst på røret.
- Legge 1 mL kaldt 75% etanol og sentrifuger 7500 x g i 5 min på 4 ° C.
- Fjerne alle etanol og tørr pellet ved romtemperatur før ingen etanol er igjen i røret.
- Oppløse pellet i 30 µL DNase/RNase gratis vann og ruge i 10 min på 60 ° C.
- Måle RNA konsentrasjon bruker et spektrofotometer (på 260 nm), og justere RNA konsentrasjonen til 50 ng/µL.
4. et skritt RT PCR måle ekson inkludering frekvensen av SMN2
- Mix 12,5 µL av 2 x RT PCR reaksjon buffer, 1.0 µL av ettrinns RT PCR enzym blande, 0,5 µL av hver primer (SMN2 frem: 5'-CTGCCTCCATTTCCTTCTG-3', SMN2 omvendt: 5'-TGGTGTCATTTAGTGCTGCTC-3', GAPDH frem: 5-TCCCTGAGCTGAACGGGAAG-3', GAPDH omvendt: 5'-GGAGGAGTTTGGTCGCTGT-3', 2 µL av totalt (50 ng/µL), og 8,5 µL av RNase DNase-fri destillert vann.
- Når cDNA er syntetisert ved 50 ° C i 15 minutter, start PCR reaksjonen. Forsterke SMN2 ekson 6-8 med 30 PCR sykluser (94 ° C i 15 s, 60 ° C for 30 s, 68 ° C for 25 s). Forsterke GAPDH med 20 PCR sykluser (94 ° C i 15 s, 60 ° C for 30 s, 68 ° C for 20 s).
- Tilsett 5 μL 6 x lasting fargestoff PCR-produktet, og laste 5 µL av blandingen i en 2% agarose gel og kjøre i 40 min 100 V.
- Image gel og analysere den ved å bruke ImageJ.
- Måle intensiteten av full lengde band og Δ7 band. Beregne antall ekson 7 inkludering av intensitetsverdien av (full lengde) / (full lengde + Δ7 SMN2).
5. kvantitativ PCR (qPCR) å måle ekson inkludering frekvensen av SMN2
- For cDNA syntese, bland 1 µL Oligo dT, 1 µL 10 mM dNTPs og 11 µL totalt RNA (50 ng/µL). Inkuber ved 65 ° C i 5 minutter.
- Sett prøvene på is og legge 4 µL 5 x buffer, 1 µL 0.1 M DTT, 1 µL RNase hemmer og 1 µL revers transkriptase til hvert utvalg.
- Inkuber ved 50 ° C for 60 min, og varme opp til 80 ° C i 10 min å stoppe reaksjonen. CDNA kan lagres på 20 ° C.
- Fortynn cDNAs med RNase-fritt vann (1:5 fortynning). Bland 10 µL 2 x SYBR grønn qPCR enzym mix, 0,8 µL 10 µM primer (full lengde SMN2 frem: 5 '-GCTATCATACTGGCTATTATATGGGTTTT-3, full-lengde SMN2 omvendt: 5 '-CTCTATGCCAGCATTTCTCCTTAAT-3, Δ7 SMN2 frem: 5 ' - TCTGGACCACCAATAATTCCCC-3′, Δ7 SMN2 omvendt: 5 '-ATGCCAGCATTTCCATATAATAGCC-3, GAPDH frem: 5 '-GCAAATTCCATGGCACCGT-3, GAPDH omvendt: 5 '-AGGGATCTCGCTCCTGGAA-3), 3 µL fortynnet cDNA og 5.4 µL RNase-fritt vann.
- Starte qPCR reaksjonen. Bruk betingelsene: 95 ° C for 30 s, da en 40 syklus gjenta 95 ° C for 5 s og 60 ° C for 20 s.
- Beregne relative uttrykk for full lengde SMN2 til GAPDH eller Δ7 SMN2, og normalisere til ikke-behandlet cellene med ΔΔCt algoritmen.
6. vestlige blotting
- Fjerne transfection medium fra celler og vask med fosfat-bufret saltvann (PBS) en gang.
- Legg 100 µL lyseringsbuffer med en protease inhibitor.
- Koble celler fra bunnen av hver brønn bruker sterilt celle skraper, og samle inn i 1,5-mL rør. Inkuber prøvene på is 30 min.
- Passere cellen lysate 21-G nål 10 ganger for å knuse cellene.
- Sentrifuge 20,800 x g i 15 min på 4 ° C og samle nedbryting i nye 1.5-mL rør. Utvalget kan lagres i en-80 ° C fryser.
- Bestemme protein konsentrasjon bruke en BCA Protein analysen Kit, og justere til konsentrasjonen til 1,0 µg/µL.
- Mix 5 µL prøver og 5 µL 2 x natrium dodecyl sulfate (SDS) eksempel buffer (10% SDS; 14% 0,5 M Tris-HCl løsning, pH 6,7; 1% 0,5 M EDTA-2Na lagerløsning, pH 8.0, 20% glyserol, 0.004% bromophenol blå farge, 5% β-mercaptoethanol) og varme ved 70 ° C i 10 min.
- Laste inn prøvene i en 4-12% Bis-Tris Protein gels og kjøre 1t på 150 V.
- Suge en tykk filter papir i hver buffer: (konsentrert anode buffer: 0,3 M Tris-HCl, 20% metanol, anode buffer: 0,03 M Tris-HCl, 20% metanol; katoden buffer: 25 mM Tris, 20% metanol, 40 mM 6-amino-n-hexanoic acid, 0,01% SDS).
- Nyt en polyvinylidene difluoride (PVDF) membran i metanol for 20 s, deretter overføre den til anode bufferen.
- Equilibrate gel etter SDS-side med katoden bufferen for 5-10 minutter under omrøring.
- Plasser filteret avisene, PVDF membraner og gel på en semi-tørr blotting maskin, som følger: konsentrert anode buffer papir/anode buffer papir/PVDF membran/protein gel/katoden buffer papir (figur 2).
- Dekker stakken og starte overføringen på 20 V i 30 min.
- Etter overføringen, skyll PVDF membranen med PBST (PBS 0,05% mellom 20) når.
- Blokkere membranen ved romtemperatur for 30 min i 5% skummet melkepulver oppløst i PBST eller 4 ° C for overnatting.
- Fortynne en renset musen anti-SMN antistoff og en kanin anti-Cofilin mot 1:10,000 i 5% skummet melkepulver i PBST. Inkuber membranen i det 1t ved romtemperatur eller 4 ° C over natten.
- Vask 3 ganger med PBST i 10 min.
- Fortynne sekundære antistoffer (HRP-konjugerte geit anti-musen og anti-kanin IgG (H + L)) mot 1:10,000 i 5% skummet melkepulver i PBST. Inkuber 1t ved romtemperatur i mørket.
- Vask membranen 3 ganger med PBST i 10 min.
- Gjenkjenne bandet bruker chemiluminescence vestlige blotting oppdagelsen utstyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bruker SMA pasienten fibroblaster, målrettet vi ISS-N1 lyddemper regionen i intron 7 av SMN2 genet med åtte forskjellige antisense LNA/DNA mixmers som var transfekterte på en 5 nM konsentrasjon (Figur 3). Hver av mixmers inneholdt en modifisert phosphorothioated ryggrad som gjorde dem å motstå nuclease fornedrelse. For å evaluere effekten av mixmers, frekvensen av SMN2 ekson ble 7 inkludering kvantifisert RT PCR og qPCR bruker primere gjelder SMN2. Inkludering effektiviteten av ekson 7 varierte fra 78-98% når transfekterte med mixmers #1-5 i pasienten cellene (Figur 4a, b), mens transfection utnytte mixmers #6-8 på samme dose ikke resulterte i noen betydelig forskjell i forhold til kontrollen. Resultatene fikk fra qPCR analyse vises også som antallet av full lengde SMN2 mRNA transkripsjon var betydelig økte med mixmers #1-3 og #5 behandlinger sammenlignet med kontrollen (Figur 4c).
I tillegg resultatet av den vestlige blotting viste at transfection bruke mixmers #1-5 aktivert høyere nivåer av SMN protein uttrykk i pasienten fibroblaster (en 1.5 - 1.9-fold økning fra kontrollen, figur 5). Behandlinger bruker mixmers #6-8 resulterte ikke i en endring i hvilket SMN protein uttrykk i cellene. Disse dataene viser at transfection LNA/DNA mixmers #1-5 induserer SMN2 ekson 7 inkludering effektivt i SMA pasienter fibroblaster.
Figur 1 : Antisense-mediert ekson inkludering strategi for å behandle SMA. (a) en C-til-T overgang i ekson 7 av SMN2 fører til hopper av ekson 7 i ca 90% av SMN2 transkripsjoner. Disse transkripsjonene er ut-av-ramme, og er raskt degradert i cellene. Antisense oligonucleotides (AONs) binde intronic skjøting lyddemper N1 (ISS-N1), som induserer ekson inkludering i SMN2. Ekson 7-inkludert SMN2 mRNAs kan produsere funksjonelle SMN protein. (b) kjemiske strukturer av RNA og phosphorothioated LNA. De hele infrastruktur av mixmers vi brukte i denne artikkelen er phosphorothioated å hindre nedbrytning. Dette tallet har blitt endret fra Touznik et.al. 13. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Semi-tørr overføringsmetode for vestlige blotting. En tykk filter papir dynket i konsentrert (Con.) Anode buffer, en tykk filter papir dynket i Anode buffer, en PVDF membran, en gel og en tykk filter papir dynket i katoden bufferen er stablet mellom to plater en semi-tørr blotting maskin. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : LNA/DNA mixmer sekvensen for SMN2 ekson 7 inkludering. DNA base: G, A, T, C. LNA base (rød): + G + A, + T, + C. Phosphorothioated DNA base: G * A * T *, C *. Phosphorothioated LNA base (rød): + G *, A *, + T *, ++ C *. Dette tallet er gjengitt fra Touznik et.al. 13. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Representant resultatene av RT PCR og qPCR for å evaluere effekten av LNA/DNA mixmers. Hva med mixmers #1-5 fører til SMN2 ekson 7 inkludering på en betydelig høyere rente enn den uekte transfection. (en) RT PCR SMN2 og GAPDH i SMA pasienter fibroblaster etter transfection på 5 nM konsentrasjon. Topp band: ekson 7-inkludert full lengde SMN2 mRNA. Bunnen bandet: ekson 7-ekskludert SMN2 mRNA. (b) kvantitativ analyse av SMN2 ekson 7 inkludering i mixmer-behandlet SMA fibroblaster med RT PCR. (c) Relative uttrykk analyse av full lengde SMN2 til GAPDH målt ved hjelp av qPCR. Dataene var normalisert til ikke-behandlet kontroll celler. Feilfelt representerer gjennomsnittlig ± standardavvik (tre uavhengige eksperimenter). Enveis VARIANSANALYSE med Dunnetts flere sammenligning test ble utført. M: håne kontroll, NT: ikke-behandlet, H: sunn kontroll fibroblast celler, B: tomt. Dette tallet er gjengitt fra Touznik et.al. 13. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Representant resultatene av vestlige blotting for å måle SMN protein uttrykk. Hva av LNA/DNA-mixmers øker SMN protein produksjon. (a) vestlige blotting SMN og Cofilin (lasting kontroll) av sunn og mixmer-behandlet SMA pasienten fibroblaster. (b) fold økning i SMN protein nivåer av mixmer-behandlet SMA fibroblaster. Hva av mixmers #1-5 på 5 nM konsentrasjonen øker produksjonen av SMN protein. Dataene var normalisert til forholdet mellom SMN/Cofilin i ikke-behandlet SMA fibroblaster. Stolpene angir gjennomsnittlig ± standardavvik (fire uavhengige eksperimenter). Enveis VARIANSANALYSE med Dunnetts flere sammenligning test ble utført. M: håne kontroll, NT: ikke-behandlet. Dette tallet er gjengitt fra Touznik et.al. 13. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I vitro evaluering metoden beskrevet her er rask, enkel og følsom nok for testing av ulike AONs. Denne protokollen er allment gjeldende ekson hoppe og inkludering av andre gener og ulike celletyper. Dessuten, kan de fleste AON kjemikalier (unntatt PMOs) være transfected med denne metoden. AONs kan regulere skjøting av pre-mRNA fra både endogene og kunstig introdusert gener, og kan være co transfekterte med plasmider vektorer bærer målrettet gener.
En kritisk trinn i denne metoden er at cellen confluency bør være rundt 65-80% når AONs er transfekterte i fibroblaster. Denne tilstanden kan være forskjellig for andre celletyper. Konsentrasjonen av AONs for hva kan være også forskjellige (0,5 - 100 nM), avhengig av målrettet sekvenser og celletyper.
Denne metoden er ikke uten potensielle fallgruver. For eksempel bestemmes effekten av mixmers av sekvenser av mixmers og LNA/DNA komposisjon. ISS-N1 var en mixmer, som består av LNAs med DNA blir erstattet med LNA på hver tredje nukleotid posisjon, mer effektiv enn en mixmer med en tilsvarende sekvens med DNA substitusjon på hver andre nukleotid eller alle-LNA oligonucleotide13 . Dette kan imidlertid være forskjellige for andre målet sekvenser. Derfor er det nødvendig å optimalisere sekvenser av LNA/DNA mixmers og evaluere effekten av mixmers på RNA nivå før du går videre. De hele infrastruktur av mixmers bør være phosphorothioated å hindre nedbrytning. i tillegg, selv om denne lipotransfection-mediert transfection metoden kan brukes til de fleste AON kjemikalier, det kan ikke brukes for kostnad-nøytral phosphorodiamidate morpholino oligomers (PMOs), siden lipotransfection krever negativt ladet oligonucleotides. PMO transfection metoder, se andre steder23,24,25.
Selv om denne metoden er nyttig for testing av Roman AONs, ikke SMA fibroblast celle modell er recapitulate i vivo forhold i sin helhet. Dyremodeller kan tjene som en viktig å teste i vivo effekt og sikkerhet26.
For ekson hoppe/inkludering, kan PMO og 2 '-O-methoxyethyl modifikasjon (2' MOE) brukes i stedet for LNA/DNA mixmers27,28. Optimal konsentrasjon av disse kjemikalier for hva er imidlertid vanligvis mye høyere29,30. På grunn av bedre effekt i forhold til andre antisense kjemikalier, kan bruk av LNA/DNA mixmer-baserte antisense oligonucleotides være en attraktiv terapeutiske strategi å behandle skjøting feilene forårsaket av genetiske sykdommer i fremtiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takke Nicole McRorie for hjelp med eksperimenter. Dette arbeidet ble støttet av University of Alberta fakultetet medisin og odontologi, Slipchuk SMA Research Foundation forskningsstipend, den kanadiske institutter for helse forskning (CIHR), den venner av Garrett Cumming forskningsmidler, HM Toupin nevrologisk Science forskningsmidler, muskeldystrofi Canada, Canada grunnlaget for innovasjon, Alberta Enterprise og avanserte utdanning, og kvinner og barns helse Research Institute (WCHRI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SMA Fibroblasts | Coriell NIGMS human genetic cell repository | GM03813 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher | 11320033 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F1051 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher | 25300062 | |
| Serum-deprived media | Thermo Fisher | 31985070 | |
| Transfection reagent | Thermo Fisher | 15338100 | |
| guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform (TRIzol) | Thermo Fisher | 15596-018 | |
| RT-PCR Primers | Sequence 5' to 3' | ||
| SMN2 forward: | CTGCCTCCATTTCCTTCTG | ||
| SMN2 reverse: | TGGTGTCATTTAGTGCTGCTC | ||
| GAPDH forward: | TCCCTGAGCTGAACGGGAAG | ||
| GAPDH reverse: | GGAGGAGTTTGGTCGCTGT | ||
| qPCR Primers | |||
| full-length SMN2 forward: | GCTATCATACTGGCTATTATATGGGTTTT | ||
| full-length SMN2 reverse: | CTCTATGCCAGCATTTCTCCTTAAT | ||
| GAPDH forward: | GCAAATTCCATGGCACCGT | ||
| GAPDH reverse: | AGGGATCTCGCTCCTGGAA | ||
| Chloroform | Sigma-Aldrich | P3803 | |
| Glycogen, RNA grade | Thermo Fisher | R0551 | |
| ImageJ Software | |||
| Protease cocktail inhibitor | Roche | 11836153001 | |
| Cathode Buffer | 0.025 M Tris base + 40 mM 6-aminocaproic acid + 20% Methanol | ||
| Anode Buffer | 0.03 M Tris Base + 20% Methanol | ||
| Concentred Anode Buffer | 0.3 M Tris base + 20% Methanol | ||
| Beta Mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | |
| PVDF membrane | GE | 10600021 | |
| Loading/sample buffer for Western blotting | NuPage Invitrogen | NP007 | |
| One-Step RT-PCR kit | Qiagen | 210210 | |
| dNTPs | Clontech | 3040 |
References
- Iascone, D. M., Henderson, C. E., Lee, J. C. Spinal muscular atrophy: from tissue specificity to therapeutic strategies. F1000Prime Rep. 7, 4 (2015).
- Touznik, A., Lee, J. J., Yokota, T. New developments in exon skipping and splice modulation therapies for neuromuscular diseases. Expert Opin Biol Ther. 14 (6), 809-819 (2014).
- Lefebvre, S., et al. Identification and Characterization of a Spinal Muscular Atrophy-Determining Gene. Cell. 80 (1), 155-165 (1995).
- Lorson, C. L., Hahnen, E., Androphy, E. J., Wirth, B. A single nucleotide in the SMN gene regulates splicing and is responsible for spinal muscular atrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (11), 6307-6311 (1999).
- Monani, U. R., et al. A single nucleotide difference that alters splicing patterns distinguishes the SMA gene SMN1 from the copy gene SMN2. Hum Mol Genet. 8 (7), 1177-1183 (1999).
- Lee, J. J., Yokota, T. Antisense therapy in neurology. J Pers Med. 3 (3), 144-176 (2013).
- Aartsma-Rus, A. FDA Approval of Nusinersen for Spinal Muscular Atrophy Makes 2016 the Year of Splice Modulating Oligonucleotides. Nucleic Acid Ther. 27 (2), 67-69 (2017).
- Hua, Y., et al. Peripheral SMN restoration is essential for long-term rescue of a severe spinal muscular atrophy mouse model. Nature. 478 (7367), 123-126 (2011).
- Hua, Y., Vickers, T. A., Baker, B. F., Bennett, C. F., Krainer, A. R. Enhancement of SMN2 exon 7 inclusion by antisense oligonucleotides targeting the exon. PLoS Biol. 5 (4), 73 (2007).
- Passini, M. A., et al. Antisense oligonucleotides delivered to the mouse CNS ameliorate symptoms of severe spinal muscular atrophy. Sci Transl Med. 3 (72), (2011).
- Hammond, S. M., et al. Systemic peptide-mediated oligonucleotide therapy improves long-term survival in spinal muscular atrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (39), 10962-10967 (2016).
- Porensky, P. N., et al. A single administration of morpholino antisense oligomer rescues spinal muscular atrophy in mouse. Hum Mol Genet. 21 (7), 1625-1638 (2012).
- Touznik, A., Maruyama, R., Hosoki, K., Echigoya, Y., Yokota, T. LNA/DNA mixmer-based antisense oligonucleotides correct alternative splicing of the SMN2 gene and restore SMN protein expression in type 1 SMA fibroblasts. Sci Rep. 7 (1), 3672 (2017).
- Obika, S., et al. Synthesis of 2'-O,4'-C-methyleneuridine and -cytidine. Novel bicyclic nucleosides having a fixed C-3,-endo sugar puckering. Tetrahedron Letters. 38 (50), 8735-8738 (1997).
- Singh, S. K., Nielsen, P., Koshkin, A. A., Wengel, J. LNA (locked nucleic acids): synthesis and high-affinity nucleic acid recognition. Chemical Communications. (4), 455-456 (1998).
- Navarro, E., Serrano-Heras, G., Castano, M. J., Solera, J. Real-time PCR detection chemistry. Clin Chim Acta. 439, 231-250 (2015).
- Urbanek, M. O., Nawrocka, A. U., Krzyzosiak, W. J. Small RNA Detection by in Situ Hybridization Methods. Int J Mol Sci. 16 (6), 13259-13286 (2015).
- Wahlestedt, C., et al. Potent and nontoxic antisense oligonucleotides containing locked nucleic acids. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (10), 5633-5638 (2000).
- Rupaimoole, R., Slack, F. J. MicroRNA therapeutics: towards a new era for the management of cancer and other diseases. Nat Rev Drug Discov. 16 (3), 203-222 (2017).
- Lanford, R. E., et al. Therapeutic silencing of microRNA-122 in primates with chronic hepatitis C virus infection. Science. 327 (5962), 198-201 (2010).
- Shimo, T., Maruyama, R., Yokota, T. Designing Effective Antisense Oligonucleotides for Exon Skipping. Methods Mol Biol. 1687, 143-155 (2018).
- Shimo, T., et al. Design and evaluation of locked nucleic acid-based splice-switching oligonucleotides in vitro. Nucleic Acids Res. 42 (12), 8174-8187 (2014).
- Nguyen, Q., Yokota, T. Immortalized Muscle Cell Model to Test the Exon Skipping Efficacy for Duchenne Muscular Dystrophy. J. Pers. Med. 7 (4), 13 (2017).
- Echigoya, Y., et al. Quantitative Antisense Screening and Optimization for Exon 51 Skipping in Duchenne Muscular Dystrophy. Mol Ther. , (2017).
- Saito, T., et al. Antisense PMO found in dystrophic dog model was effective in cells from exon 7-deleted DMD patient. PLoS One. 5 (8), 12239 (2010).
- Donnelly, E. M., et al. Characterization of a murine model of SMA. Neurobiol Dis. 45 (3), 992-998 (2012).
- Lim, K. R., Maruyama, R., Yokota, T. Eteplirsen in the treatment of Duchenne muscular dystrophy. Drug Des Devel Ther. 11, 533-545 (2017).
- Paton, D. M. Nusinersen: antisense oligonucleotide to increase SMN protein production in spinal muscular atrophy. Drugs Today (Barc). 53 (6), 327-337 (2017).
- Prakash, T. P., et al. Comparing in vitro and in vivo activity of 2'-O-[2-(methylamino)-2-oxoethyl]- and 2'-O-methoxyethyl-modified antisense oligonucleotides. J Med Chem. 51 (9), 2766-2776 (2008).
- Aoki, Y., et al. Bodywide skipping of exons 45-55 in dystrophic mdx52 mice by systemic antisense delivery. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (34), 13763-13768 (2012).
