Summary
各种反义寡核苷酸 (AONs) 被证明可以诱导外显子夹杂 (剪接调制) 和抢救 SMN 表达的脊髓肌萎缩 (SMA)。在这里, 我们描述了一个协议, 以 lipotransfection 诱导外显子包含在SMN2基因和评价方法, 以确定的有效性, SMA 患者成纤维细胞。
Abstract
脊髓肌萎缩 (SMA), 一个致命的神经系统疾病造成的损失的SMN1, 提出了一个独特的情况下, 反义寡核苷酸 (怡) 介导治疗领域。虽然SMN1突变负责该疾病, 但已显示在SMN2(包括 FDA 批准的 nusinersen) 中的 AONs 目标内含子拼接消声器 (ISS) 站点已被证明可以恢复 SMN 表达式并改善症状。目前, 对 SMA 治疗的许多研究都侧重于调查以SMN2为目标的新型怡得化学药物, 其效果可能比 nusinersen 更有效、毒性更小。在这里, 我们描述了一个体外的协议, 利用 AONs 的 lipotransfection 进行反向转录聚合酶链反应 (rt-pcr)、定量聚合酶链反应 (qPCR) 和西方印迹的研究, 对显子夹杂物进行评价。这种方法可用于各种类型的安怡化学。使用这种方法, 我们证明由交替锁定核酸 (LNAs) 和 dna 核苷酸 (低噪声/dna mixmers) 组成的 AONs, 导致有效的SMN2外显子包含和恢复 SMN 蛋白在极低浓度, 因此, 放大器/基于 DNA mixmer 的反义寡核苷酸可能是治疗遗传疾病引起的剪接缺损的一种很有吸引力的治疗策略。这里描述的体外评估方法是快速、容易和敏感的, 足以测试各种新颖的 AONs。
Introduction
脊髓肌萎缩 (SMA) 是一种遗传的致命神经肌肉疾病遗传性的常染色体隐性模式。它的特点是运动神经元的退化和渐进躯干和肢体肌肉麻痹1,2。大多数 SMA 的发生是由于在存活的马达神经元 1 (SMN1) 基因3的纯合突变。运动神经元 2 (SMN2) 基因的存活是SMN1的反向复制, 其几乎相同的序列与仅五个基4、5不同。位于外显子7中的SMN2中的 C 到 T 转换使该基因几乎无法正常进行, 因为该突变导致了在几乎90% 的SMN2记录 (图 1a) 中排除的必需的外显子7。SMN2基因缺少的外显子7无法补偿SMN1函数, 因为其蛋白质产品不稳定且快速降解。
反义疗法最近成为治疗 SMA6的非常有前途的策略。美国食品和药物管理局 (FDA) 最近批准了 nusinersen, 使它成为治疗 SMA7的第一种药物。Nusinersen 是一个18的反义寡核苷酸 (怡人) 与-2′-乙修改 (教育部) 和硫代核苷酸骨干。该药物的目标是内含子剪接消声器 N1 (ISS-N1) 位于 SMN2 基因的内含子 7. nusinersen 对 ISS-N1 的约束力通过诱导外显子7包含 (图 1)8,9,10, 促进从内源SMN2基因中恢复功能性全长 SMN 蛋白表达..目前, 对 SMA 治疗的许多研究都集中在研究新的可比 nusinersen 更有效和更少毒性的新型怡得化学药物。已经证明, 与其他化学成分的 AONs 也有效地诱导外显子包含在SMN2显子7两个在体内外和在体内11,12,13。
锁定核酸 (LNAs) 是化学修饰的 RNA 类似物, 包含一个亚甲桥连接 4′--碳与 furanose 结构内的-2′--氧(图 1b)14,15。与 dna 或 rna 相比, LNAs 具有更强的亲和力, 可以结合到互补 RNA 序列中, 并且对内源性核酸具有高度抵抗力。低噪声放大化学已被应用作为探针荧光原位杂交 (鱼) 和在 qPCR16,17。此外, 它被用来调节基因表达的在体外和在体内。GapmeR AONs 是单链 DNA 分子在5′和3′端两侧由几个 LNAs 的组合。它们通过对目标基因进行绑定互补来降低基因表达, 从而使它们被激活的 RNase H18所降解。低噪声 AONs/dna mixmers 是由 LNAs 之间集成的 dna 核苷酸组成的。在这个方向上, 它们可以绑定 miRNA 以抑制其功能 (低噪声 antimiR)19。一些低噪声 antimiRs 已达到临床发展。举例来说, miravirsen (AntimiR-122) 是一个低噪声的 AntimiR, 抑制 miR-122 治疗丙型肝炎感染, 而第二阶段临床试验目前正在进行19,20。最近, 已经证明, 低噪声/DNA mixmers 也可以调制 RNA 拼接21。它可以绑定一个特定序列的 mrna 和诱导外显子跳过肌萎缩蛋白 mrna 和显子包含在SMN2 mRNA在体内13,22.
在本文中, 我们概述了一种方法, 以诱导外显子夹杂使用 AONs 和评价的功效在 RNA 和蛋白质水平。为了举例说明这种方法, 我们在SMN2的内含子7中使用了低噪声/DNA mixmers 靶向 ISS-N1。AONs 转染 SMA 患者细胞的 lipotransfection 诱导外显子7包含在最后的SMN2转录和上调 SMN 蛋白生产。利用低噪声/DNA mixmers 诱导外显子夹杂的优点之一是, 转染的有效浓度明显低于其他化学试剂13。该方法除 phosphorodiamidate 吗啉代寡聚物 (PMOs) 外, 还可用于其他许多 AONs, 由于其中性电荷, 需要通过内-波特共转染试剂诱导的吞进入细胞。
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Protocol
1. 细胞培养
- 培养 SMA 患者成纤维细胞生长培养基 (Dulbecco 的改良鹰中等 1:1 F-12 (火腿) 与10% 胎牛血清 (血清) 和0.5% 青霉素/链霉素) 在 CO2孵化器在37°c。
- 使用自动细胞计数器和稀释细胞到生长培养基中的 1 x 105细胞/mL, 然后在适当的板块上播种, 确定细胞浓度。使用12井板 (每井1毫升) 用于 rt-pcr 或 qPCR。
- 在 CO2孵化器中, 在37摄氏度孵育24小时的板材。
2. 低噪声/DNA mixmer 转染
- 确保细胞融合约 65-80%, 以获得最佳转染效率。
- 在冰上慢慢解冻10微米的低噪声或 DNA mixmers。
- 在一个1.5 毫升的管, 准备一个 20x mixmer 解决方案通过添加 mixmers 到血清缺乏的媒体, 使最终体积达到 50 ul。
- 将 mixmer 溶液与含有3% 转染试剂 (1:1 比值) 的血清缺乏介质的 50 ul 混合在一起。
- 室温孵育10分钟。
- 添加 900 ul 血清缺乏培养基, 每管5% 只。
- 从盘子中吸取旧的介质, 并用1毫升的低噪声/DNA mixmer 溶液取代含有转染试剂。
- 在 CO2孵化器中孵化 24-48 小时37摄氏度的细胞。
3. RNA 提取
- 去除培养基并加入1毫升的硫氰酸胍-苯酚-氯仿试剂到细胞中。用胍硫氰酸盐-苯酚-氯仿多次冲洗井底, 并将其收集成1.5 毫升管。
- 漩涡在高速三十年代和存放在-80 °c 1 小时或隔夜。
- 在室温和涡旋井中解冻样品。
- 加200µL 氯仿, 用力摇动十五年代, 室温孵育3分钟。
- 离心机在 1.2万 x g 15 分钟在4摄氏度。
- 把最清澈的水相收集到新的管子里。确保避免收集在上下相之间形成的任何白色相间的界面。
- 添加500µL 异丙醇和1µL 8 µg/µL 糖原 (RNA 级)。漩涡十年代和在室温孵育10分钟或在-20 °c 过夜。
- 离心机在 1.2万 x g 10 分钟在4°c 和去除所有上清。在管子的底部会形成一个白色的小球。
- 添加1毫升冷75% 乙醇和离心机在 7500 x g 5 分钟在4°c。
- 除去所有的乙醇, 在室温下将颗粒干燥, 直到管子里没有乙醇。
- 在30µL DNase/RNase 游离水中溶解颗粒, 在60摄氏度时孵育10分钟。
- 使用分光光度计测量 rna 浓度 (260 nm), 并将 rna 浓度调整为50µL。
4. 一步 rt-pcr 测量SMN2的外显子夹杂率
- 混合12.5 µL 的 2x rt-pcr 反应缓冲器, 1.0 µL 的一步 rt-pcr 酶混合, 0.5 µL 每个底漆 (SMN2向前: 5 '-CTGCCTCCATTTCCTTCTG-3 ', SMN2反向: 5 '-TGGTGTCATTTAGTGCTGCTC-3 ', GAPDH向前:5 '-TCCCTGAGCTGAACGGGAAG-3 ', GAPDH反转: 5 '-GGAGGAGTTTGGTCGCTGT-3 ', 2 µL 总 RNA (50 ng/µL), 8.5 µL RNase/DNase 无蒸馏水。
- 在50°c 合成了15分钟的 cDNA 后, 开始 PCR 反应。放大SMN2外显子6-8 与 30 PCR 周期 (94 °c 为十五年代, 60 °c 为三十年代, 68 °c 为二十五年代)。放大 GAPDH 与 20 PCR 周期 (94 °c 为十五年代, 60 °c 为三十年代, 68 °c 为二十年代)。
- 将 5 ul 6x 负载染料添加到 PCR 产品中, 并将混合物的5µL 装入2% 琼脂糖凝胶中, 并在 100 v 上运行40分钟。
- 用 ImageJ 软件对凝胶进行图像分析。
- 测量全长带和Δ7带的强度。根据 (全长)/(全长 + Δ7 SMN2) 的强度值计算外显子7包含的速率。
5. 定量 PCR (qPCR) 测量SMN2的外显子夹杂率
- 对于 cDNA 合成, 混合1µL 寡核苷酸 dT, 1 µL 10 毫米 dNTPs, 11 µL 总 RNA (50 ng/µL)。孵育65°c 5 分钟。
- 将样品放在冰上, 并添加4µL 5x 缓冲器, 1 µL 0.1 米, 1 µL RNase 抑制剂, 1 µL 逆转录酶对每个样品。
- 孵育在50°c 60 分钟, 加热高达80°c 10 分钟, 以停止反应。该 cDNA 可以储存在-20 摄氏度。
- 用无 RNase 水稀释基因 (1:5 稀释)。混合10µL 2x SYBR 绿色 qPCR 酶混合, 0.8 µL 10 µM 每个底漆 (全长SMN2向前: 5′-GCTATCATACTGGCTATTATATGGGTTTT-3′, 全长SMN2反转: 5′-CTCTATGCCAGCATTTCTCCTTAAT-3′, Δ7 SMN2前进: 5′-TCTGGACCACCAATAATTCCCC-3, Δ7 SMN2反向: 5′ ATGCCAGCATTTCCATATAATAGCC 3′, GAPDH向前: 5′ GCAAATTCCATGGCACCGT-3′, GAPDH反转: 5′-AGGGATCTCGCTCCTGGAA 3′), 3 µL 稀释 cDNA, 5.4 µL 无 RNase 水。
- 开始 qPCR 反应。使用条件:95 °c 为三十年代, 然后40周期重复在95°c 为 5 s 和60°c 二十年代。
- 计算全长SMN2到GAPDH或Δ7 SMN2的相对表达式, 并使用ΔΔCt 算法正常化到未处理的单元格。
6. 西方印迹
- 从细胞中取出转染培养基, 再用磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 冲洗一次。
- 用蛋白酶抑制剂添加100µL 裂解缓冲液。
- 用无菌的细胞刮刀从每个井的底部分离出细胞, 并收集成1.5 毫升的管子。在冰上孵化样品30分钟。
- 通过21克针通过细胞裂解10次粉碎细胞。
- 离心机在 20800 x g 15 分钟在4°c 和收集上清入新的1.5 毫升管。样品可以储存在-80 摄氏度的深冰箱里。
- 使用可鉴定蛋白试剂盒测定蛋白质浓度, 并将浓度调整为1.0 µg/µL。
- 混合5µL 样品和5µL 2x 月桂酸钠 (sds) 样品缓冲器 (10% SDS; 14% 0.5M 三盐酸溶液, ph 6.7; 1% 0.5M EDTA-2Na 溶液, ph 8.0; 20% 甘油; 0.004% 溴酚蓝色染料, 5% β巯基乙醇) 和热在70°c 为10分钟。
- 将样品装入4-12% 双三蛋白凝胶中, 在 150 v 上运行1小时。
- 在每个缓冲器中浸泡一张厚的滤纸: (浓缩阳极缓冲器: 0.3 米三盐酸, 20% 甲醇; 阳极缓冲: 0.03 米三盐酸, 20% 甲醇; 阴极缓冲器:25 毫米三, 20% 甲醇, 40 毫米 6-氨基 n-己酸, 0.01% SDS)。
- 在二十年代将乙烯氟 (PVDF) 膜浸泡在甲醇中, 然后将其转移到阳极缓冲器中。
- 平衡的凝胶后, 在 SDS 页与阴极缓冲 5-10 分钟的鼓动下。
- 将滤纸、PVDF 膜和凝胶放在半干式印迹机上, 如下所示: 浓缩阳极缓冲纸/阳极缓冲纸/PVDF 膜/蛋白凝胶/阴极缓冲纸 (图 2)。
- 覆盖堆栈, 并开始传输在 20 V 30 分钟。
- 转移后, 用 PBST (PBS 0.05% 20) 冲洗 PVDF 膜一次。
- 在室温下阻断膜30分钟, 在5% 脱脂奶粉中溶解在 PBST 或在4°c 过夜。
- 稀释纯化的小鼠抗 SMN 抗体和兔抗 Cofilin 抗体1:10,000 在5% 脱脂奶粉 PBST。在室温下或在4摄氏度的一夜内孵化出1小时的膜。
- 用 PBST 洗3次, 10 分钟。
- 稀释二次抗体 (HRP 共轭山羊抗鼠和抗兔 IgG (H + L)) 到1:10,000 在5% 脱脂奶粉中 PBST。在室温下在黑暗中孵育1小时。
- 用 PBST 3 次冲洗膜10分钟。
- 使用化学发光的印迹检测试剂盒检测带信号。
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Representative Results
利用 SMA 患者成纤维细胞, 我们瞄准了SMN2基因内含子7中的 ISS-N1 消声器区域, 八种不同的反义放大器/DNA mixmers 被转染为 5 nM 浓度 (图 3)。每一个 mixmers 包含一个修改过的 phosphorothioated 骨干, 使他们能够抵御核酸酶退化。为了评估 mixmers 的有效性, 通过 rt-pcr 和 qPCR, 使用SMN2的引物, 量化了SMN2外显子7包含率。外显子7的包含效率从 78-98%, 当转染与 mixmers #1-5 在患者细胞 (图 4a, b), 而利用 mixmers #6-8 在同一剂量下, 没有造成任何显著差异, 当比较该控件。从 qPCR 分析得到的结果还显示, 与控制 (图 4c) 相比, mixmers #1 3 和 #5 处理的全长SMN2 mRNA 转录量显著增加。
此外, 西方印迹的结果表明, 使用 mixmers #1 5 的转染, 使患者成纤维细胞的 SMN 蛋白表达更高 (1.5-1.9 倍的增加从控制,图 5)。使用 mixmers #6 8 的治疗并没有导致细胞 SMN 蛋白表达水平的改变。这些数据表明, 转染低噪声/DNA mixmers #1-5 诱导SMN2外显子7包含有效的 SMA 患者成纤维细胞。
图 1: 反义介导的外显子包含策略治疗 SMA。(a)在SMN2外显子7中的 C 到 T 转换导致在大约90% 的SMN2记录中跳过外显子7。这些成绩单是帧外, 并迅速退化的细胞。反义寡核苷酸 (AONs) 结合内含子剪接消声器 N1 (ISS-N1), 它诱导外显子包含在 SMN2. 外显子 7-包括SMN2基因可以产生功能性 SMN 蛋白。(b) RNA 和 phosphorothioated 低噪声放大剂的化学结构。我们在本文中使用的 mixmers 的整个骨干 phosphorothioated 防止退化。此数字已从 Touznik et.al 中修改 .13.请单击此处查看此图的更大版本.
图 2: 用于西方印迹的半干转移法.浓滤纸浸泡在浓 (.) 阳极缓冲液中, 在阳极缓冲液中浸泡的厚滤纸、PVDF 膜、凝胶和浸泡在阴极缓冲器中的厚滤纸堆积在半干吸水机的两个板块之间。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: SMN2 外显子7包含的低噪声/DNA mixmer 序列.dna 基础: g, a, T, C. 低噪声源 (红色): + G, + A, + T, + c Phosphorothioated DNA 基部: G *, a *, t *, C *。Phosphorothioated 低噪声基 (红色): + G *, + *, + T *, + C *。此数字从 Touznik et.al 中复制.13.请单击此处查看此图的更大版本.
图 4: 有代表性的 rt-pcr 和 qPCR 的结果来评价低噪声/DNA mixmers 的疗效.转染 mixmers #1-5 导致SMN2外显子7包含在显着更高的速率比模拟转染。(a) 在 SMA 患者成纤维细胞中, 在 5 nM 浓度下转染后, SMN2和GAPDH的 RT PCR。顶带: 外显子 7-包括全长 SMN2 mRNA。底带: 外显子 7-排除 SMN2 mRNA。(b) 采用 rt-pcr 方法定量分析了 mixmer 治疗的 SMA 成纤维细胞中SMN2外显子7的含量。(c) 全长SMN2到GAPDH使用 qPCR 测量的相对表达式分析。这些数据被规范化为未处理的控制单元。误差条表示平均值 "标准偏差" (三独立实验)。对 Dunnett 的多项比较试验进行了单向方差分析。M: 模拟控制, NT: 不治疗, H: 健康控制成纤维细胞, B: 空白。此数字从 Touznik et.al 中复制.13.请单击此处查看此图的更大版本.
图 5: 具有代表性的结果的西方印迹测量 SMN 蛋白表达.转染低噪声/DNA mixmers 增加 SMN 蛋白的生产。(a) 健康和 mixmer 治疗的 SMA 患者成纤维细胞的 SMN 和 Cofilin (负载控制) 的西方印迹。(b) mixmer 治疗的 SMA 成纤维细胞的 SMN 蛋白水平增加。转染 mixmers #1-5 在 5 nM 浓度显著增加 SMN 蛋白的生产。对非治疗 SMA 成纤维细胞 SMN/Cofilin 的比值进行了规范化处理。酒吧代表平均标准偏差 (四独立实验)。对 Dunnett 的多项比较试验进行了单向方差分析。M: 模拟控制, NT: 不处理。此数字从 Touznik et.al 中复制.13.请单击此处查看此图的更大版本.
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Discussion
这里描述的体外评估方法是快速、容易和敏感的, 足以测试各种 AONs。该协议广泛适用于外显子的跳跃和包含其他基因和各种细胞类型。此外, 大多数的怡人化学 (PMOs 除外) 可以用这种方法转染。AONs 可以调节内源和人工导入基因的前 mRNA 剪接, 并可与携带靶向基因的质粒载体进行联合转染。
该方法的一个关键步骤是, 当 AONs 转染成纤维细胞时, 细胞融合应约 65-80%。对于其他单元格类型, 此条件可能不同。AONs 的最佳浓度的转染可以也不同 (0.5-100 nM), 取决于目标序列和细胞类型。
这种方法不是没有潜在的陷阱。例如, mixmers 的功效是由 mixmers 和低噪声/DNA 组成的序列决定的。对于 ISS-N1, 一个 mixmer, 它由 dna 在每第三核苷酸位置被替换为低噪声放大细胞的 LNAs, 比 mixmer 在每一个核苷酸或全低噪声的寡核苷酸中 dna 替代的等效序列更有效13.但是, 对于其他目标序列, 这可能是不同的。因此, 有必要优化低噪声/DNA mixmers 序列, 并评估 mixmers 在 RNA 水平上的有效性, 然后再进一步。mixmers 的整个骨干应 phosphorothioated, 以防止退化。此外, 虽然这种 lipotransfection 介导的转染方法可用于大多数怡得化学, 但它不能用于电荷中性 phosphorodiamidate 吗啉代寡聚物 (PMOs), 因为 lipotransfection 需要负 带电的寡核苷酸。对于 PMO 转染方法, 请参阅其他23、24、25。
虽然这种方法是有用的测试新的 AONs, SMA 成纤维细胞模型不重述在体内条件的整体。动物模型可以作为测试体内有效性和安全性26的重要来源。
对于跳过/包含的外显子, 可以使用 PMO 和-2′-乙修改 (2 ' 教育部) 代替低噪声放大/DNA mixmers27,28。然而, 这些化学用于转染的最佳浓度通常更高29,30。由于与其他反义化学药物相比效果更好, 因此使用低噪声或 DNA mixmer 的反义寡核苷酸可能是治疗遗传疾病引起的剪接缺损的一种很有吸引力的治疗策略。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢妮可 McRorie 的帮助与实验。这项工作得到了阿尔伯塔大学医学院和牙科学院的支持, Slipchuk SMA 研究基金会研究基金, 加拿大卫生研究院 (卫生研究院), 加勒特的朋友卡明研究基金会, Toupin 神经学科研经费、加拿大肌肉萎缩症、加拿大创新基金会、艾伯塔省企业和高级教育以及妇女儿童健康研究所 (WCHRI)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SMA Fibroblasts | Coriell NIGMS human genetic cell repository | GM03813 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher | 11320033 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F1051 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher | 25300062 | |
| Serum-deprived media | Thermo Fisher | 31985070 | |
| Transfection reagent | Thermo Fisher | 15338100 | |
| guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform (TRIzol) | Thermo Fisher | 15596-018 | |
| RT-PCR Primers | Sequence 5' to 3' | ||
| SMN2 forward: | CTGCCTCCATTTCCTTCTG | ||
| SMN2 reverse: | TGGTGTCATTTAGTGCTGCTC | ||
| GAPDH forward: | TCCCTGAGCTGAACGGGAAG | ||
| GAPDH reverse: | GGAGGAGTTTGGTCGCTGT | ||
| qPCR Primers | |||
| full-length SMN2 forward: | GCTATCATACTGGCTATTATATGGGTTTT | ||
| full-length SMN2 reverse: | CTCTATGCCAGCATTTCTCCTTAAT | ||
| GAPDH forward: | GCAAATTCCATGGCACCGT | ||
| GAPDH reverse: | AGGGATCTCGCTCCTGGAA | ||
| Chloroform | Sigma-Aldrich | P3803 | |
| Glycogen, RNA grade | Thermo Fisher | R0551 | |
| ImageJ Software | |||
| Protease cocktail inhibitor | Roche | 11836153001 | |
| Cathode Buffer | 0.025 M Tris base + 40 mM 6-aminocaproic acid + 20% Methanol | ||
| Anode Buffer | 0.03 M Tris Base + 20% Methanol | ||
| Concentred Anode Buffer | 0.3 M Tris base + 20% Methanol | ||
| Beta Mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | |
| PVDF membrane | GE | 10600021 | |
| Loading/sample buffer for Western blotting | NuPage Invitrogen | NP007 | |
| One-Step RT-PCR kit | Qiagen | 210210 | |
| dNTPs | Clontech | 3040 |
References
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