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Medicine

ब्याह द्वारा प्रेरित एक्सॉन शामिल करने का मूल्यांकन स्विचिंग Antisense Oligonucleotides में SMA रोगी Fibroblasts

Published: May 11, 2018 doi: 10.3791/57530
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Medical Genetics, University of Alberta Faculty of Medicine and Dentistry, 2Muscular Dystrophy Canada Research Chair, Department of Medical Genetics, University of Alberta Faculty of Medicine and Dentistry

Summary

विभिन्न antisense oligonucleotides (ााुओं) रीढ़ की हड्डी में पेशी शोष (SMA) के लिए एक्सॉन समावेश (ब्याह मॉडुलन) और बचाव SMN अभिव्यक्ति प्रेरित करने के लिए दिखाया गया है । यहां, हम ाओं lipotransfection के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए SMN2 जीन और मूल्यांकन के तरीकों में शामिल एक्सॉन को प्रेरित करने के लिए SMA रोगी fibroblasts में प्रभावकारिता का निर्धारण ।

Abstract

रीढ़ की हड्डी में पेशी शोष (SMA), एक घातक स्नायविक SMN1के नुकसान की वजह से रोग, antisense oligonucleotide (ाओं) के क्षेत्र में एक अनूठा मामला प्रस्तुत करता है-मध्यस्थता चिकित्सा. जबकि SMN1 उत्परिवर्तनों रोग के लिए जिंमेदार हैं, ााुओं लक्ष्यीकरण intronic ब्याह साइलेंसर (आईएसएस) SMN2में साइटों, एफडीए अनुमोदित nusinersen सहित, SMN अभिव्यक्ति बहाल करने के लिए और लक्षण उंनति दिखाया गया है । वर्तमान में, कई अध्ययन के उपंयास ाओं chemistries लक्ष्यीकरण SMN2 है कि अधिक प्रभावी और कम nusinersen से विषाक्त हो सकता है की जांच पर SMA ध्यान केंद्रित के लिए चिकित्सा शामिल है । यहां, हम के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन इन विट्रो में एक्सॉन शामिल किए जाने का मूल्यांकन ााुओं के lipotransfection का उपयोग रिवर्स प्रतिलेखन पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (आरटी-पीसीआर), मात्रात्मक पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (qPCR), और पश्चिमी सोख्ता द्वारा पीछा किया । इस विधि से विभिन्न प्रकार के ाओं chemistries को नियोजित किया जा सकता है. इस विधि का प्रयोग करते हुए हम यह दर्शाते हैं कि ााुओं से बना न्यूक्लिक एसिड (LNAs) और डीएनए न्यूक्लियोटाइड (LNA/डीएनए mixmers) का नेतृत्व कुशल SMN2 एक्सॉन समावेश और SMN प्रोटीन की बहाली के लिए बहुत कम एकाग्रता में होता है, और इसलिए, LNA/ डीएनए mixmer-आधारित antisense oligonucleotides एक आकर्षक चिकित्सीय रणनीति हो सकती है जो कि अनुवांशिक रोगों के कारण होने वाले दोषों का इलाज करती है । यहां वर्णित इन विट्रो मूल्यांकन विधि तेजी से, आसान है, और संवेदनशील विभिंन उपंयास ााुओं के परीक्षण के लिए पर्याप्त है ।

Introduction

रीढ़ की हड्डी में पेशी शोष (SMA) एक घातक neuromuscular विकार एक autosomal अवकाश पैटर्न में विरासत में मिला है । यह मोटर न्यूरॉन्स और प्रगतिशील ट्रंक और अंग मांसपेशी पक्षाघात1,2के क्षरण की विशेषता है । SMA घटनाओं के बहुमत मोटर ंयूरॉन 1 (SMN1) जीन3के अस्तित्व में एक homozygous उत्परिवर्तन के कारण हैं । मोटर ंयूरॉन 2 के अस्तित्व (SMN2) जीन SMN1के एक व्युत्क्रम डुप्लिकेट है, और एक लगभग समान अनुक्रम केवल पांच कुर्सियां4,5से भिंन है । एक सी के लिए SMN2 में एक्सॉन 7 में स्थित टी संक्रमण जीन लगभग गैर कार्यात्मक बनाता है क्योंकि उत्परिवर्तन आवश्यक एक्सॉन 7 की ओर जाता है SMN2 टेप के लगभग ९०% में शामिल किया जा रहा है (चित्रा 1एक) । SMN2 mRNAs लापता एक्सॉन 7 SMN1 समारोह के लिए क्षतिपूर्ति नहीं कर सकते क्योंकि इसके प्रोटीन उत्पाद अस्थिर है और तेजी से नीचा है ।

Antisense चिकित्सा हाल ही में SMA6के इलाज के लिए एक बहुत ही होनहार रणनीति के रूप में उभरा । अमेरिकी खाद्य एवं औषधि प्रशासन (एफडीए) द्वारा nusinersen के हाल ही में अनुमोदन यह पहला SMA7के इलाज के लिए उपलब्ध दवा बना दिया । Nusinersen एक 2 '-O-methoxyethyl संशोधन (मो) और एक phosphorothioate रीढ़ के साथ एक 18-मेर antisense oligonucleotide (ाओं) है । दवा intronic ब्याह साइलेंसर N1 (आईएसएस-N1) intron जीन के SMN2 7 में स्थित लक्ष्य । आईएसएस के लिए nusinersen के बंधन-N1 कार्यात्मक पूर्ण लंबाई SMN प्रोटीन अभिव्यक्ति की वसूली को बढ़ावा देने के द्वारा अंतर्जात SMN2 जीन से प्रेरित एक्सॉन 7 शामिल किए जाने (चित्रा 1ए)8,9,10 . वर्तमान में, कई अध्ययनों के उपंयास ाओं chemistries कि अधिक प्रभावी और कम nusinersen से विषाक्त हो सकता है जांच पर SMA ध्यान के लिए ाओं थेरेपी शामिल । यह प्रदर्शित किया गया है कि अंय chemistries के साथ ााुओं भी कुशलता से SMN2 एक्सॉन में शामिल एक्सॉन को प्रेरित 7 दोनों इन विट्रो में और vivo11,12,13में ।

बंद न्यूक्लिक एसिड (LNAs) रासायनिक संशोधित आरएनए एक methylene ' 2 '-furanose संरचना के भीतरऑक्सीजन (चित्रा 1बी)14,15के साथ 4 '-कार्बन को जोड़ने पुल युक्त अनुरूप हैं । DNAs या RNAs की तुलना में, LNAs पूरक आरएनए दृश्यों के लिए बाध्यकारी के लिए एक बढ़ा अपनत्व है और अंतर्जात nucleases के लिए अत्यधिक प्रतिरोधी होने का जोड़ा लाभ है. LNA रसायन विज्ञान में सीटू संकरण (मछली) और qPCR16,17में प्रतिदीप्ति के लिए जांच के रूप में उपयोग के लिए आवेदन किया गया है । इसके अलावा, यह दोनों विट्रो में और vivo मेंजीन अभिव्यक्ति को विनियमित करने के लिए उपयोग किया जाता है । GapmeR ााुओं एकल-असहाय डीएनए में कई LNAs द्वारा पार्श्व अणुओं का एक संयोजन कर रहे है ' 5 और 3 ' समाप्त होता है । वे लक्षित mRNAs के पूरक बाध्यकारी द्वारा जीन अभिव्यक्ति नीचे दस्तक, उंहें सक्रिय RNase एच18द्वारा नीचा किया जा करने के लिए कारण । LNA/डीएनए mixmers ााुओं है जो डीएनए न्यूक्लियोटाइड के बीच में एकीकृत LNAs से बना रहे हैं । इस अभिविन्यास में प्रस्तुत वे अपने कार्य को बाधित करने के लिए miRNA बाँध सकते हैं (LNA-antimiR)19. कुछ LNA-antimiRs नैदानिक विकास पर पहुँच गए हैं. उदाहरण के लिए, miravirsen (AntimiR-१२२) एक LNA-AntimiR कि रोकता मीर-१२२ हेपेटाइटिस सी संक्रमण और कई चरण द्वितीय नैदानिक परीक्षणों के इलाज के लिए वर्तमान में19,20चल रहे हैं । हाल ही में, यह प्रदर्शित किया गया है कि LNA/डीएनए mixmers भी आरएनए ब्याह21मिलाना कर सकते हैं । यह mRNA के एक विशिष्ट अनुक्रम को बाइंड कर सकते हैं और प्रेरित एक्सॉन dystrophin mRNA में लंघन और एक्सॉन शामिल करने में SMN2 mRNA इन विट्रो13,22.

इस अनुच्छेद में, हम ााुओं और आरएनए और प्रोटीन के स्तर पर प्रभावकारिता के मूल्यांकन का उपयोग एक्सॉन शामिल किए जाने की प्रेरण के लिए एक पद्धति रूपरेखा । इस विधि को उदाहरण देना करने के लिए हमने आईएसएस-N1 के intron 7 में LNA/डीएनए mixmers लक्ष्यीकरण का प्रयोग किया था । ााुओं lipotransfection प्रेरित एक्सॉन 7 अंतिम SMN2 प्रतिलिपि में शामिल किए जाने और SMN प्रोटीन उत्पादन के ऊपर विनियमन द्वारा SMA रोगी कोशिकाओं में transfected । एक्सॉन समावेशन को प्रेरित करने के लिए LNA/डीएनए mixmers का उपयोग करने के फायदों में से एक यह है कि अभिकर्मक के लिए प्रभावी एकाग्रता अन्य chemistries13की तुलना में काफी कम है । इस विधि phosphorodiamidate morpholino oligomers (PMOs), जो, उनके तटस्थ प्रभार के कारण के अलावा कई अंय ााुओं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है endocytosis-पोर्टर सह इंडो एजेंट द्वारा प्रेरित अभिकर्मक के माध्यम से कोशिकाओं को दर्ज करने की जरूरत है ।

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Protocol

1. सेल संस्कृति

  1. संस्कृति SMA रोगी fibroblasts में वृद्धि मध्यम (Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम 1:1 एफ 12 (हैम) के साथ 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक सह2 मशीन में ०.५% पेनिसिलिन/
  2. सेल एकाग्रता का निर्धारण एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग कर और कोशिकाओं को पतला करने के लिए 1 x 105 कोशिकाओं/एमएल में वृद्धि मध्यम, तो उचित थाली पर बीज । आरटी-पीसीआर या qPCR के लिए 12-well प्लेट्स (प्रति कुआं 1 मिलीलीटर) का उपयोग करें ।
  3. ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक सह2 मशीन में 24 एच के लिए प्लेट्स की मशीन ।

2. LNA/डीएनए mixmer अभिकर्मक

  1. इष्टतम अभिकर्मक दक्षता के लिए ६५-८०% के आसपास के सेल प्रवाह सुनिश्चित करें ।
  2. गल 10 माइक्रोन LNA/डीएनए mixmers धीरे से बर्फ पर ।
  3. १.५-एमएल ट्यूब में सीरम-वंचित मीडिया को mixmers जोड़कर एक 20x mixmer सॉल्यूशन तैयार करें ताकि अंतिम मात्रा ५० μL तक पहुंच जाए ।
  4. 3% अभिकर्मक रिएजेंट (1:1 अनुपात) युक्त सीरम-वंचित मीडिया के ५० μL के साथ mixmer सॉल्यूशन मिलाएं ।
  5. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए मशीन ।
  6. प्रत्येक ट्यूब के लिए 5% FBS के साथ ९०० μL सीरम-वंचित माध्यम जोड़ें ।
  7. पुराने मीडिया को प्लेट से महाप्राण और 1 एमएल LNA/डीएनए mixmer अभिकर्मक रिएजेंट युक्त समाधान के साथ प्रतिस्थापित करें ।
  8. एक सह2 मशीन में ३७ डिग्री सेल्सियस पर 24-48 ज के लिए कोशिकाओं को मशीन ।

3. आरएनए निष्कर्षण

  1. मध्यम निकालें और कोशिकाओं के लिए guanidinium thiocyanate-phenol-क्लोरोफॉर्म एजेंट के 1 मिलीलीटर जोड़ें । guanidinium thiocyanate-phenol-क्लोरोफॉर्म के साथ अच्छी तरह से कई बार के नीचे धोने और १.५ मिलीलीटर ट्यूबों में इसे इकट्ठा ।
  2. 30 एस के लिए उच्च गति पर भंवर और 1 ज या रात भर के लिए-८० ° c में स्टोर ।
  3. नमूनों को कमरे के तापमान और भंवर में अच्छी तरह से गल ।
  4. जोड़ें २०० µ l क्लोरोफॉर्म, 15 एस के लिए जोरदार हिला, और 3 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर गर्मी ।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए १२,००० x g पर केंद्रापसारक ।
  6. एक नया ट्यूब में शीर्ष साफ जलीय चरण लीजिए । सफेद दौर के किसी भी है कि ऊपरी और निचले चरणों के बीच रूपों का संग्रह से बचने के लिए सुनिश्चित करें ।
  7. Add ५०० µ l isopropanol और 1 µ l 8 µ g/µ l ग्लाइकोजन (आरएनए ग्रेड). 10 एस के लिए भंवर और 10 मिनट या पर-20 डिग्री सेल्सियस रात भर के लिए कमरे के तापमान पर गर्मी ।
  8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए १२,००० x g पर केंद्रापसारक और supernatant के सभी हटा दें । एक सफेद गोली ट्यूब के तल पर बनेगी ।
  9. 1 मिलीलीटर ठंड ७५% इथेनॉल जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ७,५०० x g पर केंद्रापसारक ।
  10. सभी इथेनॉल निकालें और कमरे के तापमान पर गोली सूखी जब तक कोई इथेनॉल ट्यूब में छोड़ दिया है ।
  11. 30 µ l DNase/RNase मुफ्त पानी में गोली भंग, और ६० डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए मशीन ।
  12. एक spectrophotometer का उपयोग आरएनए एकाग्रता उपाय (२६० एनएम पर), और ५० एनजी/µ एल आरएनए एकाग्रता को समायोजित

4. एक कदम आरटी-पीसीआर के एक्सॉन शामिल किए जाने की दर को मापने के लिए SMN2

  1. मिश्रण १२.५ µ एल के 2x आरटी-पीसीआर प्रतिक्रिया बफर, १.० µ एल वन-स्टेप आरटी-पीसीआर एंजाइम मिक्स, प्रत्येक प्राइमरी के ०.५ µ एल (SMN2 फॉरवर्ड: 5 '-CTGCCTCCATTTCCTTCTG-3 ', SMN2 रिवर्स: 5 '-TGGTGTCATTTAGTGCTGCTC-3 ', GAPDH फॉरवर्ड: 5 '-TCCCTGAGCTGAACGGGAAG-3 ', GAPDH रिवर्स: 5 '-GGAGGAGTTTGGTCGCTGT-3 ', कुल आरएनए के 2 µ एल (५० एनजी/µ एल), और µ के ८.५ RNase एल के DNase-मुक्त आसुत जल ।
  2. के बाद सीडीएनए 15 मिनट के लिए ५० डिग्री सेल्सियस पर संश्लेषित है, पीसीआर प्रतिक्रिया शुरू करते हैं । 30 पीसीआर चक्र के साथ SMN2 एक्सॉन 6-8 बढ़ाना (९४ ° c के लिए 15 एस, ६० ° c 30 s के लिए, ६८ ° c 25 s के लिए) । 20 पीसीआर चक्र के साथ GAPDH बढ़ाना (९४ ° c के लिए 15 एस, ६० ° c के लिए 30 s, ६८ ° c 20 s के लिए).
  3. पीसीआर उत्पाद के लिए 5 μL 6x लोडिंग डाई जोड़ें, और एक 2% agarose जेल में मिश्रण के 5 µ एल लोड और १०० वी में ४० मिनट के लिए चलाते हैं ।
  4. जेल छवि और ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग कर इसका विश्लेषण.
  5. पूर्ण लंबाई बैंड और Δ7 बैंड की तीव्रता को मापने । की दर की गणना एक्सॉन 7 की तीव्रता मान द्वारा शामिल किए जाने (पूर्ण लंबाई)/(पूर्ण लंबाई + Δ7 SMN2) ।

5. मात्रात्मक पीसीआर (qPCR) के एक्सॉन समावेशन दर को मापने के लिए SMN2

  1. सीडीएनए संश्लेषण के लिए, मिश्रण 1 µ l Oligo dT, 1 µ l 10 mM dNTPs, और 11 µ l कुल आरएनए (५० एनजी/µ l). 5 मिनट के लिए ६५ ° c पर मशीन ।
  2. नमूनों को बर्फ पर लगाएं और 4 µ l 5x बफर, 1 µ l ०.१ M डीटीटी, 1 µ l RNase अवरोधक, और 1 µ l रिवर्स transcriptase प्रत्येक नमूने को जोड़ें ।
  3. ६० मिनट के लिए ५० ° c पर मशीन, और 10 मिनट के लिए ८० ° c करने के लिए गर्मी प्रतिक्रिया को रोकने के लिए । सीडीएनए-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है ।
  4. RNase-मुफ्त पानी (1:5 कमजोर पड़ने) के साथ cDNAs पतला । मिश्रण 10 µ एल 2x SYBR ग्रीन qPCR एंजाइम मिश्रण, ०.८ µ l 10 µ मी प्रत्येक प्राइमरी (पूर्ण लंबाई SMN2 फॉरवर्ड: 5 ′-GCTATCATACTGGCTATTATATGGGTTTT-3 ′, पूर्ण लंबाई SMN2 रिवर्स: 5 ′-CTCTATGCCAGCATTTCTCCTTAAT-3 ′, Δ7 SMN2 फॉरवर्ड: 5 ′- TCTGGACCACCAATAATTCCCC-3 ′, Δ7 SMN2 रिवर्स: 5 ′-ATGCCAGCATTTCCATATAATAGCC-3 ′, GAPDH फॉरवर्ड: 5 ′-GCAAATTCCATGGCACCGT-3 ′, GAPDH रिवर्स: 5 ′-AGGGATCTCGCTCCTGGAA-3 ′), 3 µ l पतला सीडीएनए, और ५.४ µ l RNase-मुफ्त पानी ।
  5. qPCR प्रतिक्रिया सुरु करा. शर्तों का उपयोग करें: ९५ ° c 30 s के लिए, तो एक ४० चक्र 5 एस के लिए ९५ ° c और ६० के लिए 20 एस डिग्री सेल्सियस पर दोहराएँ.
  6. पूर्ण-लंबाई SMN2 के सापेक्ष व्यंजक की गणना GAPDH या Δ7 SMN2के लिए करें, और ΔΔCt एल्गोरिथ्म के साथ गैर-उपचारित कक्षों को सामान्य करें.

6. वेस्टर्न सोख्ता

  1. कोशिकाओं से अभिकर्मक माध्यम निकालें और एक बार फास्फेट बफर खारा (पंजाब) के साथ धोने ।
  2. एक छेड़-छाड़ के साथ १०० µ l lysis बफर जोड़ें.
  3. एक अच्छी तरह से एक बाँझ सेल खुरचनी का उपयोग कर के नीचे से कोशिकाओं को अलग करें, और १.५ मिलीलीटर ट्यूबों में इकट्ठा । 30 मिनट के लिए बर्फ पर नमूने की मशीन ।
  4. कोशिकाओं को कुचलने के लिए 21-जी सुई 10 बार के माध्यम से सेल lysate दर्रा ।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए २०,८०० x g पर केंद्रापसारक और नए १.५-एमएल ट्यूबों में supernatant इकट्ठा । नमूना एक-८० ° c डीप फ्रीजर में संग्रहित किया जा सकता है ।
  6. एक बीसीए प्रोटीन परख किट का उपयोग प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण, और १.० µ g/µ एल के लिए एकाग्रता को समायोजित
  7. मिश्रण 5 µ एल नमूने और 5 µ एल 2x सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) नमूना बफर (10% एसडीएस; 14% 0.5 m Tris-एचसीएल सॉल्यूशन, पीएच ६.७; 1% 0.5 m EDTA-2Na स्टॉक सॉल्यूशन, पीएच ८.०; 20% ग्लिसरॉल; ०.००४% bromophenol ब्लू डाई, 5% β-mercaptoethanol) और 10 मिनट के लिए ७० डिग्री सेल्सियस पर हीट ।
  8. एक 4-12% बीआईएस-Tris प्रोटीन जैल में नमूनों लोड और १५० वी में 1 ज के लिए चलाते हैं ।
  9. प्रत्येक बफ़र में एक मोटा फ़िल्टर काग़ज़ भिगोएं: (केंद्रित anode बफर: ०.३ मी Tris-एचसीएल, २० टक्के मेथनॉल; anode बफर: ०.०३ मीटर Tris-एचसीएल, २० टक्के मेथनॉल; कैथोड बफ़र: 25 मिमी Tris, 20% मेथनॉल, ४० मिमी 6-अमीनो-n-hexanoic एसिड, ०.०१% एसडीएस) ।
  10. 20 एस के लिए मेथनॉल में एक polyvinylidene difluoride (PVDF) झिल्ली सोख, तो यह anode बफर में स्थानांतरण ।
  11. आंदोलन के तहत 5-10 मिनट के लिए कैथोड बफर के साथ एसडीएस-पृष्ठ के बाद जेल Equilibrate ।
  12. फिल्टर कागज, PVDF झिल्ली और एक अर्द्ध सूखी सोख्ता मशीन पर जेल, इस प्रकार है: केंद्रित anode बफर कागज/anode बफर कागज/PVDF झिल्ली/प्रोटीन जेल/कैथोड बफर पेपर (चित्र 2) ।
  13. कवर ढेर और 30 मिनट के लिए 20 वी में स्थानांतरण शुरू करते हैं ।
  14. हस्तांतरण के बाद, PBST के साथ PVDF झिल्ली कुल्ला (०.०५% के साथ पंजाब 20 के बीच) एक बार ।
  15. 5% में 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर झिल्ली ब्लॉक PBST में या रात भर के लिए 4 डिग्री सेल्सियस में भंग मिल्क पाउडर स्किम ।
  16. एक शुद्ध माउस विरोधी SMN एंटीबॉडी और एक खरगोश विरोधी Cofilin एंटीबॉडी को पतला 1:10000 में 5% PBST में स्किम मिल्क पाउडर । कमरे के तापमान पर या 4 डिग्री सेल्सियस रात भर में 1 घंटे के लिए इसमें झिल्ली की मशीन ।
  17. 10 मिनट के लिए PBST के साथ 3 बार धो लें ।
  18. माध्यमिक एंटीबॉडी पतला (एचआरपी-संयुग्मित बकरी विरोधी माउस और विरोधी खरगोश आईजीजी (एच + एल)) 1 करने के लिए: 10000 में 5% PBST में स्किम मिल्क पाउडर. अंधेरे में कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए मशीन ।
  19. 10 मिनट के लिए PBST के साथ झिल्ली धो 3 बार ।
  20. chemiluminescence वेस्टर्न सोख्ता डिटेक्शन किट का उपयोग करके बैंड सिग्नल का पता लगाएं ।

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Representative Results

SMA रोगी fibroblasts का उपयोग कर, हम intron 7 में आईएसएस-N1 साइलेंसर क्षेत्र को लक्षित आठ अलग SMN2 antisense/डीएनए LNA कि एक 5 एनएम एकाग्रता में mixmers थे के साथ transfected जीन (चित्रा 3) । mixmers के प्रत्येक एक संशोधित phosphorothioated रीढ़ जो उंहें nuclease क्षरण का विरोध करने के लिए सक्षम निहित । mixmers की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए, SMN2 एक्सॉन 7 शामिल किए जाने की दर को आरटी द्वारा quantified-पीसीआर और qPCR के लिए विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग कर रहा है SMN2। एक्सॉन 7 की शामिल दक्षता ७८-९८% से लेकर जब रोगी कोशिकाओं में mixmers #1-5 के साथ transfected (चित्रा 4ए, बी), जबकि अभिकर्मक का उपयोग mixmers #6-8 एक ही खुराक में किसी भी महत्वपूर्ण अंतर में परिणाम नहीं किया जब की तुलना में नियंत्रण । qPCR विश्लेषण से प्राप्त परिणामों को भी प्रदर्शित किया है कि पूर्ण लंबाई की मात्रा SMN2 mRNA प्रतिलिपि काफी mixmers #1-3 और #5 उपचार जब नियंत्रण की तुलना में बढ़ गया था (चित्रा 4सी) ।

इसके अलावा, पश्चिमी सोख्ता के परिणाम से पता चला है कि अभिकर्मक का उपयोग mixmers #1-5 रोगी fibroblasts में SMN प्रोटीन अभिव्यक्ति के उच्च स्तर सक्षम (एक १.५-१.९-नियंत्रण से गुना वृद्धि, चित्रा 5). mixmers #6-8 का उपयोग कर उपचार कोशिकाओं में SMN प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर में एक परिवर्तन में परिणाम नहीं था । इन आंकड़ों का प्रदर्शन है कि अभिकर्मक LNA/डीएनए mixmers #1-5 के SMN2 एक्सॉन 7 समावेश कुशलतापूर्वक में SMA रोगी fibroblasts ।

Figure 1
चित्र 1 : Antisense-मध्यस्थता एक्सॉन शामिल करने की रणनीति SMA के इलाज के लिए. (क) एक सी के लिए SMN2 के एक्सॉन 7 में टी संक्रमण SMN2 टेप के लगभग ९०% में 7 एक्सॉन के लंघन की ओर जाता है । ये टेप बाहर के फ्रेम कर रहे है और तेजी से कोशिकाओं में नीचा दिखा रहे हैं । Antisense oligonucleotides (ााुओं) बाँध intronic ब्याह साइलेंसर N1 (आईएसएस-N1), जो एक्सॉनमें SMN2 समावेश लाती है. एक्सॉन 7-शामिल SMN2 mRNAs कार्यात्मक SMN प्रोटीन का उत्पादन कर सकते हैं । (ख) आरएनए और phosphorothioated LNA की रासायनिक संरचनाओं. mixmers हम इस लेख में इस्तेमाल की पूरी रीढ़ की कटाई को रोकने के लिए phosphorothioated हैं । Touznik et.al से यह आंकड़ा संशोधित किया गया है । 13. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2 : पश्चिमी सोख्ता के लिए अर्द्ध शुष्क स्थानांतरण विधि । एक मोटी फिल्टर केंद्रित में लथपथ कागज (चोर.) Anode बफर, एक मोटी फिल्टर Anode बफर, एक PVDF झिल्ली, एक जेल और एक मोटी फिल्टर कैथोड बफर में लथपथ कागज में लथपथ कागज एक अर्द्ध सूखी सोख्ता मशीन के दो प्लेटों के बीच खड़ी कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 : LNA/DNA mixmer अनुक्रम के लिए SMN2 एक्सॉन 7 समावेशन. डीएनए बेस: g, a, T, C. LNA base (लाल): + G, + A, + T, + c. Phosphorothioated dna base: g *, a *, t *, c *. Phosphorothioated LNA आधार (लाल): + G *, + अ *, + T *, + C *. यह आंकड़ा Touznik et.al से reproduced है । 13. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4 : RT-पीसीआर और qPCR के प्रतिनिधि परिणाम LNA/डीएनए mixmers की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए. mixmers #1-5 के अभिकर्मक को मॉक अभिकर्मक की तुलना में काफी अधिक दर पर SMN2 एक्सॉन 7 का समावेश होता है । (क) RT-पीसीआर के SMN2 और GAPDH में SMA रोगी fibroblasts 5 एनएम एकाग्रता पर निम्न अभिकर्मक. शीर्ष बैंड: एक्सॉन 7-शामिल पूर्ण लंबाई SMN2 mRNA । बॉटम बैंड: एक्सॉन 7-निए SMN2 mRNA. (ख) SMN2 एक्सॉन 7 के परिमाणात्मक विश्लेषण mixmer-इलाज SMA fibroblasts का उपयोग आरटी-पीसीआर में शामिल किए जाने के । (ग) पूर्ण लंबाई SMN2 के सापेक्ष अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए GAPDH qPCR का उपयोग कर मापा । डेटा गैर-इलाज नियंत्रण कक्षों के लिए सामान्यीकृत किया गया था । त्रुटि पट्टियां माध्य ± मानक विचलन (तीन स्वतंत्र प्रयोग) का प्रतिनिधित्व करती हैं । Dunnett के कई तुलना परीक्षण के साथ एक तरह ANOVA प्रदर्शन किया गया था । एम: नकली नियंत्रण, NT: गैर इलाज, एच: स्वस्थ नियंत्रण fibroblast कोशिकाओं, ख: रिक्त । यह आंकड़ा Touznik et.al से reproduced है । 13. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्र 5 : पश्चिमी सोख्ता के प्रतिनिधि परिणाम SMN प्रोटीन अभिव्यक्ति को मापने के लिए । अभिकर्मक of the LNA/डीएनए mixmers से SMN प्रोटीन का उत्पादन बढ़ता है । (क) वेस्टर्न सोख्ता ऑफ SMN एण्ड Cofilin (लोडिंग कंट्रोल) के स्वस्थ तथा mixmer-स्वास्थ्यकर्मी स्म रोगी fibroblasts. (ख) mixmer-उपचारित SMA fibroblasts के SMN प्रोटीन के स्तर में गुना वृद्धि । 5 एनएम एकाग्रता में mixmers #1-5 की अभिकर्मक काफी SMN प्रोटीन का उत्पादन बढ़ जाती है । डेटा गैर-इलाज SMA fibroblasts में SMN/Cofilin के अनुपात को सामान्यीकृत किया गया । सलाखों मतलब ± मानक विचलन (चार स्वतंत्र प्रयोगों) का प्रतिनिधित्व करते हैं । Dunnett के कई तुलना परीक्षण के साथ एक तरह ANOVA प्रदर्शन किया गया था । एम: नकली नियंत्रण, NT: गैर इलाज । यह आंकड़ा Touznik et.al से reproduced है । 13. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

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Discussion

यहां वर्णित इन विट्रो मूल्यांकन विधि तेजी से, आसान है, और संवेदनशील विभिंन ााुओं के परीक्षण के लिए पर्याप्त है । इस प्रोटोकॉल व्यापक रूप से एक्सॉन लंघन और अंय जीन और विभिंन प्रकार के सेल के शामिल किए जाने के लिए लागू है । इसके अलावा, अधिकांश ाओं chemistries (PMOs को छोड़कर) इस विधि का प्रयोग transfected जा सकता है । ााुओं दोनों अंतर्जात और कृत्रिम रूप से शुरू की जीन से पूर्व mRNA के ब्याह को विनियमित कर सकते हैं, और प्लाज्मिड के साथ सह transfected जा सकता है लक्षित जीन ले वैक्टर ।

इस विधि का एक महत्वपूर्ण कदम है कि सेल को प्रभावित ६५ के आसपास होना चाहिए-८०% जब ााुओं fibroblasts में transfected हैं । यह शर्त अंय कक्ष प्रकारों के लिए भिंन हो सकती है । अभिकर्मक के लिए ााुओं का सबसे अच्छा एकाग्रता भी अलग किया जा सकता है (०.५-१०० एनएम), लक्षित दृश्यों और सेल प्रकार के आधार पर.

यह विधि संभावित नुकसान के बिना नहीं है । उदाहरण के लिए, mixmers की प्रभावकारिता mixmers और LNA/डीएनए संरचना के अनुक्रम द्वारा निर्धारित किया जाता है । आईएसएस के लिए-N1, एक mixmer, जो डीएनए के साथ LNAs से बना है हर तीसरे न्यूक्लियोटाइड स्थिति में LNA के लिए प्रतिस्थापित किया जा रहा है, और हर दूसरे mixmer या सभी न्यूक्लियोटाइड LNA में डीएनए प्रतिस्थापन के साथ एक समकक्ष अनुक्रम के साथ एक oligonucleotide से अधिक प्रभावी था13 . हालांकि, यह अंय लक्ष्य अनुक्रम के लिए भिंन हो सकता है । इसलिए, यह LNA/डीएनए mixmers के दृश्यों का अनुकूलन और आगे जाने से पहले आरएनए स्तर पर mixmers की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए आवश्यक है । क्षरण को रोकने के लिए mixmers की पूरी रीढ़ की phosphorothioated होनी चाहिए । इसके अतिरिक्त, यद्यपि इस lipotransfection-मध्यस्थता अभिकर्मक पद्धति का उपयोग अधिकांश ाओं chemistries के लिए किया जा सकता है, इसका उपयोग शुल्क-तटस्थ phosphorodiamidate morpholino oligomers (PMOs) के लिए नहीं किया जा सकता, क्योंकि lipotransfection की आवश्यकता ऋणात्मक है आरोपी oligonucleotides. पीएमओ अभिकर्मक विधियों के लिए, कहीं23,24,25देखें ।

हालांकि इस विधि उपंयास ााुओं परीक्षण के लिए उपयोगी है, SMA fibroblast सेल मॉडल अपनी संपूर्णता में vivo स्थितियों में दोहराऊंगा नहीं है । पशु मॉडल vivo प्रभावकारिता और सुरक्षा26 में परीक्षण करने के लिए एक महत्वपूर्ण स्रोत के रूप में सेवा कर सकते हैं ।

एक्सॉन लंघन/शामिल किए जाने के लिए, पीएमओ और 2 '-O-methoxyethyl संशोधन (2 ' मो) LNA/डीएनए mixmers27,28के बजाय इस्तेमाल किया जा सकता है । हालांकि, अभिकर्मक के लिए इन chemistries के इष्टतम एकाग्रता आम तौर पर बहुत अधिक है29,30। अंय antisense chemistries की तुलना में बेहतर प्रभावकारिता के कारण, LNA/डीएनए mixmer-आधारित antisense oligonucleotides का उपयोग भविष्य में आनुवंशिक रोगों के कारण ब्याह दोष के इलाज के लिए एक आकर्षक चिकित्सीय रणनीति हो सकती है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखकों के प्रयोगों के साथ मदद के लिए निकोल McRorie धंयवाद । यह काम चिकित्सा और दंत चिकित्सा के अलबर्टा संकाय के विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया था, Slipchuk SMA अनुसंधान फाउंडेशन अनुसंधान अनुदान, स्वास्थ्य अनुसंधान के कनाडाई संस्थानों (CIHR), गैरेट कमिंग रिसर्च फंड के दोस्तों, एचएम Toupin स्नायविक विज्ञान अनुसंधान कोष, पेशी Dystrophy कनाडा, नवाचार के लिए कनाडा फाउंडेशन, अलबर्टा उद्यम और उंनत शिक्षा, और महिलाओं और बच्चों के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान (WCHRI) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SMA Fibroblasts Coriell NIGMS human genetic cell repository GM03813
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Thermo Fisher 11320033
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich F1051
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher 15140122
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Thermo Fisher 25300062
Serum-deprived media Thermo Fisher 31985070
Transfection reagent Thermo Fisher 15338100
guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform (TRIzol) Thermo Fisher 15596-018
RT-PCR Primers Sequence 5' to 3'
SMN2 forward:  CTGCCTCCATTTCCTTCTG
SMN2 reverse:  TGGTGTCATTTAGTGCTGCTC
GAPDH forward:  TCCCTGAGCTGAACGGGAAG
GAPDH reverse:  GGAGGAGTTTGGTCGCTGT
qPCR Primers
full-length SMN2 forward: GCTATCATACTGGCTATTATATGGGTTTT
full-length SMN2 reverse:  CTCTATGCCAGCATTTCTCCTTAAT
GAPDH forward:  GCAAATTCCATGGCACCGT
GAPDH reverse: AGGGATCTCGCTCCTGGAA
Chloroform Sigma-Aldrich P3803
Glycogen, RNA grade Thermo Fisher R0551
ImageJ Software
Protease cocktail inhibitor  Roche 11836153001
Cathode Buffer 0.025 M Tris base + 40 mM 6-aminocaproic acid + 20% Methanol
Anode Buffer 0.03 M Tris Base + 20% Methanol
Concentred Anode Buffer 0.3 M Tris base + 20% Methanol
Beta Mercaptoethanol  Millipore ES-007-E
PVDF membrane  GE 10600021
Loading/sample buffer for Western blotting NuPage Invitrogen NP007
One-Step RT-PCR kit  Qiagen  210210
dNTPs Clontech 3040

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References

  1. Iascone, D. M., Henderson, C. E., Lee, J. C. Spinal muscular atrophy: from tissue specificity to therapeutic strategies. F1000Prime Rep. 7, 4 (2015).
  2. Touznik, A., Lee, J. J., Yokota, T. New developments in exon skipping and splice modulation therapies for neuromuscular diseases. Expert Opin Biol Ther. 14 (6), 809-819 (2014).
  3. Lefebvre, S., et al. Identification and Characterization of a Spinal Muscular Atrophy-Determining Gene. Cell. 80 (1), 155-165 (1995).
  4. Lorson, C. L., Hahnen, E., Androphy, E. J., Wirth, B. A single nucleotide in the SMN gene regulates splicing and is responsible for spinal muscular atrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (11), 6307-6311 (1999).
  5. Monani, U. R., et al. A single nucleotide difference that alters splicing patterns distinguishes the SMA gene SMN1 from the copy gene SMN2. Hum Mol Genet. 8 (7), 1177-1183 (1999).
  6. Lee, J. J., Yokota, T. Antisense therapy in neurology. J Pers Med. 3 (3), 144-176 (2013).
  7. Aartsma-Rus, A. FDA Approval of Nusinersen for Spinal Muscular Atrophy Makes 2016 the Year of Splice Modulating Oligonucleotides. Nucleic Acid Ther. 27 (2), 67-69 (2017).
  8. Hua, Y., et al. Peripheral SMN restoration is essential for long-term rescue of a severe spinal muscular atrophy mouse model. Nature. 478 (7367), 123-126 (2011).
  9. Hua, Y., Vickers, T. A., Baker, B. F., Bennett, C. F., Krainer, A. R. Enhancement of SMN2 exon 7 inclusion by antisense oligonucleotides targeting the exon. PLoS Biol. 5 (4), 73 (2007).
  10. Passini, M. A., et al. Antisense oligonucleotides delivered to the mouse CNS ameliorate symptoms of severe spinal muscular atrophy. Sci Transl Med. 3 (72), (2011).
  11. Hammond, S. M., et al. Systemic peptide-mediated oligonucleotide therapy improves long-term survival in spinal muscular atrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (39), 10962-10967 (2016).
  12. Porensky, P. N., et al. A single administration of morpholino antisense oligomer rescues spinal muscular atrophy in mouse. Hum Mol Genet. 21 (7), 1625-1638 (2012).
  13. Touznik, A., Maruyama, R., Hosoki, K., Echigoya, Y., Yokota, T. LNA/DNA mixmer-based antisense oligonucleotides correct alternative splicing of the SMN2 gene and restore SMN protein expression in type 1 SMA fibroblasts. Sci Rep. 7 (1), 3672 (2017).
  14. Obika, S., et al. Synthesis of 2'-O,4'-C-methyleneuridine and -cytidine. Novel bicyclic nucleosides having a fixed C-3,-endo sugar puckering. Tetrahedron Letters. 38 (50), 8735-8738 (1997).
  15. Singh, S. K., Nielsen, P., Koshkin, A. A., Wengel, J. LNA (locked nucleic acids): synthesis and high-affinity nucleic acid recognition. Chemical Communications. (4), 455-456 (1998).
  16. Navarro, E., Serrano-Heras, G., Castano, M. J., Solera, J. Real-time PCR detection chemistry. Clin Chim Acta. 439, 231-250 (2015).
  17. Urbanek, M. O., Nawrocka, A. U., Krzyzosiak, W. J. Small RNA Detection by in Situ Hybridization Methods. Int J Mol Sci. 16 (6), 13259-13286 (2015).
  18. Wahlestedt, C., et al. Potent and nontoxic antisense oligonucleotides containing locked nucleic acids. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (10), 5633-5638 (2000).
  19. Rupaimoole, R., Slack, F. J. MicroRNA therapeutics: towards a new era for the management of cancer and other diseases. Nat Rev Drug Discov. 16 (3), 203-222 (2017).
  20. Lanford, R. E., et al. Therapeutic silencing of microRNA-122 in primates with chronic hepatitis C virus infection. Science. 327 (5962), 198-201 (2010).
  21. Shimo, T., Maruyama, R., Yokota, T. Designing Effective Antisense Oligonucleotides for Exon Skipping. Methods Mol Biol. 1687, 143-155 (2018).
  22. Shimo, T., et al. Design and evaluation of locked nucleic acid-based splice-switching oligonucleotides in vitro. Nucleic Acids Res. 42 (12), 8174-8187 (2014).
  23. Nguyen, Q., Yokota, T. Immortalized Muscle Cell Model to Test the Exon Skipping Efficacy for Duchenne Muscular Dystrophy. J. Pers. Med. 7 (4), 13 (2017).
  24. Echigoya, Y., et al. Quantitative Antisense Screening and Optimization for Exon 51 Skipping in Duchenne Muscular Dystrophy. Mol Ther. , (2017).
  25. Saito, T., et al. Antisense PMO found in dystrophic dog model was effective in cells from exon 7-deleted DMD patient. PLoS One. 5 (8), 12239 (2010).
  26. Donnelly, E. M., et al. Characterization of a murine model of SMA. Neurobiol Dis. 45 (3), 992-998 (2012).
  27. Lim, K. R., Maruyama, R., Yokota, T. Eteplirsen in the treatment of Duchenne muscular dystrophy. Drug Des Devel Ther. 11, 533-545 (2017).
  28. Paton, D. M. Nusinersen: antisense oligonucleotide to increase SMN protein production in spinal muscular atrophy. Drugs Today (Barc). 53 (6), 327-337 (2017).
  29. Prakash, T. P., et al. Comparing in vitro and in vivo activity of 2'-O-[2-(methylamino)-2-oxoethyl]- and 2'-O-methoxyethyl-modified antisense oligonucleotides. J Med Chem. 51 (9), 2766-2776 (2008).
  30. Aoki, Y., et al. Bodywide skipping of exons 45-55 in dystrophic mdx52 mice by systemic antisense delivery. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (34), 13763-13768 (2012).

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चिकित्सा अंक १३५ रीढ़ की हड्डी में पेशी शोष (sma) antisense oligonucleotide (ाओं) बंद न्यूक्लिक अम्ल (LNA) antisense चिकित्सा मोटर न्यूरॉन का अस्तित्व (SMN) एक्सॉन समावेशन ब्याह मॉडुलन nusinersen Werdnig-Hoffmann रोग (SMA १) Dubowitz रोग (sma 2) Kugelberg-Welander रोग (sma 3) ब्याह स्विचन oligonucleotide (एसएसओ)
ब्याह द्वारा प्रेरित एक्सॉन शामिल करने का मूल्यांकन स्विचिंग Antisense Oligonucleotides में SMA रोगी Fibroblasts
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Maruyama, R., Touznik, A., Yokota, T. Evaluation of Exon Inclusion Induced by Splice Switching Antisense Oligonucleotides in SMA Patient Fibroblasts. J. Vis. Exp. (135), e57530, doi:10.3791/57530 (2018).

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