Summary
Различные антисмысловых олигонуклеотидов (AONs) было показано, чтобы побудить экзона включение (соединитель модуляции) и спасти SMN выражение для спинальной мышечной атрофии (SMA). Здесь мы описываем протокол для AON lipotransfection побудить включение экзона гена SMN2 и методы оценки для определения эффективности в пациента фибробластов SMA.
Abstract
Спинальной мышечной атрофии (SMA), смертельной неврологических заболеваний, вызванных потерей SMN1, представляет собой уникальный случай в области антисмысловых олигонуклеотидов (АОН)-опосредованной терапии. В то время как SMN1 мутации отвечают за болезни, включая FDA утвержденных nusinersen, показано AONs ориентации intronic сращивания глушителя (МКС) сайты в SMN2, восстановить SMN выражение и улучшить симптомы. В настоящее время многие исследования с участием AON терапии для SMA сосредоточиться на расследование Роман AON химия ориентации SMN2 , что может быть более эффективным и менее токсичен, чем nusinersen. Здесь мы описываем протокол для оценки в vitro экзона включение с помощью lipotransfection AONs, после чего обратной транскрипции полимеразной цепной реакции (ПЦР), количественные полимеразной цепной реакции (ПЦР) и Западный blotting. Этот метод может использоваться для различных типов AON химия. С помощью этого метода, мы показываем, что AONs состоит из чередующихся заблокированных нуклеиновых кислот (МШУ) и нуклеотидов ДНК (LNA/ДНК mixmers) приводят к эффективным SMN2 экзона включение и восстановление SMN белка в очень низкой концентрации и, следовательно, LNA / ДНК, на основе mixmer антисмысловых олигонуклеотидов может быть привлекательным терапевтические стратегии для лечения сплайсинга дефекты, вызванные генетических заболеваний. В vitro оценки метода, описанного здесь быстро, легко и достаточно чувствительным для тестирования различных Роман AONs.
Introduction
Спинальной мышечной атрофии (SMA) является фатальной нервно расстройства наследуется аутосомно-рецессивный шаблона. Он характеризуется деградацией двигательных нейронов и прогрессивного туловища и конечностей мышцы паралич1,2. Большинство залежей SMA вызваны гомозиготных мутация в гене выживания мотонейрона 1 (SMN1)3. Ген выживания мотонейрона 2 (SMN2) обратная копию SMN1и имеет практически идентичные последовательности, отличающихся только пять баз4,5. C-к Т переходной SMN2 расположен в экзона 7 делает гена почти нефункциональным потому что мутация приводит к важным экзона 7 исключаются в почти 90% SMN2 стенограммы(рисунок 1). SMN2 mRNAs отсутствует экзона 7 не может компенсировать SMN1 функции, потому что белковый продукт является неустойчивым и быстро разлагается.
Антисмысловые терапии недавно стала весьма перспективной стратегии для лечения SMA6. Недавнее одобрение nusinersen США продовольствия и медикаментов (FDA) сделал это первый препарат для лечения SMA7. Nusinersen является 18-mer антисмысловых олигонуклеотидов (АОН) с модификацией 2′-O-метоксиэтиловый (МО) и фосфоротиоат позвоночника. Препарат предназначен intronic сращивания глушителя N1 (МКС-N1) расположен в Интрон 7 SMN2 ген. Привязка nusinersen к МКС-N1 способствует восстановлению функциональных полнометражного SMN белка выражения от эндогенных SMN2 ген, вызывая экзона 7 Включение (рис. 1)8,9,10 . В настоящее время многие исследования с участием AON терапии для SMA сосредоточиться на расследование Роман химия AON, которые могут быть более эффективным и менее токсичен, чем nusinersen. Было продемонстрировано, что AONs с другими химия также эффективно стимулировать включение экзона в SMN2 экзона 7 как in vitro и in vivo11,12,13.
Заблокированные нуклеиновые кислоты (МШУ) являются химически модифицированных аналогов РНК, содержащие метиленовой мост, соединяющий 4′ -углерода с 2′ -кислорода в течение Фуранозы14,структуру (рис. 1б)15. По сравнению с ДНК или РНК, МШУ имеют увеличение сродство для привязки дополнительных РНК последовательности и имеют дополнительное преимущество быть устойчива к эндогенной nucleases. МШУ химии был применен для использования как зонды для флуоресценции в situ гибридизация (рыба) и ПЦР16,17. Кроме того, она используется для регулирования экспрессии генов в пробирке и в естественных условиях. GapmeR AONs представляют собой сочетание молекул одноцепочечной ДНК, в окружении нескольких МШУ на 5 ' и 3 ' концах. Они сбить экспрессии генов путем привязки дополнительных целевых мРНК, заставляя их деградации, активированного H РНКазы18. МШУ/ДНК mixmers являются AONs, которые состоят из нуклеотидов ДНК, интегрированы между МШУ. Представленные в этой ориентации они можно привязать Мирна препятствовать ее функции (LNA-antimiR)19. Некоторые МШУ antimiRs достигли клинические разработки. Для примеров miravirsen (AntimiR-122) МШУ antimiR, который подавляет мир-122 для лечения гепатита с и несколько фазы II клинических испытаний в настоящее время19,20. Недавно было продемонстрировано, что LNA/ДНК mixmers также может модулировать РНК сплайсинга21. Он может связать определенную последовательность мРНК и побудить экзона пропуск в мРНК и экзона включение делеций в SMN2 мРНК в vitro13,22.
В этой статье мы приводим методологию для индукции экзона включение с помощью AONs и оценки эффективности на уровне РНК и белка. Чтобы проиллюстрировать этот метод, мы использовали mixmers LNA/ДНК, ориентации МКС-N1 в Интрон 7 SMN2. AONs transfected в клетки пациентов SMA по lipotransfection индуцированных экзона 7 включение в окончательный SMN2 Стенограмма и upregulation производства белка SMN. Одним из преимуществ использования LNA/ДНК mixmers побудить экзона включение является эффективная концентрация для transfection значительно ниже, чем другие химия13. Этот метод может использоваться для многих других AONs, за исключением phosphorodiamidate Морфолино олигомеров (PMOs), которые, благодаря их нейтральный заряд, необходимо ввести клетки путем эндоцитоза индуцированных Эндо-Портер Сопредседатель трансфекции реагента.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. клеточная культура
- Пациент фибробластов SMA культуры в рост среднего (Дульбекко изменение орел средних 1: 1 F-12 (Ham) с 10% плода бычьим сывороточным (ФБС) и 0,5% пенициллина/стрептомицина) в инкубатор CO2 при 37 ° C.
- Определения концентрации клеток, используя счетчик автоматизированных клеток и разбавленных клетки до 1 x 105 клеток/мл в среднего роста, затем семена на соответствующие пластины. Используйте 12-ну пластины (1 мл на хорошо) для RT-PCR или ПЦР.
- Инкубировать пластины для 24 h в инкубатор CO2 при 37 ° C.
2. LNA/ДНК transfection mixmer
- Обеспечение клеток confluency около 65-80% для оптимального трансфекции эффективности.
- Оттепель 10 мкм LNA/ДНК mixmers медленно на льду.
- В 1,5 мл Подготовьте 20 x mixmer решение, добавив mixmers сыворотки лишен средств массовой информации, так что окончательный объем достигает 50 мкл.
- Mix решение mixmer с 50 мкл сыворотки, лишенные средств массовой информации, содержащие 3% трансфекции реагента (соотношение 1:1).
- Инкубируйте 10 минут при комнатной температуре.
- Добавить 900 мкл сыворотки, лишенные средний с 5% FBS к каждой трубе.
- Аспирационная старых СМИ от плиты и заменить с 1 мл раствора mixmer LNA/ДНК, содержащие трансфекции реагента.
- Инкубируйте клетки за 24-48 ч при 37 ° C в инкубатор CO2 .
3. РНК добыча
- Удаление среды и добавьте 1 mL реагента тиоцианат фенол хлороформ Гуанидиновые к клеткам. Мыть нижней части хорошо несколько раз с Гуанидиновые тиоцианат фенол хлороформ и собрать его в 1,5 мл пробирок.
- Вихрь высокой скоростью 30 s и хранить при температуре-80 ° C для 1 h или на ночь.
- Оттепель образцов при комнатной температуре и вихревой хорошо.
- Добавить 200 мкл хлороформ, встряхнуть для 15 s и инкубации при комнатной температуре в течение 3 мин.
- Центрифуга на 12000 g x 15 мин при 4 ° C.
- Соберите Топ снимите водяной участок в новой трубки. Убедитесь в том избежать сбора любой из белого интерфаза формирует между фазами верхняя и Нижняя.
- Добавьте 500 мкл изопропиловый спирт и 1 мкл 8 мкг/мкл гликогена (класс РНК). Вортекс для 10 s и инкубации при комнатной температуре в течение 10 минут или при-20 ° C на ночь.
- Центрифуга на 12000 g x 10 мин при температуре 4 ° C и удалить все супернатант. В нижней части трубки образуют белые гранулы.
- Добавьте 1 mL холодной 75% этанола и центрифуги в 7500 g x 5 мин при 4 ° C.
- Удалите все этанола и сухие гранулы при комнатной температуре до тех пор, пока не этанола осталось в трубе.
- Растворяют гранулы в 30 мкл DNase/РНКазы свободной воды и проинкубируйте втечение 10 мин при 60 ° C.
- Измерение концентрации РНК с помощью спектрофотометра (на 260 Нм) и регулировка концентрации РНК до 50 нг/мкл.
4. один шаг RT-PCR измерить скорость включения экзона SMN2
- Mix 12,5 мкл 2 x буфер ПЦР-реакции, 1.0 мкл одношаговый RT-PCR фермент смесь, 0.5 мкл каждого праймера (SMN2 вперед: 5'-CTGCCTCCATTTCCTTCTG-3', SMN2 Реверс: 5'-TGGTGTCATTTAGTGCTGCTC-3', GAPDH вперед: 5'-TCCCTGAGCTGAACGGGAAG-3', GAPDH Реверс: 5'-GGAGGAGTTTGGTCGCTGT-3', 2 мкл всего РНК (50 нг/мкл), и 8,5 мкл РНКазы/DNase бесплатная дистиллированная вода.
- После того, как cDNA синтезируется в 50 ° C в течение 15 минут, начало реакции PCR. Усилить SMN2 экзона 6-8 с 30 циклов PCR (94 ° C 15 s, 60 ° C за 30 сек, 68 ° C 25 s). Усиливают GAPDH с 20 циклов PCR (94 ° C 15 s, 60 ° C за 30 сек, 68 ° C 20 s).
- Добавить 5 мкл 6 x загрузки красителя продукт PCR и загрузить 5 мкл смеси в 2% гель агарозы и запустить за 40 мин на 100 V.
- Изображение гель и проанализировать его с помощью ImageJ программного обеспечения.
- Измерьте интенсивность полноразмерных полосы и полосы Δ7. Рассчитать скорость экзона 7 Включение значение интенсивности (полнометражный) / (полнометражный + Δ7 SMN2).
5. Количественная ПЦР (ПЦР) для измерения дозы включение экзона SMN2
- Для синтеза cDNA, смешать 1 мкл Oligo dT, 1 мкл дНТФ 10 мм и 11 мкл суммарной РНК (50 нг/мкл). Инкубируйте на 65 ° C за 5 мин.
- Поместите образцы на льду и мкл 4 5 x буфер, 1 мкл 0,1 М DTT, 1 АБС битор РНКазы мкл и 1 мкл обратной транскриптазы для каждого образца.
- Инкубируйте на 50 ° C 60 мин и тепла до 80 ° C за 10 мин до остановки реакции. CDNA может храниться при температуре-20 ° C.
- Разбавьте cDNAs РНКазы свободной водой (разбавления 1:5). Микс 10 мкл 2 x SYBR зеленый ПЦР фермент смесь, 0,8 мкл 10 мкм грунтовка (полнометражный SMN2 вперед: 5 ' GCTATCATACTGGCTATTATATGGGTTTT-3′, полнометражные SMN2 Реверс: 5 ' CTCTATGCCAGCATTTCTCCTTAAT-3′, Δ7 SMN2 вперед: 5′ - TCTGGACCACCAATAATTCCCC-3′, Δ7 SMN2 Реверс: 5 ' ATGCCAGCATTTCCATATAATAGCC-3′, GAPDH вперед: 5 ' GCAAATTCCATGGCACCGT-3′, GAPDH обратный: 5 ' AGGGATCTCGCTCCTGGAA-3′), 3 мкл разбавленный cDNA и 5.4 мкл РНКазы свободной воды.
- Начало реакции ПЦР. Условия использования: 95 ° C за 30 s, а затем 40 цикл повторить на 95 ° C за 5 s и 60 ° C для 20 s.
- Рассчитать относительную выражение полнометражного SMN2 для GAPDH или Δ7 SMN2и нормализовать клетки лечение с помощью алгоритма ΔΔCt.
6. Западный blotting
- Удаление трансфекции среднего из клеток и промойте фосфат амортизированное saline (PBS) один раз.
- Добавьте 100 мкл буфера lysis с ингибитор протеазы.
- Отсоединить клетки от нижней части каждой скважины с помощью стерильных ячейки скребок и собирать в 1,5 мл пробирок. Проинкубируйте образцы на льду за 30 мин.
- Пройти ячейки lysate иглой 21 G 10 раз раздавить клетки.
- Центрифуга на 20 800 x g 15 мин при температуре 4 ° C и собирать супернатант в новый 1,5 мл пробирок. Образец может храниться в морозильник-80 ° С.
- Определять концентрацию протеина с помощью комплекта Assay протеина BCA и регулировка концентрации до 1,0 мкг/мкл.
- Mix 5 мкл образцов и 5 мкл 2 x натрия Додециловый сульфат (SDS) буфер образца (10% SDS; 14% 0,5 М трис-HCl раствор, рН 6,7; 0,5 М 1% ЭДТА 2На Стоковый раствор, рН 8,0; 20% глицерина; 0,004% бромфеноловый синий краситель, 5% β-меркаптоэтанол) и тепла при 70 ° C на 10 мин.
- Загрузить образцы в 4-12%, что гели бис-трис белка и бежать за 1 h 150 V.
- Замочите толстые фильтровальной бумаги в каждом буфере: (концентрированный Анодный буфер: 0,3 М трис-HCl, 20% метанола; Анодный буфер: 0,03 М трис-HCl, 20% метанола; катод буфера: 25 мм трис, 20% метанола, 40 мм 6-амино n капроновая кислота, 0,01% SDS).
- Замочите винилидена фторид (PVDF) мембраны в метаноле за 20 сек, затем передать его в анодном буфере.
- Сбалансировать гель после SDS-PAGE с катода буфер для 5-10 мин при агитации.
- Поместите фильтр документов, PVDF мембраны и гель на полусухой blotting машины, следующим: сосредоточены анод буфера бумага/анод буфера бумага/PVDF мембраны/белков гель/катод буфера бумаги (рис. 2).
- Обложка по стеку и начать передачу данных на 20 V за 30 мин.
- После передачи, промойте PVDF мембрану с PBST (PBS с 0,05% анимации 20) один раз.
- Блокировать мембраны при комнатной температуре в течение 30 мин в 5% обезжиренное молоко порошка растворяют в в PBST или на 4 ° C для ночлега.
- Разбавьте антитела анти SMN очищенный мыши и антитела анти Кофилин кролика мэм в 5% молоко сухое обезжиренное в PBST. Проинкубируйте мембрану в нем за 1 ч при комнатной температуре или при температуре 4 ° C на ночь.
- Промыть PBST 3 раза по 10 мин.
- Разбавьте вторичные антитела (HRP-конъюгированных коза анти мыши и кролика против IgG (H + L)) чтобы мэм в 5% молоко сухое обезжиренное в PBST. Инкубируйте 1 час при комнатной температуре в темноте.
- Промойте мембрану 3 раза с PBST за 10 мин.
- Обнаружить сигнал группы с помощью хемилюминесценции западных blotting обнаружения комплект.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
С помощью пациента фибробластов SMA, мы ориентированы регионе глушителя МКС-N1 в Интрон 7 SMN2 ген с восьми различных mixmers антисмысловых LNA/ДНК, которые были transfected в концентрации 5 Нм (рис. 3). Каждый из mixmers содержал измененный phosphorothioated позвоночника, которая позволяла бы им противостоять деградации нуклеиназы. Для оценки эффективности mixmers, скорость SMN2 экзона 7 включение было количественно RT-PCR и ПЦР с праймерами специфическими для SMN2. Включение эффективность экзона 7, варьировались от 78-98%, когда transfected с mixmers #1-5 в клетках больного (рис. 4, б), при этом трансфекции, используя mixmers #6-8 в той же дозе не приводили к любой значимой разницы по сравнению с элемент управления. Результаты, полученные от анализа ПЦР также отображается которые было значительно увеличено количество полнометражного SMN2 мРНК Стенограмма mixmers #1-3 и #5 лечения по сравнению с контролем (рис. 4c).
Кроме того, в результате Западный blotting показал что трансфекции, используя mixmers #1-5 включено более высоких уровней SMN белка выражения в пациента фибробластов (в 1.5 - 1.9-fold увеличение от элемента управления, рис. 5). Процедуры с использованием mixmers #6-8 не привели к изменениям в уровне выражения SMN белка в клетках. Эти данные показывают, что трансфекции LNA/ДНК mixmers #1-5 стимулирует экзона 7 Включение SMN2 эффективно в пациента фибробластов SMA.
Рисунок 1 : Antisense опосредованной экзона включения стратегии для лечения SMA. (a) C-к Т переходной экзона 7 SMN2 приводит к пропуск экзона 7 примерно в 90% SMN2 стенограмм. Эти стенограммы вне кадра и быстро деградируют в клетках. Антисмысловые олигонуклеотиды (AONs) связывают intronic сращивания глушителя N1 (МКС-N1), который стимулирует экзона включение в SMN2. Экзона 7 включены SMN2 мРНК может производить функционального белка SMN. (b) химические структуры РНК и phosphorothioated LNA. Весь магистральных mixmers, которую мы использовали в этой статье являются phosphorothioated для предотвращения деградации. Эта цифра была изменена с Touznik et.al. 13. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Метод полусухое передачи для западный blotting. Толстые фильтровальной бумаги, пропитанной сосредоточены (Con.) анодном буфере, Толщина фильтровальной бумаги, смоченной в анодном буфере, PVDF мембрану, гель и толстые фильтровальной бумаги, пропитанной катод буфера укладываются между двумя пластинами, полусухое blotting машины. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : LNA/ДНК mixmer последовательности для включения SMN2 экзона 7. ДНК база: G, A, T, C. LNA база (красный): + G, A, T + C. Phosphorothioated ДНК базы: G *, A *, Т *, C *. База Phosphorothioated LNA (красный): + G *, A *, + T *, + C *. Эта цифра воспроизводится от Touznik et.al. 13. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Представитель результаты RT-PCR и ПЦР для оценки эффективности LNA/ДНК mixmers. Transfection mixmers #1-5 приводит к SMN2 экзона 7 Включение значительно более высокими темпами, чем макет transfection. ()-ПЦР SMN2 и GAPDH в пациента фибробластов SMA после трансфекции в концентрации 5 Нм. Верхняя полоса: экзона 7 включены полноразмерные SMN2 мРНК. Нижняя полоса: экзона 7-исключены SMN2 мРНК. (b) количественный анализ SMN2 экзона 7 включение в с помощью ПЦР-фибробластов SMA mixmer лечение. (c) относительное выражение анализ полнометражного SMN2 для GAPDH измеряется с помощью ПЦР. Данные были нормализованы в клетки-лечение управления. Планки погрешностей представляют собой среднее ± стандартное отклонение (три независимых экспериментов). Односторонний дисперсионный анализ с Дуннетт множественные сравнения было испытание. M: макет элемента управления, NT: не лечить, H: здорового управления фибробластов клетки, B: пустым. Эта цифра воспроизводится от Touznik et.al. 13. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 : Представитель результаты Западный blotting для оценки выражения белка SMN. Трансфекция LNA/ДНК mixmers увеличивает производство белка SMN. (a) Западный blotting SMN и Кофилин (контроля загрузки) здоровых и mixmer лечить пациента фибробластов SMA. (b) раз увеличение уровней SMN белка mixmer лечение фибробластов SMA. Transfection mixmers #1-5 на 5 Нм концентрации значительно увеличивает производство белков SMN. Данные были нормализованы соотношение SMN/Кофилин в-лечение фибробластов SMA. Бары представляют собой среднее ± стандартное отклонение (четыре независимых экспериментов). Односторонний дисперсионный анализ с Дуннетт множественные сравнения было испытание. M: макет элемента управления, NT: не лечить. Эта цифра воспроизводится от Touznik et.al. 13. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В vitro оценки метода, описанного здесь быстро, легко и достаточно чувствительным для тестирования различных AONs. Этот протокол является широко применимые к экзона пропуск и включение других генов и различных типов клеток. Кроме того большинство AON химия (за исключением PMOs) может transfected с помощью этого метода. AONs может регулировать сплайсинга пре-мРНК как внутреннего, так и искусственно введены гены и может быть совместно transfected с векторы плазмиды, нося целевых генов.
Важнейшим шагом этого метода является, что confluency клетки должен быть около 65-80% при AONs transfected в фибробластов. Это условие может быть различным для других типов клеток. Лучшая концентрация AONs для transfection может быть также различным (0,5 - 100 Нм), в зависимости от целевой последовательности и типы клеток.
Этот метод не является без потенциальные ловушки. Например эффективность mixmers определяется последовательности mixmers и состав LNA/ДНК. Для МКС-N1 mixmer, который состоит из МШУ с заменой для МШУ в каждой третьей позиции нуклеотидов ДНК, был более эффективным, чем mixmer с последовательностью эквивалентный с замещением ДНК на всех других нуклеотидов или все LNA олигонуклеотида13 . Однако это может отличаться для других целевых последовательностей. Таким образом это необходимо для оптимизации последовательности LNA/ДНК mixmers и оценить эффективность mixmers уровня РНК, прежде чем идти дальше. Весь магистральных mixmers должно быть phosphorothioated для предотвращения деградации. Кроме того, хотя этот lipotransfection опосредованной transfection метод может использоваться для большинства AON химия, он не может использоваться для заряда нейтральных phosphorodiamidate Морфолино олигомеров (PMOs), так как lipotransfection требует отрицательно заряженные олигонуклеотидов. Для методов трансфекции PMO увидите в других местах23,24,25.
Хотя этот метод полезен для тестирования Роман AONs, модель клетки фибробластов SMA не пилки в vivo условий во всей его полноте. Животные модели может служить важным источником для тестирования в естественных условиях эффективность и безопасность26.
Для пропуска экзона/включения PMO и модификация 2′-O-метоксиэтиловый (2' МО) может использоваться вместо LNA/ДНК mixmers27,28. Однако оптимальная концентрация этих химия для transfection, обычно гораздо выше29,30. Из-за лучшую эффективность по сравнению с другими антисмысловых химия использование LNA/ДНК, на основе mixmer антисмысловых олигонуклеотидов может быть привлекательным терапевтические стратегии для лечения сплайсинга дефекты, вызванные генетических заболеваний в будущем.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы благодарят Николь Макрори за помощь с экспериментов. Эта работа была поддержана университета Альберты факультета медицины и стоматологии, Slipchuk SMA исследований фонда исследовательский грант, канадский институтов здравоохранения исследований (КНИИЗ), друзей Гарретт Камминг исследований фонды, HM Toupin неврологические Научно исследовательские фонды, мышечная дистрофия Канада, Канадский фонд для инноваций, Альберта предприятия и высшего образования, женщин и детей в области здравоохранения научно-исследовательский институт (WCHRI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SMA Fibroblasts | Coriell NIGMS human genetic cell repository | GM03813 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher | 11320033 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F1051 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher | 25300062 | |
| Serum-deprived media | Thermo Fisher | 31985070 | |
| Transfection reagent | Thermo Fisher | 15338100 | |
| guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform (TRIzol) | Thermo Fisher | 15596-018 | |
| RT-PCR Primers | Sequence 5' to 3' | ||
| SMN2 forward: | CTGCCTCCATTTCCTTCTG | ||
| SMN2 reverse: | TGGTGTCATTTAGTGCTGCTC | ||
| GAPDH forward: | TCCCTGAGCTGAACGGGAAG | ||
| GAPDH reverse: | GGAGGAGTTTGGTCGCTGT | ||
| qPCR Primers | |||
| full-length SMN2 forward: | GCTATCATACTGGCTATTATATGGGTTTT | ||
| full-length SMN2 reverse: | CTCTATGCCAGCATTTCTCCTTAAT | ||
| GAPDH forward: | GCAAATTCCATGGCACCGT | ||
| GAPDH reverse: | AGGGATCTCGCTCCTGGAA | ||
| Chloroform | Sigma-Aldrich | P3803 | |
| Glycogen, RNA grade | Thermo Fisher | R0551 | |
| ImageJ Software | |||
| Protease cocktail inhibitor | Roche | 11836153001 | |
| Cathode Buffer | 0.025 M Tris base + 40 mM 6-aminocaproic acid + 20% Methanol | ||
| Anode Buffer | 0.03 M Tris Base + 20% Methanol | ||
| Concentred Anode Buffer | 0.3 M Tris base + 20% Methanol | ||
| Beta Mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | |
| PVDF membrane | GE | 10600021 | |
| Loading/sample buffer for Western blotting | NuPage Invitrogen | NP007 | |
| One-Step RT-PCR kit | Qiagen | 210210 | |
| dNTPs | Clontech | 3040 |
References
- Iascone, D. M., Henderson, C. E., Lee, J. C. Spinal muscular atrophy: from tissue specificity to therapeutic strategies. F1000Prime Rep. 7, 4 (2015).
- Touznik, A., Lee, J. J., Yokota, T. New developments in exon skipping and splice modulation therapies for neuromuscular diseases. Expert Opin Biol Ther. 14 (6), 809-819 (2014).
- Lefebvre, S., et al. Identification and Characterization of a Spinal Muscular Atrophy-Determining Gene. Cell. 80 (1), 155-165 (1995).
- Lorson, C. L., Hahnen, E., Androphy, E. J., Wirth, B. A single nucleotide in the SMN gene regulates splicing and is responsible for spinal muscular atrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (11), 6307-6311 (1999).
- Monani, U. R., et al. A single nucleotide difference that alters splicing patterns distinguishes the SMA gene SMN1 from the copy gene SMN2. Hum Mol Genet. 8 (7), 1177-1183 (1999).
- Lee, J. J., Yokota, T. Antisense therapy in neurology. J Pers Med. 3 (3), 144-176 (2013).
- Aartsma-Rus, A. FDA Approval of Nusinersen for Spinal Muscular Atrophy Makes 2016 the Year of Splice Modulating Oligonucleotides. Nucleic Acid Ther. 27 (2), 67-69 (2017).
- Hua, Y., et al. Peripheral SMN restoration is essential for long-term rescue of a severe spinal muscular atrophy mouse model. Nature. 478 (7367), 123-126 (2011).
- Hua, Y., Vickers, T. A., Baker, B. F., Bennett, C. F., Krainer, A. R. Enhancement of SMN2 exon 7 inclusion by antisense oligonucleotides targeting the exon. PLoS Biol. 5 (4), 73 (2007).
- Passini, M. A., et al. Antisense oligonucleotides delivered to the mouse CNS ameliorate symptoms of severe spinal muscular atrophy. Sci Transl Med. 3 (72), (2011).
- Hammond, S. M., et al. Systemic peptide-mediated oligonucleotide therapy improves long-term survival in spinal muscular atrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (39), 10962-10967 (2016).
- Porensky, P. N., et al. A single administration of morpholino antisense oligomer rescues spinal muscular atrophy in mouse. Hum Mol Genet. 21 (7), 1625-1638 (2012).
- Touznik, A., Maruyama, R., Hosoki, K., Echigoya, Y., Yokota, T. LNA/DNA mixmer-based antisense oligonucleotides correct alternative splicing of the SMN2 gene and restore SMN protein expression in type 1 SMA fibroblasts. Sci Rep. 7 (1), 3672 (2017).
- Obika, S., et al. Synthesis of 2'-O,4'-C-methyleneuridine and -cytidine. Novel bicyclic nucleosides having a fixed C-3,-endo sugar puckering. Tetrahedron Letters. 38 (50), 8735-8738 (1997).
- Singh, S. K., Nielsen, P., Koshkin, A. A., Wengel, J. LNA (locked nucleic acids): synthesis and high-affinity nucleic acid recognition. Chemical Communications. (4), 455-456 (1998).
- Navarro, E., Serrano-Heras, G., Castano, M. J., Solera, J. Real-time PCR detection chemistry. Clin Chim Acta. 439, 231-250 (2015).
- Urbanek, M. O., Nawrocka, A. U., Krzyzosiak, W. J. Small RNA Detection by in Situ Hybridization Methods. Int J Mol Sci. 16 (6), 13259-13286 (2015).
- Wahlestedt, C., et al. Potent and nontoxic antisense oligonucleotides containing locked nucleic acids. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (10), 5633-5638 (2000).
- Rupaimoole, R., Slack, F. J. MicroRNA therapeutics: towards a new era for the management of cancer and other diseases. Nat Rev Drug Discov. 16 (3), 203-222 (2017).
- Lanford, R. E., et al. Therapeutic silencing of microRNA-122 in primates with chronic hepatitis C virus infection. Science. 327 (5962), 198-201 (2010).
- Shimo, T., Maruyama, R., Yokota, T. Designing Effective Antisense Oligonucleotides for Exon Skipping. Methods Mol Biol. 1687, 143-155 (2018).
- Shimo, T., et al. Design and evaluation of locked nucleic acid-based splice-switching oligonucleotides in vitro. Nucleic Acids Res. 42 (12), 8174-8187 (2014).
- Nguyen, Q., Yokota, T. Immortalized Muscle Cell Model to Test the Exon Skipping Efficacy for Duchenne Muscular Dystrophy. J. Pers. Med. 7 (4), 13 (2017).
- Echigoya, Y., et al. Quantitative Antisense Screening and Optimization for Exon 51 Skipping in Duchenne Muscular Dystrophy. Mol Ther. , (2017).
- Saito, T., et al. Antisense PMO found in dystrophic dog model was effective in cells from exon 7-deleted DMD patient. PLoS One. 5 (8), 12239 (2010).
- Donnelly, E. M., et al. Characterization of a murine model of SMA. Neurobiol Dis. 45 (3), 992-998 (2012).
- Lim, K. R., Maruyama, R., Yokota, T. Eteplirsen in the treatment of Duchenne muscular dystrophy. Drug Des Devel Ther. 11, 533-545 (2017).
- Paton, D. M. Nusinersen: antisense oligonucleotide to increase SMN protein production in spinal muscular atrophy. Drugs Today (Barc). 53 (6), 327-337 (2017).
- Prakash, T. P., et al. Comparing in vitro and in vivo activity of 2'-O-[2-(methylamino)-2-oxoethyl]- and 2'-O-methoxyethyl-modified antisense oligonucleotides. J Med Chem. 51 (9), 2766-2776 (2008).
- Aoki, Y., et al. Bodywide skipping of exons 45-55 in dystrophic mdx52 mice by systemic antisense delivery. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (34), 13763-13768 (2012).
