Summary
Oligonucleotides antisense שונים (AONs) הוכחו לגרום אקסון הכללה (splice אפנון) והצלה SMN ביטוי עבור ניוון שרירי עמוד השדרה (SMA). כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור און lipotransfection לזירוז אקסון להיכלל הגן SMN2 ואת שיטות ההערכה כדי לקבוע את יעילות fibroblasts חולה SMA.
Abstract
ניוון שרירי עמוד השדרה (SMA), מחלה נוירולוגית קטלנית הנגרמת על ידי האובדן של SMN1, מציג מקרה מיוחד בשטח של oligonucleotide antisense (און)-מתווכת טיפול. בעוד SMN1 מוטציות אחראים על המחלה, AONs מיקוד אחוי intronic משתיק (ISS) באתרים SMN2, כולל שאושרו על-ידי ה-FDA nusinersen, הוכחו לשחזר SMN ביטוי, דהוא הסימפטומים. כיום, מחקרים רבים שכללו טיפול און עבור SMA מתמקדים חוקרים הרומן בדיקות, הביוכימיה און מיקוד SMN2 שעשויים להיות יותר יעיל ופחות רעיל יותר nusinersen. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול להערכה במבחנה של הכללה אקסון באמצעות lipotransfection של AONs ואחריו תגובת שרשרת של פולימראז שעתוק במהופך (RT-PCR), תגובת שרשרת של פולימראז כמותית (qPCR), סופג המערבי. שיטה זו יכולה להיות מועסק עבור סוגים שונים של בדיקות, הביוכימיה און. באמצעות שיטה זו, נדגים כי AONs המורכבת לסירוגין חומצות גרעין נעול (LNAs), ה-DNA נוקלאוטידים (מגבר קדם/DNA mixmers) להוביל יעיל SMN2 אקסון הכללה ושיקום של חלבון SMN-ריכוז נמוך מאוד, ולכן, מגבר קדם / מבוסס על mixmer oligonucleotides antisense דנ א ייתכן אסטרטגיית טיפולית אטרקטיבי לטיפול splicing ליקויים שנגרמו על ידי מחלות גנטיות. במבחנה הערכה השיטה המתוארת כאן היא מהירה, קלה, רגישים מספיק לבדיקה של AONs רומן שונים.
Introduction
ניוון שרירי עמוד השדרה (SMA) היא הפרעה neuromuscular קטלנית ירש בדוגמת הקרים autosomal. הוא מאופיין על ידי השפלה מוטורי לגלוקוז ואת תא המטען מתקדמת איבר שריר שיתוק1,2. רוב המופעים SMA הם עקב מוטציה homozygous של ג'ין ההישרדות של נוירון מוטורי 1 (SMN1)3. הגן ההישרדות של נוירון מוטורי 2 (SMN2) שכפול ההופכי של SMN1, יש רצף כמעט זהות שונות על ידי רק חמישה בסיסים4,5. מעבר C-ל-T ב- SMN2 ממוקם אקסון 7 הופך את הגן מתפקד כמעט כי המוטציה שמוביל חיוניות אקסון 7 מורחק כמעט 90% של SMN2 תעתיקים (איור 1). MRNAs SMN2 חסר אקסון 7 לא יכול לפצות על הפונקציה SMN1 כי המוצר שלה חלבון אינו יציב, יורד במהירות.
טיפול antisense הפך לאחרונה אסטרטגיה מבטיח מאוד לטיפול SMA6. האישור האחרון של nusinersen על ידי מינהל המזון והתרופות האמריקני (FDA) זמין זה התרופה הראשונה לטיפול SMA7. Nusinersen הוא 18-מר antisense oligonucleotide (און) עם שינוי 2 ′-O-methoxyethyl (מו), עמוד השדרה phosphorothioate. התרופה מטרות משתיק הקול splicing intronic N1 (ISS-N1) ממוקם באינטרון 7 של הגן SMN2 . איגוד של nusinersen ל ISS-N1 מקדמת את ההתאוששות של ביטוי חלבון SMN באורך מלא תפקודית מ הגן SMN2 אנדוגני ע י שימוש אקסון 7 הכללה (איור 1)8,9,10 . כיום, מחקרים רבים שכללו טיפול און עבור SMA מתמקדים חוקרים בדיקות הרומן און, הביוכימיה שעשויים להיות יותר יעיל ופחות רעיל יותר nusinersen. הוכח כי AONs עם בדיקות אחרות, הביוכימיה זירוז גם ביעילות אקסון להיכלל SMN2 אקסון 7 גם במבחנה וגם ויוו11,12,13.
חומצות גרעין נעול (LNAs) הם תחליפי RNA ששונו כימית המכילה גשר מתילן חיבור 4 ′ -פחמן עם 2 ′ -חמצן בתוך ה furanose14,של המבנה (איור 1b)15. בהשוואה DNAs או RNAs, LNAs שיש להם זיקה מוגברת מחייב רצפי RNA משלים, יש יתרון נוסף של להיות עמידים מאוד בפני nucleases אנדוגני. מגבר קדם הכימיה הוחל לשימוש כמו הגששים של קרינה פלואורסצנטית בחיי עיר הכלאה (דג),16,qPCR17. בנוסף, זה מנוצל להסדיר ביטוי גנים גם במבחנה וגם בתוך vivo. GapmeR AONs הם שילוב של מולקולות דנ א חד גדילי ולצדו מספר LNAs בקצוות יונקות ו- 3′. הם להפיל את ביטוי גנים על-ידי איגוד משלים mRNAs יישוב, גורם להם להיות מושפל על ידי RNase H מופעל18. מגבר קדם/DNA mixmers הם AONs אשר מורכבים של נוקלאוטידים DNA משולב בין LNAs. הציג בכיוון זה הם יכולים לאגד miRNA כדי לעכב את הפונקציה (מגבר קדם-antimiR)19. מגבר קדם-antimiRs כמה הגיעו הפיתוח הקליני. לקבלת דוגמאות, miravirsen (AntimiR-122) מגבר קדם-antimiR המעכב מיר-122 לטיפול הפטיטיס C זיהום, מספר מחקרים קליניים בשלב II נמצאים כרגע מתמשך19,20. . לאחרונה, זה הוכח כי מגבר קדם/DNA mixmers יכול גם לווסת RNA שחבור21. זה ניתן לאגד רצף מסוים של mRNA, זירוז אקסון דילוג ב- mRNA הדיסטרופין הכללה אקסון SMN2 mRNA במבחנה13,22.
במאמר זה, אנחנו חלוקה לרמות מתודולוגיה אינדוקציה של הכללה אקסון באמצעות AONs והערכת יעילות ברמות ה-RNA וחלבון. לצורך המחשה בשיטה זו, השתמשנו את mixmers מגבר קדם/DNA פילוח ISS-N1 אינטרון 7 של SMN2. AONs transfected לתאים חולה SMA מאת lipotransfection המושרה אקסון 7 להיכלל התעתיק SMN2 הסופי של קולטנים upregulation לייצור חלבון SMN. אחד היתרונות של שימוש מגבר קדם/DNA mixmers לזירוז ההכללה אקסון הוא ריכוז אפקטיבי עבור תרביות תאים הוא נמוך באופן משמעותי אחר בדיקות, הביוכימיה13. שיטה זו יכולה לשמש עבור רבים AONs אחרים חוץ oligomers מורפולינו phosphorodiamidate (PMOs), אשר, עקב תשלום נייטרלי שלהם, צריך להזין את התאים דרך אנדוציטוזה שנגזרות הכימית תרביות תאים שותף אנדו-פורטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. תרבית תאים
- תרבות SMA fibroblasts החולה במצע הגידול (של Dulbecco שונה נשר בינוני 1: 1 F-12 (Ham) עם 10% סרום שור עוברית (FBS) ו- 0.5% פניצילין/סטרפטומיצין) ב חממה2 CO ב 37 º C.
- לקבוע ריכוז התא באמצעות מונה הניתן תא אוטומטיות, לדלל לתאים עונה 1 פרק 105 תאים למ"ל מדיום הגידול, ואז הזרעים בצלחת המתאימה. השתמש. ובכן 12 צלחות (1 מ"ל לכל טוב) RT-PCR או qPCR.
- דגירה הצלחות במשך 24 שעות ביממה ב חממה2 CO ב 37 º C.
2. מגבר קדם/DNA mixmer תרביות תאים
- ודא תא confluency בסביבות 65-80% ליעילות מיטבית תרביות תאים.
- הפשרת 10 mixmers מגבר קדם/DNA μM לאט על קרח.
- צינור 1.5-mL, להכין פתרון x mixmer 20 על-ידי הוספת mixmers את הפרעות-סרום המדיה כך שעוצמת הסופי מגיע 50 μL.
- מערבבים את הפתרון mixmer עם 50 μL של התקשורת הפרעות-סרום המכיל 3% תקנים ריאגנט (יחס 1:1).
- תקופת דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- הוסף 900 μL הפרעות-סרום בינוני עם 5% FBS כדי כל שפופרת.
- האחות המדיה הישנה מהצלחת והחלף 1 מ"ל מגבר קדם/DNA mixmer לאודנום הכימית תרביות תאים.
- דגירה את התאים עבור h 24-48-37 מעלות צלזיוס חממה2 CO.
3. RNA החילוץ
- להסיר את המדיום ולהוסיף 1 מ"ל של guanidinium thiocyanate-פנול-כלורופורם ריאגנט לתאים. לשטוף בתחתית במועדים טוב עם guanidinium thiocyanate-פנול-כלורופורם ולאסוף אותו לתוך צינורות 1.5-mL.
- מערבולת במהירות גבוהה עבור 30 s ומאגר ב- 80 ° C 1 h או לילה.
- להפשיר את הדגימות בטמפרטורת החדר ו מערבולת היטב.
- להוסיף 200 µL כלורופורם, לנער נמרצות 15 s, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 3 דקות.
- צנטריפוגה ב 12,000 x g למשך 15 דקות ב 4 º C.
- לאסוף פזה מימית ברור בראש לתוך צינור חדש. הקפד להימנע איסוף מכל לאטמוספרה לבן המהווה בין השלבים העליונים והתחתונים.
- להוסיף 500 אלכוהול איזופרופיל µL, 1 µL 8 µg/µL גליקוגן (כיתה ה-RNA). מערבולת 10 s דגירה בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות או ב-20 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- צנטריפוגה ב g x 12,000 10 דקות ב 4 ° C, להסיר את כל תגובת שיקוע. גלולה לבנה יהוו בתחתית הצינורית.
- להוסיף 1 מ"ל אתנול 75% קר, צנטריפוגה-7,500 g x עבור 5 דקות ב 4 º C.
- להסיר כל האתנול ויבש בגדר בטמפרטורת החדר עד אין אתנול שנשאר בצינור.
- להמיס בגדר במים 30 µL DNase/RNase חינם ולאחר תקופת דגירה של 10 דקות ב 60 מעלות צלזיוס.
- למדוד את ריכוז ה-RNA באמצעות ספקטרופוטומטרים (ב-260 nm), ולהתאים את ריכוז ה-RNA 50 ng/µL.
4. צעד RT-PCR כדי למדוד את קצב הכללה אקסון של SMN2
- µL 12.5 שילוב של 2 x RT-PCR התגובה מאגר, µL 1.0 של האנזים RT-PCR בשלב אחד לערבב, 0.5 µL של כל פריימר (SMN2 קדימה: 5'-CTGCCTCCATTTCCTTCTG-3', SMN2 הפוכה: 5'-TGGTGTCATTTAGTGCTGCTC-3', GAPDH קדימה: 5'-TCCCTGAGCTGAACGGGAAG-3', GAPDH הפוכה: 5'-GGAGGAGTTTGGTCGCTGT-3', 2 µL של RNA סה כ (50 ng/µL), ו- 8.5 µL של RNase/DNase ללא מים מזוקקים.
- אחרי cDNA הוא מסונתז ב 50 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, להתחיל את תגובת ה-PCR. להגביר את אקסון SMN2 6-8 עם מחזורים PCR (94 ° C 15 s, 60 ° C ל 30 s, 68 ° C עבור 25 s). להגביר את GAPDH עם 20 מחזורים PCR (94 ° C 15 s, 60 ° C ל 30 s, 68 ° C עבור 20 s).
- להוסיף 5 μL 6 x בטעינת צבע למוצר ה-PCR, טען µL 5 של התערובת 2% agarose ג'ל ו לרוץ במשך 40 דקות ב- 100 וולט.
- תמונה הג'ל ולנתח אותו באמצעות תוכנת ImageJ.
- למדוד את עוצמת באורך מלא להקות ולהקות Δ7. לחשב את הקצב של אקסון 7 הכללה לפי הערך בעוצמה של (באורך מלא) / (באורך מלא + Δ7 SMN2).
5. כמותיים PCR (qPCR) כדי למדוד את קצב הכללה אקסון של SMN2
- עבור cDNA סינתזה, לערבב 1 µL Oligo dT, dNTPs 1 של 10 מ מ µL, 11 µL סה כ RNA (50 ng/µL). דגירה-65 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
- למקם את הדגימות הקרח ולהוסיף 4 µL 5 x מאגר, 1 µL 0.1 M DTT, מעכב RNase µL 1 ו- 1 µL רוורס טרנסקריפטאז כל דגימה.
- דגירה ב 50 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות, מחממים עד 80 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לעצור את התגובה. ניתן לאחסן את cDNA ב-20 ° C.
- לדלל את cDNAs במים נטולי RNase (דילול 1:5). מיקס 10 µL 2 x SYBR Green qPCR האנזים מיקס, 0.8 µL 10 מיקרומטר פריימר (באורך מלא SMN2 קדימה: הפוך SMN2 יונקות-GCTATCATACTGGCTATTATATGGGTTTT-3′, באורך מלא: יונקות-CTCTATGCCAGCATTTCTCCTTAAT-3′, Δ7, SMN2 קדימה: יונקות - TCTGGACCACCAATAATTCCCC-3′, Δ7 SMN2 הפוכה: יונקות-ATGCCAGCATTTCCATATAATAGCC-3′, GAPDH קדימה: יונקות-GCAAATTCCATGGCACCGT-3′, GAPDH הפוכה: יונקות-AGGGATCTCGCTCCTGGAA-3′), cDNA µL מדולל 3, 5.4 µL RNase ללא מים.
- להתחיל את התגובה qPCR. להשתמש בתנאי: 95 ° C ל 30 s ולאחר מכן מחזור 40 חוזרות 95 ° C עבור 5 s ו- 60 ° C עבור 20 s.
- לחשב את הביטוי היחסי של באורך מלא SMN2 כדי GAPDH או Δ7 SMN2, לנרמל את התאים שאינם מטופלים עם האלגוריתם ΔΔCt.
6. המערבי סופג
- הסר בינוני תרביות תאים מתאי ולשטוף בתמיסת באגירה פוספט (PBS) פעם אחת.
- להוסיף 100 מאגר פירוק µL עם מעכב פרוטאז.
- ניתוק התאים מהחלק התחתון של כל טוב להשתמש במגרדת תא סטרילי ולאחר לאסוף לתוך צינורות 1.5-mL. דגירה בדגימות על קרח למשך 30 דקות.
- עוברים תא lysate המחט 21-G 10 פעמים כדי למחוץ את התאים.
- צנטריפוגה ב g x 20,800 למשך 15 דקות ב 4 ° C, לאסוף את תגובת שיקוע לתוך צינורות 1.5-mL החדש. לדוגמה ניתן לאחסן במקפיא עמוק-80 ° C.
- לקבוע ריכוז חלבון באמצעות ערכת וזמינותו של חלבון BCA, והתאם את ריכוז µg 1.0/µL.
- מיקס 5 5 µL 2 x dodecyl נתרן גופרתי (מרחביות) מדגם מאגר ודוגמאות µL (10% מרחביות; 14% 0.5M HCl-טריס פתרון, pH 6.7; פתרון מניות של EDTA-2Na 0.5M של 1%, pH 8.0; 20% גליצרול; צבע כחול bromophenol 0.004%, 5% β-mercaptoethanol) חום -70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
- טען את הדגימות % 4-12 שג ' לים Bis-טריס חלבון ולרוץ 1 h ב-150 V.
- להשרות נייר סינון עבה בכל מאגר: (אנודת מרוכז מאגר: 0.3 M טריס-HCl, 20% מתנול; אנודת מאגר: 0.03 מ' טריס-HCl, 20% מתנול; קטודית מאגר: 25 מ מ טריס, 20% מתנול, 40 מ מ 6-אמינו-n-hexanoic חומצה, 0.01% מרחביות).
- להשרות קרום difluoride (PVDF) polyvinylidene מתנול עבור 20 s, ואז להעביר אותו למאגר אנודת.
- Equilibrate את הג'ל אחרי מרחביות-דף עם המאגר קטודית למשך 5-10 דקות תחת עצבנות.
- למקם את הניירות מסנן, PVDF ממברנות, הג'ל על חצי יבש blotting מכונה, כדלקמן: מרוכז אנודת מאגר נייר/אנודת מאגר נייר/PVDF חלבון ממברנלי/ג'ל/קטודית מאגר נייר (איור 2).
- לכסות את המחסנית ולהתחיל את העברת בגיל 20 V למשך 30 דקות.
- לאחר המעבר, לשטוף את הקרום PVDF עם PBST (PBS עם 0.05% Tween 20) ברגע.
- לחסום את הקרום בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות 5% אבקת חלב רזה מומס ב- PBST או ב 4 ° C נלון.
- לדלל עם נוגדן anti-SMN העכבר מטוהרים, נוגדן anti-Cofilin של הארנב כדי 1:10,000 5% אבקת חלב רזה ב- PBST. דגירה קרום זה לשעה בטמפרטורת החדר או ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- לשטוף 3 פעמים עם PBST למשך 10 דקות.
- לדלל נוגדנים משניים (עז מצומדת HRP אנטי עכבר, ארנב אנטי איג (H + L)) כדי 1:10,000 אבקת חלב רזה 5% ב- PBST. תקופת דגירה של h 1 בטמפרטורת החדר בחושך.
- לשטוף את הקרום 3 פעמים עם PBST למשך 10 דקות.
- לזהות את האות הלהקה באמצעות chemiluminescence את ערכת זיהוי סופג המערבי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
באמצעות fibroblasts חולה SMA, שסימנו האזור משתיק ISS-N1 אינטרון 7 של הגן SMN2 עם שמונה שונים antisense מגבר קדם/DNA mixmers זה היו transfected ב 5 nM ריכוז (איור 3). כל אחד mixmers הכילה שדרה phosphorothioated ששונה שאיפשר להם להתנגד נוקלאז השפלה. כדי להעריך את היעילות של mixmers, הקצב של אקסון SMN2 הכללה 7 הייתה לכמת מאת RT-PCR ו- qPCR באמצעות תחל ספיציפית SMN2. היעילות הכללה של אקסון 7 נע בין 78-98% כאשר transfected עם mixmers #1-5 בתאי החולה (איור 4א, ב), תוך ניצול mixmers #6-8 במינון זהה תרביות תאים לא לגרום כל הבדל משמעותי בהשוואה הפקד. התוצאות שהתקבלו ניתוח qPCR מוצגים גם זה הכמות של התעתיק SMN2 mRNA באורך מלא היה משמעותי מוגברת על ידי את mixmers #1-3 וטיפולים #5 בהשוואה הפקד (איור 4c).
בנוסף, התוצאה של המערב סופג הראו הזה תרביות תאים באמצעות mixmers #1-5 מופעל רמות גבוהות יותר של ביטוי חלבון SMN החולה fibroblasts (1.5 - עלייה 1.9-fold מהפקד, איור 5). הטיפולים באמצעות mixmers #6-8 לא לגרום שינוי רמת ביטוי חלבון SMN בתאים. נתונים אלה מדגימים את תרביות תאים של מגבר קדם/DNA mixmers #1-5 המניע את הכללת אקסון 7 SMN2 ביעילות ב SMA fibroblasts החולה.
איור 1 : אקסון בתיווך antisense אסטרטגיה הכללת לטיפול SMA. (א) מעבר C-ל-T ב אקסון 7 SMN2 שמוביל דילוג של אקסון 7 כ 90% של תעתיקים SMN2 . התעתיקים הללו מחוץ לתמונה, אתה יורד במהירות בתאים. Antisense oligonucleotides (AONs) לאגד משתיק הקול splicing intronic N1 (ISS-N1), אשר גורם אקסון להיכלל SMN2. אקסון 7 כלול mRNAs SMN2 יכול לייצר חלבון SMN פונקציונלי. (b) מבנה כימי של RNA ו- phosphorothioated מגבר קדם. התווך שלם של mixmers שהיינו במאמר זה הם phosphorothioated כדי למנוע השפלה. דמות זו שונתה מן Touznik et.al. 13. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : שיטת העברה חצי יבש עבור סופג המערבי. נייר סינון עבה טבולים מרוכז מאגר אנודת (מנהלים), נייר סינון עבה טבולים אנודת מאגר, קרום PVDF, ג'ל, נייר סינון עבה טבולים קטודית מאגר נערמים בין שתי צלחות של מכונה blotting חצי יבש. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : מגבר קדם/DNA רצף mixmer להכללה אקסון 7 SMN2. בסיס DNA: G, A, T, C. מגבר קדם בסיס (אדום): + G, + A, T, + + C. Phosphorothioated דנ א הבסיס: G * A *, T *, C *. מגבר קדם Phosphorothioated בסיס (אדום): G *, + A *, + T *, + + C *. איור זה המופקת מן Touznik et.al. 13. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : תוצאות נציג של RT-PCR qPCR כדי להעריך את היעילות של mixmers מגבר קדם/אן. תרביות תאים של mixmers #1-5 מוביל SMN2 הכללה אקסון 7-שיעור גבוה משמעותית מאשר תרביות תאים מעושה. () RT-PCR של SMN2 ו GAPDH ב SMA fibroblasts החולה בעקבות תרביות תאים ב 5 nM ריכוז. הלהקה העליון: אקסון 7 כלול mRNA SMN2 באורך מלא. הלהקה התחתון: אקסון 7-לא נכלל mRNA SMN2. (b) אנליזה כמותית של SMN2 אקסון 7 להיכלל fibroblasts SMA mixmer שטופלו באמצעות RT-PCR. (ג) ביטוי יחסי ניתוח של באורך מלא SMN2 כדי GAPDH נמדד באמצעות qPCR. הנתונים היו מנורמל לתאי בקרה שאינם מטופלים. קווי שגיאה לייצג זאת אומרת ± סטיית התקן (3 ניסויים עצמאית). חד-כיווני אנובה עם מבחן השוואה מרובים של Dunnett בוצעה. מ: רכיסה ללעוג שליטה, NT: שאינם מטופלים, ח': בקרה בריאים פיברובלסט תאי, b: ריק. איור זה המופקת מן Touznik et.al. 13. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 : תוצאות נציג סופג המערבי כדי למדוד את ביטוי חלבון SMN. תרביות תאים של mixmers מגבר קדם/DNA מגבירה את ייצור החלבון SMN. (א) המערבי סופג של SMN ו Cofilin (טעינת פקד) של fibroblasts חולה SMA ובריאה שטופלו mixmer. (ב) לקפל לודיג רמות חלבון SMN fibroblasts SMA שטופלו mixmer. תרביות תאים של mixmers #1-5-5 nM ריכוז מגדיל באופן משמעותי את הייצור של SMN חלבונים. הנתונים היו מנורמל ביחס של SMN/Cofilin ב שאינם מטופלים fibroblasts SMA. העמודות מייצגות הממוצע ± סטיית התקן (ארבעה ניסויים עצמאית). חד-כיווני אנובה עם מבחן השוואה מרובים של Dunnett בוצעה. מ: רכיסה ללעוג שליטה, NT: שאינם מטופלים. איור זה המופקת מן Touznik et.al. 13. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במבחנה הערכה השיטה המתוארת כאן היא מהירה, קלה, רגישים מספיק לבדיקה של AONs שונים. פרוטוקול זה חל נרחב אקסון דילוג והכללה של גנים אחרים, סוגי תאים שונים. בנוסף, בדיקות, רוב הביוכימיה און (למעט PMOs) יכול להיות transfected בשיטה זו. AONs ניתן לווסת שחבור של pre-mRNA של גנים אנדוגני והציג באופן מלאכותי, יכול להיות שותף transfected עם פלסמיד וקטורים נושאת גנים יישוב.
שלב קריטי של שיטה זו הוא כי confluency התא צריך להיות בסביבות 65-80% AONs הם transfected לתוך fibroblasts. מצב זה עשוי להיות שונה עבור סוגי תאים אחרים. ריכוז AONs. הטוב ביותר עבור תרביות תאים שאפשר גם אחרת (0.5 - 100 ננומטר), בהתאם רצפים יישוב, סוגי תאים.
שיטה זו אינה ללא מוקשים פוטנציאליים. לדוגמה, היעילות של mixmers נקבע לפי הרצפים של mixmers ושל הרכב מגבר קדם/ה-DNA. עבור ISS-N1, mixmer, המורכבת LNAs עם ה-DNA בהחלפתם על מגבר קדם במיקום השלישי כל נוקלאוטיד, היה יעיל יותר מאשר mixmer עם רצף מקביל עם החלפת ה-DNA על כל אחרים נוקלאוטיד או כל-מגבר קדם oligonucleotide13 . עם זאת, זה עשוי להיות שונה עבור רצפי יעד אחרים. לכן, זה הכרחי כדי למטב את רצפי DNA/מגבר קדם mixmers, להעריך את היעילות של mixmers ברמת ה-RNA לפני שנמשיך הלאה. התווך שלם של mixmers צריך להיות phosphorothioated כדי למנוע השפלה. בנוסף, אף על פי שיטה זו תקנים בתיווך lipotransfection יכול לשמש עבור רוב און בדיקות, הביוכימיה, אין אפשרות להשתמש עבור תשלום לנייטרלי phosphorodiamidate מורפולינו oligomers (PMOs), מאחר lipotransfection דורשת באופן שלילי oligonucleotides טעון. שיטות של תרביות תאים PMO, ראו במקומות אחרים24,23,25.
אמנם שיטה זו שימושית עבור בדיקות AONs הרומן, המודל תאי פיברובלסט SMA לא מסכם את הדברים ויוו תנאים בשלמותו. מודלים בעלי חיים יכול לשמש כמקור חשוב לבחון ויוו היעילות והבטיחות26.
לצורך דילוג על אקסון/הכללה, PMO והסבת 2 ′-O-methoxyethyl (2' מו) יכול לשמש במקום מגבר קדם/DNA mixmers27,28. עם זאת, ריכוז אופטימלי של בדיקות אלה, הביוכימיה של תרביות תאים הם בדרך כלל הרבה יותר גבוה29,30. בגלל היעילות יותר לעומת שאר בדיקות antisense, הביוכימיה, השימוש מבוססי mixmer oligonucleotides antisense מגבר קדם/ה-DNA עשוי להיות אסטרטגיית טיפולית אטרקטיבי לטיפול splicing ליקויים שנגרמו על ידי מחלות גנטיות בעתיד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים תודה ניקול McRorie להזעיק עזרה עם הניסויים. עבודה זו נתמכה על ידי אוניברסיטת אלברטה הפקולטה לרפואה, רפואת שיניים, Slipchuk SMA מחקר קרן מחקר גרנט, את קנדי מוסדות של הבריאות מחקר (CIHR), וקרנות חברים של גארט קאמינג מחקר, HM Toupin נוירולוגי וקרנות מחקר מדעי, בית קנדה ניוון שרירים, קרן קנדה חדשנות, אלברטה ארגוני חינוך מתקדם, ואת הנשים ואת לילדים הבריאות מכון המחקר (WCHRI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SMA Fibroblasts | Coriell NIGMS human genetic cell repository | GM03813 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher | 11320033 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F1051 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher | 25300062 | |
| Serum-deprived media | Thermo Fisher | 31985070 | |
| Transfection reagent | Thermo Fisher | 15338100 | |
| guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform (TRIzol) | Thermo Fisher | 15596-018 | |
| RT-PCR Primers | Sequence 5' to 3' | ||
| SMN2 forward: | CTGCCTCCATTTCCTTCTG | ||
| SMN2 reverse: | TGGTGTCATTTAGTGCTGCTC | ||
| GAPDH forward: | TCCCTGAGCTGAACGGGAAG | ||
| GAPDH reverse: | GGAGGAGTTTGGTCGCTGT | ||
| qPCR Primers | |||
| full-length SMN2 forward: | GCTATCATACTGGCTATTATATGGGTTTT | ||
| full-length SMN2 reverse: | CTCTATGCCAGCATTTCTCCTTAAT | ||
| GAPDH forward: | GCAAATTCCATGGCACCGT | ||
| GAPDH reverse: | AGGGATCTCGCTCCTGGAA | ||
| Chloroform | Sigma-Aldrich | P3803 | |
| Glycogen, RNA grade | Thermo Fisher | R0551 | |
| ImageJ Software | |||
| Protease cocktail inhibitor | Roche | 11836153001 | |
| Cathode Buffer | 0.025 M Tris base + 40 mM 6-aminocaproic acid + 20% Methanol | ||
| Anode Buffer | 0.03 M Tris Base + 20% Methanol | ||
| Concentred Anode Buffer | 0.3 M Tris base + 20% Methanol | ||
| Beta Mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | |
| PVDF membrane | GE | 10600021 | |
| Loading/sample buffer for Western blotting | NuPage Invitrogen | NP007 | |
| One-Step RT-PCR kit | Qiagen | 210210 | |
| dNTPs | Clontech | 3040 |
References
- Iascone, D. M., Henderson, C. E., Lee, J. C. Spinal muscular atrophy: from tissue specificity to therapeutic strategies. F1000Prime Rep. 7, 4 (2015).
- Touznik, A., Lee, J. J., Yokota, T. New developments in exon skipping and splice modulation therapies for neuromuscular diseases. Expert Opin Biol Ther. 14 (6), 809-819 (2014).
- Lefebvre, S., et al. Identification and Characterization of a Spinal Muscular Atrophy-Determining Gene. Cell. 80 (1), 155-165 (1995).
- Lorson, C. L., Hahnen, E., Androphy, E. J., Wirth, B. A single nucleotide in the SMN gene regulates splicing and is responsible for spinal muscular atrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (11), 6307-6311 (1999).
- Monani, U. R., et al. A single nucleotide difference that alters splicing patterns distinguishes the SMA gene SMN1 from the copy gene SMN2. Hum Mol Genet. 8 (7), 1177-1183 (1999).
- Lee, J. J., Yokota, T. Antisense therapy in neurology. J Pers Med. 3 (3), 144-176 (2013).
- Aartsma-Rus, A. FDA Approval of Nusinersen for Spinal Muscular Atrophy Makes 2016 the Year of Splice Modulating Oligonucleotides. Nucleic Acid Ther. 27 (2), 67-69 (2017).
- Hua, Y., et al. Peripheral SMN restoration is essential for long-term rescue of a severe spinal muscular atrophy mouse model. Nature. 478 (7367), 123-126 (2011).
- Hua, Y., Vickers, T. A., Baker, B. F., Bennett, C. F., Krainer, A. R. Enhancement of SMN2 exon 7 inclusion by antisense oligonucleotides targeting the exon. PLoS Biol. 5 (4), 73 (2007).
- Passini, M. A., et al. Antisense oligonucleotides delivered to the mouse CNS ameliorate symptoms of severe spinal muscular atrophy. Sci Transl Med. 3 (72), (2011).
- Hammond, S. M., et al. Systemic peptide-mediated oligonucleotide therapy improves long-term survival in spinal muscular atrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (39), 10962-10967 (2016).
- Porensky, P. N., et al. A single administration of morpholino antisense oligomer rescues spinal muscular atrophy in mouse. Hum Mol Genet. 21 (7), 1625-1638 (2012).
- Touznik, A., Maruyama, R., Hosoki, K., Echigoya, Y., Yokota, T. LNA/DNA mixmer-based antisense oligonucleotides correct alternative splicing of the SMN2 gene and restore SMN protein expression in type 1 SMA fibroblasts. Sci Rep. 7 (1), 3672 (2017).
- Obika, S., et al. Synthesis of 2'-O,4'-C-methyleneuridine and -cytidine. Novel bicyclic nucleosides having a fixed C-3,-endo sugar puckering. Tetrahedron Letters. 38 (50), 8735-8738 (1997).
- Singh, S. K., Nielsen, P., Koshkin, A. A., Wengel, J. LNA (locked nucleic acids): synthesis and high-affinity nucleic acid recognition. Chemical Communications. (4), 455-456 (1998).
- Navarro, E., Serrano-Heras, G., Castano, M. J., Solera, J. Real-time PCR detection chemistry. Clin Chim Acta. 439, 231-250 (2015).
- Urbanek, M. O., Nawrocka, A. U., Krzyzosiak, W. J. Small RNA Detection by in Situ Hybridization Methods. Int J Mol Sci. 16 (6), 13259-13286 (2015).
- Wahlestedt, C., et al. Potent and nontoxic antisense oligonucleotides containing locked nucleic acids. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (10), 5633-5638 (2000).
- Rupaimoole, R., Slack, F. J. MicroRNA therapeutics: towards a new era for the management of cancer and other diseases. Nat Rev Drug Discov. 16 (3), 203-222 (2017).
- Lanford, R. E., et al. Therapeutic silencing of microRNA-122 in primates with chronic hepatitis C virus infection. Science. 327 (5962), 198-201 (2010).
- Shimo, T., Maruyama, R., Yokota, T. Designing Effective Antisense Oligonucleotides for Exon Skipping. Methods Mol Biol. 1687, 143-155 (2018).
- Shimo, T., et al. Design and evaluation of locked nucleic acid-based splice-switching oligonucleotides in vitro. Nucleic Acids Res. 42 (12), 8174-8187 (2014).
- Nguyen, Q., Yokota, T. Immortalized Muscle Cell Model to Test the Exon Skipping Efficacy for Duchenne Muscular Dystrophy. J. Pers. Med. 7 (4), 13 (2017).
- Echigoya, Y., et al. Quantitative Antisense Screening and Optimization for Exon 51 Skipping in Duchenne Muscular Dystrophy. Mol Ther. , (2017).
- Saito, T., et al. Antisense PMO found in dystrophic dog model was effective in cells from exon 7-deleted DMD patient. PLoS One. 5 (8), 12239 (2010).
- Donnelly, E. M., et al. Characterization of a murine model of SMA. Neurobiol Dis. 45 (3), 992-998 (2012).
- Lim, K. R., Maruyama, R., Yokota, T. Eteplirsen in the treatment of Duchenne muscular dystrophy. Drug Des Devel Ther. 11, 533-545 (2017).
- Paton, D. M. Nusinersen: antisense oligonucleotide to increase SMN protein production in spinal muscular atrophy. Drugs Today (Barc). 53 (6), 327-337 (2017).
- Prakash, T. P., et al. Comparing in vitro and in vivo activity of 2'-O-[2-(methylamino)-2-oxoethyl]- and 2'-O-methoxyethyl-modified antisense oligonucleotides. J Med Chem. 51 (9), 2766-2776 (2008).
- Aoki, Y., et al. Bodywide skipping of exons 45-55 in dystrophic mdx52 mice by systemic antisense delivery. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (34), 13763-13768 (2012).
