Summary
Çeşitli antianlamlı oligonucleotides (AONs) exon eklenmesi (splice modülasyon) teşvik ve spinal kas atrofisi (SMA) için SMN ifade kurtarma gösterilmiştir. Burada, biz AON lipotransfection SMN2 gen ve SMA hasta fibroblastlar etkinliğini belirlemek için değerlendirme yöntemleri exon eklenmesi ikna etmek için bir iletişim kuralı tanımlamak.
Abstract
Spinal kas atrofisi (SMA) SMN1, kaybına neden ölümcül bir nörolojik hastalık antianlamlı Oligonükleotid (AON) alanında benzersiz bir olgu sunar-terapi aracılı. SMN1 mutasyonlar hastalık için sorumlu olmakla birlikte, SMN2, intronic splice susturucu (ISS) siteleri hedefleme AONs nusinersen, FDA onaylı dahil olmak üzere gösterilmiştir SMN ifade geri yüklemek ve semptomları iyileştirmek için. Şu anda, AON terapi için SMA içeren birçok çalışma daha nusinersen daha etkili ve daha az toksik olabilir SMN2 hedefleme roman AON kimyaları soruşturma üzerinde odaklanın. Burada, exon dahil ters transkripsiyon Polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR), nicel Polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) ve Western Blot takip AONs lipotransfection kullanarak vitro değerlendirilmesi için bir protokol açıklayın. Bu yöntem AON kimyaları çeşitli türleri için istihdam edilebilir. Bu yöntemi kullanarak, biz AONs oluşan alternatif kilitli nükleik asitleri (eskimiş) ve DNA nükleotit (LNA/DNA mixmers) kurşun verimli SMN2 exon eklenmesi ve bir çok düşük konsantrasyon ve bu nedenle, LNA SMN protein restorasyonu için göstermek / DNA mixmer tabanlı antianlamlı oligonucleotides genetik hastalıklar kaynaklanan alışılageldik kusurlar tedavisi için çekici bir tedavi stratejisi olabilir. Burada açıklanan vitro değerlendirme yöntemi hızlı, kolay ve çeşitli roman AONs test etmek için yeterince duyarlı.
Introduction
Spinal kas atrofisi (SMA) bir otozomal resesif desen miras ölümcül bir nöromüsküler hastalığıdır. Bu motor nöronlar ve ilerici gövde ve bacak kas felci1,2bozulması ile karakterizedir. SMA oluşum motor nöron 1 yaşama (SMN1) gen3homozigoz bir mutasyon nedeniyle çoğu. Motor nöron 2 yaşama (SMN2) gen SMN1ters bir kopyası ve sadece beş üsleri4,5tarafından farklı hemen hemen aynı sırası vardır. Mutasyon temel exon SMN2 transkript (şekil 1bir) neredeyse % 90 hariç 7 yol açar, çünkü exon 7 bulunan SMN2 bir C T geçmesini gen neredeyse işlevsiz yapar. Protein ürün kararsız ve hızla düşer çünkü exon 7 eksik SMN2 mRNA'ların SMN1 işlevi için telafi edemez.
Antianlamlı terapisi son zamanlarda SMA6tedavisi için çok umut verici bir strateji olarak ortaya çıktı. Son nusinersen ABD Gıda ve İlaç Dairesi (FDA) tarafından onaylanması ilk ilaç SMA7tedavisi için kullanılabilir hale. Nusinersen 2 '-O-metoksietil değişiklik (MOE) ve bir phosphorothioate omurga ile bir 18-mer antianlamlı Oligonükleotid (AON) olduğunu. Uyuşturucu intronic dikişi susturucu N1 hedefler (ISS-N1) bulunan intron 7 SMN2 gen. ISS-N1 nusinersen bağlama fonksiyonel tam uzunlukta SMN protein ifadeden endojen SMN2 gen kurtarılması exon 7 dahil (şekil 1bir)8,9,10 inducing tarafından teşvik . Şu anda, AON terapi için SMA içeren birçok çalışma daha nusinersen daha etkili ve daha az toksik olabilir roman AON kimyaları soruşturma üzerinde odaklanın. AONs diğer kimyaları ile SMN2 exon 7 exon eklenmesi de verimli bir şekilde ikna etmek kanıtlanmıştır vitro ve in vivo11,12,13.
Kilitli nükleik asitler (eskimiş) kimyasal olarak değiştirilmiş RNA analogları Metilen köprü 2 ' - ileoksijen furanose yapısı (şekil 1b)14,15içinde 4 ' -karbon bağlayan içeren vardır. DNA'lar ya da RNA'ları ile karşılaştırıldığında, eskimiş tamamlayıcı RNA dizileri bağlama için artan bir ilgi ve endojen enzimler için son derece dirençli olmanın yararı vardır. LNA kimya kullanım için probları Floresans in situ hibridizasyon (balık) ve qPCR16,17olarak uygulanmıştır. Ayrıca, gen ekspresyonu düzenlemek için kullanılan vitro ve içinde vivo. GapmeR AONs 5've 3'ucunda birkaç eskimiş çevrili iki tek iplikçikli DNA molekülün bir bileşimidir. Onlar gen ekspresyonu bağlama tarafından hedeflenen mRNA'ların onları harekete geçirmek RNase H18tarafından bozulmuş neden, tamamlayıcı knock down. LNA/DNA mixmers eskimiş arasında entegre DNA nükleotit oluşan AONs vardır. Bu yönde sunulan Onlar onun işlevi (LNA-antimiR)19inhibe miRNA bağlayabilirsiniz. Bazı LNA antimiRs klinik geliştirme ulaştınız. Örnekler için miravirsen (AntimiR-122) Hepatit C enfeksiyonu tedavi etmek için miR-122 engeller bir LNA-antimiR ve birkaç Aşama II klinik şu anda devam eden19,20. Son zamanlarda, LNA/DNA mixmers da21Uçbirleştirme RNA modüle kanıtlanmıştır. Bu mRNA belirli bir dizi bağlamak ve SMN2 mRNA vitro13,22. dystrophin mRNA ve exon eklenmesi atlama exon teşvik
Bu makalede, indüksiyon AONs ve etkinliğinin değerlendirilmesi RNA ve protein düzeylerinde kullanarak exon katılım için bir metodoloji anahat. Bu yöntem örneklemek için ISS-N1 SMN2intron 7 hedefleme LNA/DNA mixmers kullanılır. SMA hasta hücrelere lipotransfection tarafından transfected AONs son SMN2 transkript ve upregulation SMN protein üretiminin exon 7 eklenmesi indüklenen. Exon dahil neden LNA/DNA mixmers kullanmanın avantajları etkili konsantrasyon transfection için diğer kimyaları13önemli ölçüde daha düşük olmasıdır. Bu yöntem birçok diğer AONs phosphorodiamidate morpholino reaksiyonlar (PMOs), hangi, tarafsız onların ücret nedeniyle, Endo-Porter co transfection reaktif tarafından indüklenen endositoz ile hücreleri girmeniz gerekir hariç için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. hücre kültürü
- Kültür SMA hastanın fibroblast (değiştirilmiş Dulbecco'nın, kartal orta 1: 1 F-12 (Ham) ile % 10 fetal sığır serum (FBS) ve % 0,5 penisilin/streptomisin) büyüme orta 37 ° C'de CO2 kuluçka
- Bir otomatik hücre sayaç kullanarak hücre konsantrasyonu belirlemek ve 1 x 105 hücre/ml büyüme orta ve ardından uygun plaka üzerinde tohum hücreleri oranında seyreltin. 12-şey tabak (iyi başına 1 mL) RT-PCR veya qPCR için kullanın.
- Tabaklar CO2 kuluçka 37 ° C'de 24 h için kuluçkaya
2. LNA/DNA mixmer transfection
- Hücre confluency yaklaşık 65-%80 en iyi transfection verimlilik için emin olun.
- 10 mikron LNA/DNA mixmers yavaş yavaş buzda çözülme.
- Bir 1.5 mL tüp, böylece son hacim 50 μL ulaşır serum yoksun medyaya mixmers ekleyerek 20 x mixmer çözüm hazırlamak.
- Mixmer çözüm % 3 transfection reaktifi (1:1 oran) içeren serum yoksun medyayı 50 μL ile karıştırın.
- Oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya.
- 900 μL serum yoksun orta % 5 ile eklemek için her tüpün FBS.
- Eski medya plaka Aspire edin ve 1 mL transfection reaktif içeren LNA/DNA mixmer çözüm ile değiştirin.
- CO2 kuluçka 37 ° C'de 24-48 h için hücreleri kuluçkaya.
3. RNA çıkarma
- Orta kaldırın ve 1 mL guanidinium thiocyanate-fenol-kloroform reaktif hücrelere ekleyin. Guanidinium thiocyanate-fenol-kloroform ile de birkaç kez alt yıkama ve 1.5 mL tüpler içine toplamak.
- Girdap 30 s ve-80 ° C için 1 saat veya gece boyunca dükkanda için yüksek hızda.
- Oda sıcaklığında ve girdap örnekleri de çözülme.
- 200 µL kloroform eklemek, şiddetle çalkalanır için 15 s ve 3 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.
- 4 ° C'de 15 dakika 12.000 x g, santrifüj
- En iyi açık sulu faz yeni bir tüp içine toplamak. Herhangi bir alt ve üst aşamaya formları beyaz Interphase toplama önlemek emin olun.
- 500 µL isopropanol ekleyip 1 µL 8 µg/µL glikojen (RNA grade). 10 için girdap s ve 10 dakika oda sıcaklığında veya -20 ° C'de gecede kuluçkaya.
- 12.000 x g 4 ° C'de 10 dakika için de santrifüj kapasitesi ve tüm süpernatant kaldırmak. Beyaz bir Pelet tüp alt kısmında oluşturacak.
- 1 mL soğuk % 75 etanol ve santrifüj 7,500 x g 4 ° C'de 5 min için ekleyin
- Tüm etanol kaldırmak ve hiçbir etanol tüp terk edene kadar oda sıcaklığında Pelet Makinası.
- Pelet 30 µL Dnaz/RNase free su dağıtılması ve 60 ° C'de 10 dakika için kuluçkaya
- Ölçmek bir Spektrofotometre kullanarak RNA konsantrasyonu (260 nm) ve RNA konsantrasyonu 50 ng/µL için ayarlayın.
4. bir adım SMN2 exon katılım oranını ölçmek için RT-PCR
- Mix 12.5 µL 2 RT-PCR reaksiyon arabellek x 1.0 µL tek adımlı RT-PCR enzim karışımı, her astar 0.5 µL (SMN2 ileri: 5'-CTGCCTCCATTTCCTTCTG-3', SMN2 ters: 5'-TGGTGTCATTTAGTGCTGCTC-3', GAPDH ileri: 5'-TCCCTGAGCTGAACGGGAAG-3', GAPDH ters: 5'-GGAGGAGTTTGGTCGCTGT-3', 2 µL toplam RNA'ın (50 ng/µL), ve RNase/Dnaz-Alerjik, 8,5 µL distile su.
- CDNA 15dk için 50 ° C'de sentezlenir sonra PCR reaksiyon başlatın. 30 PCR çevrimleri ile SMN2 exon 6-8 yükseltmek (94 ° C 15 s, 30 60 ° C s, 68 ° C 25 s). GAPDH 20 PCR çevrimleri ile yükseltmek (94 ° C 15 s, 30 60 ° C s, 68 ° C 20 s).
- Boya PCR ürünü için yükleme x 5 μL 6 ekleyin ve karışımı 5 µL % 2 özel jel yük ve 100 V 40 min için çalıştırın.
- Jel görüntü ve ImageJ yazılım kullanarak çözümleyebilirsiniz.
- Tam uzunlukta bantları ve Δ7 bantları yoğunluğunu ölçmek. Yoğunluk değeri (tam uzunlukta) tarafından exon 7 katılım oranını hesaplamak / (dolu-uzunluk + Δ7 SMN2).
5. kantitatif PCR SMN2 exon katılım oranını ölçmek için (qPCR)
- CDNA sentezi için 1 µL Oligo dT karıştırın, 1 µL 10 mM dNTPs ve 11 µL toplam RNA (50 ng/µL). 65 ° c 5 min için kuluçkaya.
- Örnekleri Buza koyun ve her örnek için 4 µL 5 x arabellek, 1 µL 0.1 M DTT, 1 µL RNase inhibitörü ve 1 µL transkriptaz ekleyin.
- 50 ° c 60 dk için kuluçkaya ve 80 ° C'ye kadar tepki durdurmak 10 min için ısı. CDNA-20 ° C'de depolanan
- CDNAs su (1:5 seyreltme) RNase free ile sulandırmak. Mix 10 µL 2 x SYBR yeşil qPCR enzim karışımı, 0.8 µL 10 µM astar (tam uzunlukta SMN2 ileri: 5 '-GCTATCATACTGGCTATTATATGGGTTTT-3 ', tam uzunlukta SMN2 ters: 5 '-CTCTATGCCAGCATTTCTCCTTAAT-3, ' Δ7 SMN2 ileri: 5 ' - TCTGGACCACCAATAATTCCCC-3′, Δ7 SMN2 ters: 5 '-ATGCCAGCATTTCCATATAATAGCC-3,'gapdh GAPDH ileri: 5 '-GCAAATTCCATGGCACCGT-3 ', GAPDH ters: 5 '-AGGGATCTCGCTCCTGGAA-3 '), 3 seyreltilmiş µL cDNA ve 5.4 µL RNase free su.
- QPCR reaksiyon başlar. Koşulları kullanın: 95 ° C 30 s sonra 40 bir döngü tekrar 95 ° C'de 5 s ve 60 ° C 20 s.
- Tam uzunlukta SMN2 için GAPDH veya Δ7 SMN2göreli ifade hesaplamak ve ΔΔCt algoritması ile tedavi olmayan hücrelere normalleştirmek.
6. Batı kurutma
- Transfection orta hücrelerdeki kaldırmak ve fosfat tamponlu tuz (PBS) ile bir kez yıkayın.
- Bir proteaz inhibitörü ile 100 µL lizis tampon ekleyin.
- Steril hücre kazıyıcı kullanarak her kuyunun hücrelerden ayırmak ve 1.5 mL tüpler içine toplamak. Örnekleri 30 dk için buz üzerinde kuluçkaya.
- Hücre lysate 21-G iğne ile 10 kat hücreleri ezmek için geçmek.
- Vasıl 20,800 x g 4 ° C'de 15 dakika santrifüj kapasitesi ve süpernatant yeni 1.5 mL tüpler içine toplamak. Örnek bir-80 ° C derin dondurucuda saklanabilir.
- BCA Protein tahlil Kit kullanarak protein konsantrasyonu belirlemek ve konsantrasyon 1.0 µg/µL için ayarlayın.
- Mix 5 µL örnekleri ve Sodyum Lauryl Sülfat (SDS) örnek arabellek x 5 µL 2 (% 10 SDS; %14 0, 5 M Tris-HCl çözüm, pH 6.7; %1 0,5 M EDTA 2Na stok çözelti, faz 8.0; % 20 gliserol; %0,004 bromophenol mavi boya, %5 β-mercaptoethanol) ve 10 dk 70 ° C ısıda.
- Örnekleri 4-12 Bis-Tris Protein jelleri % yük ve 150'den V 1 h için çalıştırın.
- Kalın bir filtre kağıdı her arabellekte emmek: (konsantre anot arabellek: 0,3 M Tris-HCl, % 20 metanol; anot arabellek: 0,03 M Tris-HCl, % 20 metanol; katot arabellek: 25 mM Tris, % 20 metanol, 40 mM 6-amino-n-hexanoic asit, % 0,01 SDS).
- Metanol 20 polivinilidin difluoride (PVDF) membran emmek s, o zaman anot ara belleğe transferi.
- Jel SDS-sayfa sonra 5-10 dk ajitasyon altında katot arabelleği ile equilibrate.
- Filtre kağıtları, PVDF membranlar ve jel yarı kuru bir blotting makinede aşağıdaki gibi yerleştirin: Konsantre anot arabellek kağıt/anot arabellek kağıt/PVDF membran/protein jel/katot arabellek kağıt (Şekil 2).
- Yığın kapak ve 20 V 30 dk için Aktarım'ı başlatın.
- Aktarımdan sonra PVDF membran PBST ile yıkayın (PBS % 0.05 ile ara 20) bir kez.
- Membran için 30 dk içinde PBST içinde çözünmüş %5 yağsız süt tozu içinde oda sıcaklığında veya gece kalmak için 4 ° C'de engelleyin.
- Arıtılmış fare anti-SMN antikor ve %5 yağsız süt tozu PBST içinde 1:10,000 bir tavşan anti-Cofilin antikor oranında seyreltin. İçindeki membran için 1 h, oda sıcaklığında veya 4 ° C'de gecede kuluçkaya.
- 3 kez 10 dakikadır PBST ile yıkayın.
- 1:10,000 PBST % 5 yağsız süt tozu (HRP Birleşik keçi Anti-fare ve anti-tavşan IgG (H + L)) ikincil antikorlar sulandırmak. Karanlık oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya.
- Membran 3 kez ile PBST 10 dakika yıkayın.
- Kemiluminesan Western Blot algılama seti kullanarak bandı sinyali algılamak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SMA hasta fibroblastlar kullanarak, intron 7 SMN2 gen bir 5 nM konsantrasyonu (şekil 3) transfected antianlamlı sekiz farklı LNA/DNA mixmers ile ISS-N1 susturucu bölgede hedef aldı. Her mixmers biri onları nükleaz bozulması direnmeye etkin bir değiştirilmiş phosphorothioated omurga yer. Mixmers, SMN2 exon oranı etkinliğini değerlendirmek için 7 dahil RT-PCR ve SMN2için belirli primerler kullanılarak qPCR sayısal. Herhangi bir önemli fark zaman göre exon mixmers #1-5 (şekil 4a, b), hasta hücrelerdeki mixmers #6-8, aynı doz kullanan transfection süre ile transfected zaman % 78-98 arasında değişiyordu 7 dahil verimliliğini sonuçlanmamıştır Denetim. Sonuçları tam uzunlukta SMN2 mRNA transkript miktarı önemli ölçüde #1-3 mixmers ve denetimine (şekil 4c) karşılaştırıldığında #5 tedavileri artmış da görüntülenen qPCR analizinden elde.
Ayrıca, Western Blot sonucu mixmers kullanarak bu transfection SMN protein ifade #1-5 etkin yüksek düzeyde sabırlı fibroblastlar gösterdi (1.5 - a 1.9-fold artış denetimden şekil 5). Mixmers #6-8 kullanarak tedaviler SMN protein ifade düzey hücrelerdeki bir değişikliğe sonuçlanmamıştır. Bu veriler bu transfection göstermektedir LNA/DNA'sını mixmers #1-5 SMN2 7 exon eklenmesi verimli SMA hasta fibroblastlar neden olmaktadır.
Resim 1 : SMA tedavisinde Antisens aracılı exon dahil strateji. (a) SMN2 exon 7 içinde C T geçiş exon 7 SMN2 transkript yaklaşık % 90 atlama için yol açar. Bu transkriptler çerçeve ve hücreleri hızlı bir şekilde bozulmuş. Antianlamlı oligonucleotides (AONs) intronic dikişi susturucu N1 bağlamak (ISS-N1), hangi exon eklenmesi SMN2neden olmaktadır. Exon 7 ye dahil SMN2 mRNA'ların fonksiyonel SMN protein üretebilir. (b) RNA ve phosphorothioated LNA kimyasal yapıları. Biz bu makalede kullanılan mixmers tüm omurgalarına phosphorothioated yıkımı önlemek için vardır. Bu rakam Touznik değiştirildi et.al. 13. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Western Blot için yarı kuru aktarma yöntemi. Kalın bir filtre kağıdı batırılmış (mahkum) anot arabellek, kalın bir filtre kağıdı anot arabellekte batırılmış konsantre, PVDF membran, jel ve kalın bir filtre kağıdı katot arabellekte batırılmış bir yarı kuru blotting makine iki tabak arasında dizilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : LNA/DNA mixmer dizisi SMN2 exon 7 eklenmesi için. DNA Bankası: G, A, T, C. LNA Bankası (kırmızı): + G + A, T + C. Phosphorothioated DNA baz: G *, A *, T *, C *. Phosphorothioated LNA Bankası (kırmızı): G *, A *, + T *, + + C *. Bu rakam Touznik yeniden et.al. 13. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : RT-PCR ve qPCR LNA/DNA mixmers etkinliğini değerlendirmek için temsilcisi sonuçlarını. #1-5 mixmers transfection SMN2 exon 7 dahil sahte transfection daha anlamlı olarak daha yüksek bir hızda yol açar. 5 nM konsantrasyon, (bir) RT-PCR SMN2 ve GAPDH SMA hasta fibroblastlar takip içinde transfection. En iyi Grup: exon tam uzunlukta SMN2 mRNA 7 ye dahil. Alt grup: exon SMN2 mRNA 7 hariç. RT-PCR kullanarak mixmer tedavi SMA fibroblastlar (b) kantitatif analiz SMN2 exon 7, dahil. (c) göreli ifade analizi tam uzunlukta SMN2 GAPDH için qPCR kullanarak ölçülen. Verileri olmayan tedavi kontrol hücreleri için normalleştirilmiş. Hata çubukları ortalama ± standart sapma (üç bağımsız deneyler) temsil eder. Dunnett'ın birden fazla karşılaştırma testi ile tek yönlü ANOVA gerçekleştirildi. M: Denetim, NT alay: Sigara tedavi, H: sağlıklı kontrol fibroblast hücreleri, B: boş. Bu rakam Touznik yeniden et.al. 13. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 : SMN protein ifade ölçmek için Western Blot temsilcisi sonuçları. LNA/DNA mixmers transfection SMN protein üretimi artar. (a) Western Blot SMN ve sağlıklı ve mixmer tedavi SMA hasta fibroblastlar ve Cofilin (Denetim yükleniyor). (b) kat mixmer tedavi SMA fibroblastlar SMN protein seviyelerinde artış. Mixmers #1-5, 5 nM konsantrasyon transfection SMN proteinleri önemli ölçüde artırır. Verileri SMN/Cofilin oranı sigara tedavi SMA fibroblastlar içinde normalleştirilmiş. Çubuklar ortalama ± standart sapma (dört bağımsız deneyler) gösterir. Dunnett'ın birden fazla karşılaştırma testi ile tek yönlü ANOVA gerçekleştirildi. M: Denetim, NT alay: Sigara tedavi. Bu rakam Touznik yeniden et.al. 13. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan vitro değerlendirme yöntemi hızlı, kolay ve çeşitli AONs test etmek için yeterince duyarlı. Bu protokol atlama exon ve diğer genler ve çeşitli hücre tiplerinin dahil edilmesi için yaygın olarak uygulanmaktadır. Buna ek olarak, çoğu AON kimyaları (PMOs dışında) bu yöntemi kullanarak transfected. AONs pre-mRNA endojen ile yapay olarak tanıtılan gen üzerinden Uçbirleştirme düzenleyen ve hedeflenen genleri taşıyan plazmid vektörleri ile ortak transfected olabilir.
Bu yöntemin önemli bir adım ne zaman AONs fibroblastlar transfected hücre confluency yaklaşık % 65-80 olması gerektiği gibi. Bu durum diğer hücre türleri için farklı olabilir. AONs en iyi konsantrasyon transfection için de farklı olabilir (0,5 - 100 nM) hedeflenen dizileri ve hücre tipleri bağlı olarak.
Bu yöntem potansiyel tuzaklar değildir. Örneğin, mixmers etkinliğini mixmers ve LNA/DNA kompozisyon dizileri tarafından belirlenir. ISS-N1, eskimiş LNA her üçüncü nükleotit konumundaki yerine DNA ile oluşan, bir mixmer bir mixmer ile her diğer nükleotit veya all-LNA Oligonükleotid13, DNA ikame ile eşdeğer bir dizi daha etkili . Ancak, bu diğer hedef sıraları için farklı olabilir. Bu nedenle, LNA/DNA mixmers dizilerini optimize etmek ve daha fazla gitmeden önce RNA düzeyinde mixmers etkinliğini değerlendirmek gereklidir. Mixmers tüm omurgalarına yıkımı önlemek için phosphorothioated olmalıdır. Bu transfection lipotransfection-aracılı yöntem-ebilmek var olmak kullanılmış için çoğu AON kimyaları rağmen lipotransfection olumsuz gerektirdiğinden buna ek olarak, bu ücret-tarafsız phosphorodiamidate morpholino reaksiyonlar (PMOs), kullanılamaz şarj edilmiş oligonucleotides. Bkz: PMO transfection yöntemleri için başka bir yerde23,24,25.
Bu yöntem roman AONs test etmek için yararlı olsa da, SMA fibroblast hücre modeli vivo içinde koşullar bütünüyle özetlemek değil. Hayvan modelleri vivo içinde etkinlik ve güvenlik26test etmek için önemli bir kaynak hizmet verebilir.
EXoN atlama/eklenmesi için PMO ve 2 '-O-metoksietil değişiklik (2' MOE) LNA/DNA mixmers27,28yerine kullanılabilir. Ancak, bu kimyaları transfection için en uygun konsantrasyonu genellikle çok daha yüksek29,30vardır. Diğer antianlamlı kimyaları karşılaştırıldığında daha iyi etkinliği nedeniyle LNA/DNA mixmer tabanlı antianlamlı oligonucleotides kullanımı gelecekte genetik hastalıklar kaynaklanan alışılageldik kusurlar tedavisi için çekici bir tedavi stratejisi olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Yazarlar Nicole McRorie deneyler ile yardım için teşekkür. Bu eser tıp ve diş hekimliği, Slipchuk SMA Araştırma Vakfı araştırma hibe, Kanada kurumları, Sağlık Araştırma (CIHR), arkadaş Garrett Cumming araştırma fonları, HM Toupin Nöroloji Alberta Üniversitesi fakülte tarafından desteklenmiştir Bilim araştırma fonları, kas distrofisi Kanada, Kanada Vakfı için yenilik, Alberta kurumsal ve gelişmiş eğitim ve kadın ve çocuk sağlığı Araştırma Enstitüsü (WCHRI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SMA Fibroblasts | Coriell NIGMS human genetic cell repository | GM03813 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher | 11320033 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F1051 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher | 25300062 | |
| Serum-deprived media | Thermo Fisher | 31985070 | |
| Transfection reagent | Thermo Fisher | 15338100 | |
| guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform (TRIzol) | Thermo Fisher | 15596-018 | |
| RT-PCR Primers | Sequence 5' to 3' | ||
| SMN2 forward: | CTGCCTCCATTTCCTTCTG | ||
| SMN2 reverse: | TGGTGTCATTTAGTGCTGCTC | ||
| GAPDH forward: | TCCCTGAGCTGAACGGGAAG | ||
| GAPDH reverse: | GGAGGAGTTTGGTCGCTGT | ||
| qPCR Primers | |||
| full-length SMN2 forward: | GCTATCATACTGGCTATTATATGGGTTTT | ||
| full-length SMN2 reverse: | CTCTATGCCAGCATTTCTCCTTAAT | ||
| GAPDH forward: | GCAAATTCCATGGCACCGT | ||
| GAPDH reverse: | AGGGATCTCGCTCCTGGAA | ||
| Chloroform | Sigma-Aldrich | P3803 | |
| Glycogen, RNA grade | Thermo Fisher | R0551 | |
| ImageJ Software | |||
| Protease cocktail inhibitor | Roche | 11836153001 | |
| Cathode Buffer | 0.025 M Tris base + 40 mM 6-aminocaproic acid + 20% Methanol | ||
| Anode Buffer | 0.03 M Tris Base + 20% Methanol | ||
| Concentred Anode Buffer | 0.3 M Tris base + 20% Methanol | ||
| Beta Mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | |
| PVDF membrane | GE | 10600021 | |
| Loading/sample buffer for Western blotting | NuPage Invitrogen | NP007 | |
| One-Step RT-PCR kit | Qiagen | 210210 | |
| dNTPs | Clontech | 3040 |
References
- Iascone, D. M., Henderson, C. E., Lee, J. C. Spinal muscular atrophy: from tissue specificity to therapeutic strategies. F1000Prime Rep. 7, 4 (2015).
- Touznik, A., Lee, J. J., Yokota, T. New developments in exon skipping and splice modulation therapies for neuromuscular diseases. Expert Opin Biol Ther. 14 (6), 809-819 (2014).
- Lefebvre, S., et al. Identification and Characterization of a Spinal Muscular Atrophy-Determining Gene. Cell. 80 (1), 155-165 (1995).
- Lorson, C. L., Hahnen, E., Androphy, E. J., Wirth, B. A single nucleotide in the SMN gene regulates splicing and is responsible for spinal muscular atrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (11), 6307-6311 (1999).
- Monani, U. R., et al. A single nucleotide difference that alters splicing patterns distinguishes the SMA gene SMN1 from the copy gene SMN2. Hum Mol Genet. 8 (7), 1177-1183 (1999).
- Lee, J. J., Yokota, T. Antisense therapy in neurology. J Pers Med. 3 (3), 144-176 (2013).
- Aartsma-Rus, A. FDA Approval of Nusinersen for Spinal Muscular Atrophy Makes 2016 the Year of Splice Modulating Oligonucleotides. Nucleic Acid Ther. 27 (2), 67-69 (2017).
- Hua, Y., et al. Peripheral SMN restoration is essential for long-term rescue of a severe spinal muscular atrophy mouse model. Nature. 478 (7367), 123-126 (2011).
- Hua, Y., Vickers, T. A., Baker, B. F., Bennett, C. F., Krainer, A. R. Enhancement of SMN2 exon 7 inclusion by antisense oligonucleotides targeting the exon. PLoS Biol. 5 (4), 73 (2007).
- Passini, M. A., et al. Antisense oligonucleotides delivered to the mouse CNS ameliorate symptoms of severe spinal muscular atrophy. Sci Transl Med. 3 (72), (2011).
- Hammond, S. M., et al. Systemic peptide-mediated oligonucleotide therapy improves long-term survival in spinal muscular atrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (39), 10962-10967 (2016).
- Porensky, P. N., et al. A single administration of morpholino antisense oligomer rescues spinal muscular atrophy in mouse. Hum Mol Genet. 21 (7), 1625-1638 (2012).
- Touznik, A., Maruyama, R., Hosoki, K., Echigoya, Y., Yokota, T. LNA/DNA mixmer-based antisense oligonucleotides correct alternative splicing of the SMN2 gene and restore SMN protein expression in type 1 SMA fibroblasts. Sci Rep. 7 (1), 3672 (2017).
- Obika, S., et al. Synthesis of 2'-O,4'-C-methyleneuridine and -cytidine. Novel bicyclic nucleosides having a fixed C-3,-endo sugar puckering. Tetrahedron Letters. 38 (50), 8735-8738 (1997).
- Singh, S. K., Nielsen, P., Koshkin, A. A., Wengel, J. LNA (locked nucleic acids): synthesis and high-affinity nucleic acid recognition. Chemical Communications. (4), 455-456 (1998).
- Navarro, E., Serrano-Heras, G., Castano, M. J., Solera, J. Real-time PCR detection chemistry. Clin Chim Acta. 439, 231-250 (2015).
- Urbanek, M. O., Nawrocka, A. U., Krzyzosiak, W. J. Small RNA Detection by in Situ Hybridization Methods. Int J Mol Sci. 16 (6), 13259-13286 (2015).
- Wahlestedt, C., et al. Potent and nontoxic antisense oligonucleotides containing locked nucleic acids. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (10), 5633-5638 (2000).
- Rupaimoole, R., Slack, F. J. MicroRNA therapeutics: towards a new era for the management of cancer and other diseases. Nat Rev Drug Discov. 16 (3), 203-222 (2017).
- Lanford, R. E., et al. Therapeutic silencing of microRNA-122 in primates with chronic hepatitis C virus infection. Science. 327 (5962), 198-201 (2010).
- Shimo, T., Maruyama, R., Yokota, T. Designing Effective Antisense Oligonucleotides for Exon Skipping. Methods Mol Biol. 1687, 143-155 (2018).
- Shimo, T., et al. Design and evaluation of locked nucleic acid-based splice-switching oligonucleotides in vitro. Nucleic Acids Res. 42 (12), 8174-8187 (2014).
- Nguyen, Q., Yokota, T. Immortalized Muscle Cell Model to Test the Exon Skipping Efficacy for Duchenne Muscular Dystrophy. J. Pers. Med. 7 (4), 13 (2017).
- Echigoya, Y., et al. Quantitative Antisense Screening and Optimization for Exon 51 Skipping in Duchenne Muscular Dystrophy. Mol Ther. , (2017).
- Saito, T., et al. Antisense PMO found in dystrophic dog model was effective in cells from exon 7-deleted DMD patient. PLoS One. 5 (8), 12239 (2010).
- Donnelly, E. M., et al. Characterization of a murine model of SMA. Neurobiol Dis. 45 (3), 992-998 (2012).
- Lim, K. R., Maruyama, R., Yokota, T. Eteplirsen in the treatment of Duchenne muscular dystrophy. Drug Des Devel Ther. 11, 533-545 (2017).
- Paton, D. M. Nusinersen: antisense oligonucleotide to increase SMN protein production in spinal muscular atrophy. Drugs Today (Barc). 53 (6), 327-337 (2017).
- Prakash, T. P., et al. Comparing in vitro and in vivo activity of 2'-O-[2-(methylamino)-2-oxoethyl]- and 2'-O-methoxyethyl-modified antisense oligonucleotides. J Med Chem. 51 (9), 2766-2776 (2008).
- Aoki, Y., et al. Bodywide skipping of exons 45-55 in dystrophic mdx52 mice by systemic antisense delivery. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (34), 13763-13768 (2012).
