Summary
다양 한 센스 oligonucleotides (AONs) exon 포함 (스플라이스 변조) 유도 및 SMN 식 척수 근육 위축 증 (SMA)에 대 한 구조를 보였다. 여기, 우리는 SMN2 유전자와 SMA 환자의 섬유 아 세포에서 효능을 결정 하는 평가 방법에 exon 포함 유도 하 이온 lipotransfection에 대 한 프로토콜을 설명 합니다.
Abstract
척수 근육 위축 증 (SMA), SMN1의 손실에 의해 발생 하는 치명적인 신경 질환 선물 센스 oligonucleotide (이온)의 분야에서 독특한 케이스-치료 중재. SMN1 돌연변이 질병에 대 한 책임, AONs SMN2에 intronic 스플라이스 소음 (ISS) 사이트를 대상으로 FDA 승인 nusinersen를 포함 하 여 보였다 SMN 식 복원 하 고 증상을 개선 하. 현재, SMA를 위한 이온 치료를 포함 하는 많은 연구 조사 SMN2 nusinersen 보다 더 효과적이 고 덜 독성 수 있는 대상으로 하는 소설 이온 화학에 초점. 여기, 우리는 exon 포함 AONs 반전 녹음 방송 연쇄 반응 (RT-PCR), 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량), 및 서쪽에 게 더 럽 히기의 lipotransfection를 사용 하 여 체 외에서 평가 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 메서드는 다양 한 이온 화학에 대 한 사용할 수 있습니다. 우리 AONs 번갈아 잠긴된 핵 산 (Lna)의 구성 및 DNA 뉴클레오티드 (LNA/DNA mixmers) 효율적인 SMN2 exon 포함 및 매우 낮은 농도, 그리고 그러므로, LNA에서 SMN 단백질의 복원으로 이어질 입증이 메서드를 사용 하 여 / DNA mixmer 기반 센스 oligonucleotides 유전자 질병으로 인 한 접합 결함을 치료 하는 매력적인 치료 전략을 수 있습니다. 생체 외에서 평가 여기 설명 된 방법은 빠르고, 쉽고, 충분히 다양 한 소설 AONs의 테스트에 대 한 민감한입니다.
Introduction
척수 근육 위축 증 (SMA) 상 염색체 열성 패턴에서 상속 치명적인 신경 근육 학 질환 이다. 그것은 모터 신경 및 진보적인 간선 및 사지 근육 마비1,2의 저하에 의해 특징입니다. SMA 발생의 대부분은 생존 모터 신경 1 (SMN1) 유전자3에서 homozygous 돌연변이 때문. 2 모터 뉴런의 생존 (SMN2) 유전자 SMN1의 역 중복 이며 단지 5 개의 기지4,5다른 거의 동일한 시퀀스 있다. Exon 7에에서 있는 SMN2 에서 C-T 전환 돌연변이 리드 필수 exon 7 SMN2 증명서 (그림 1a)의 거의 90%에서 제외 되 고 하기 때문에 유전자를 거의 작동으로 만든다. 단백질 제품의 불안정 하 고 급속 하 게 저하 하기 때문에 SMN2 mRNAs exon 7 누락 SMN1 함수에 대 한 보상 수 없습니다.
센스 치료는 최근 SMA6치료에 대 한 매우 유망한 전략으로 등장. 미국 식품의 약 청 (FDA)에 의해 nusinersen의 최근 승인이 했다 첫 번째 약물을 치료 SMA7에 사용할 수 있습니다. Nusinersen 2-O-methoxyethyl 수정 (모)와 phosphorothioate 등뼈는 18-메 르 센스 oligonucleotide (AON) 이다. 약물 표적 intronic 접합 소음 기 N1 (ISS-N1) intron SMN2 유전자의 7에에서 있는. ISS-N1에 nusinersen의 바인딩 exon 7 포함 (그림 1a)8,9,10 유도 기능 전체 길이 SMN 단백질 식 생 SMN2 유전자의 복구를 촉진 . 현재, SMA를 위한 이온 치료를 포함 하는 많은 연구 조사 nusinersen 보다 더 효과적이 고 덜 독성 수 있습니다 새로운 이온 화학에 초점. 그것은 다른 화학 물질과 AONs 또한 효율적으로 SMN2 exon 7에에서 exon 포함 유도 입증 되었습니다 생체 외에서 그리고 vivo에서11,,1213.
잠긴된 핵 산 (Lna) 화학적 수정된 RNA 아날로그 연결 4-탄소 2-산소 furanose 구조 (그림 1b)14,15내 methylene 다리를 포함 하는. DNAs 또는 RNAs에 비해, Lna 바인딩 보완 RNA 시퀀스에 대 한 증가 선호도 있고 생 nucleases에 저항력의 추가 이득이 있다. LNA 화학 형광에 제자리 교 잡 (물고기) 및 정량16,17조사로 사용 하기 위해 적용 되었습니다. 또한, 그것은 유전자 발현 조절에 활용 둘 다 생체 외에서 그리고 에 비보. GapmeR AONs 단일 가닥 DNA 분자 5 '과 3 ' 끝에 몇 가지 Lna에 의해 형벌의 조합입니다. 그들은 그들 활성화 RNase H18에 의해 타락을 일으키는 표적된 mRNAs를 보완 유전자 발현 바인딩에 의해 아래로 노크. LNA/DNA mixmers AONs DNA 뉴클레오티드 Lna 사이 통합의 구성입니다. 이 방향에 그들은 그것의 기능 (LNA-antimiR)19를 억제 하는 miRNA를 바인딩할 수 있습니다. 일부 LNA antimiRs 임상 개발에 도달 했습니다. 예를 들어, miravirsen (AntimiR-122) 억제 미르-122 C 형 간염 감염을 치료 하는 LNA antimiR 이며 여러 단계 II 임상 시험에는 현재 진행 중인19,20. 최근에, mixmers LNA/DNA RNA 접합21변조 또한 수 있습니다 입증 되었습니다. MRNA의 특정 시퀀스에 바인딩할 수 있고 SMN2 mRNA 생체 외에서13,22. dystrophin mRNA와 exon 포함에 건너뛰는 exon 유도
이 문서에서는, 우리는 엑손 포함 AONs 및 효능 평가 사용 하 여 RNA와 단백질 수준에서의 유도 대 한 방법론 개요. 이 방법을 예증 하 우리는 LNA/DNA mixmers SMN2의 intron 7에서에서 ISS N1을 대상으로 사용 합니다. Lipotransfection에 의해 SMA 환자의 세포로 페 AONs exon 7 포함 최종 SMN2 사본 및 SMN 단백질 생산의 upregulation에 유도. LNA/DNA mixmers를 사용 하 여 유도 exon 포함 하의 장점 중 하나는 transfection에 대 한 효과적인 농도 다른 화학13보다 훨씬 낮은입니다. 이 메서드는 phosphorodiamidate morpholino 올리고 (PMOs), 때문에 그들의 중립 책임, 엔도-포터 공동 transfection 시 약에 의해 유도 된 endocytosis 셀 입력 필요가 있는 제외한 다른 많은 AONs 위해 사용할 수 있습니다.
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Protocol
1. 세포 배양
- 37 ° c.에 CO2 배양 기에 성장 매체 (Dulbecco의 수정이 글 중간 1: 【-12 (햄) 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 및 0.5% 페니실린/스)에서 문화 SMA 환자의 섬유 아 세포
- 자동된 셀 카운터를 사용 하 여 셀 농도 결정 하 고 세포에서 성장 매체, 다음 적절 한 판에 씨앗 1 x 105 셀/mL를 희석. RT-PCR 또는 정량에 대 한 12-잘 접시 (우물 당 1 mL)을 사용 합니다.
- 37 ° c.에 CO2 배양 기에서 24 h에 대 한 번호판을 품 어
2. LNA/DNA mixmer transfection
- 최적의 transfection 효율 약 65-80%의 셀 confluency를 확인 하십시오.
- 10 μ M LNA/DNA mixmers 얼음에 천천히 녹여
- 1.5 mL 튜브에 최종 볼륨 도달 50 μ 혈 청을 박탈 미디어는 mixmers를 추가 하 여 20 x mixmer 솔루션을 준비 합니다.
- Mixmer 솔루션 50 μ 3 %transfection 시 약 (1:1 비율)를 포함 하는 혈 청을 박탈 미디어의 혼합.
- 실 온에서 10 분 동안 품 어.
- 추가 5 %900 μ 혈 청을 박탈 매체 FBS 각 관에.
- 접시에서 오래 된 미디어를 발음 하 고 1 mL transfection 시 약을 포함 하는 LNA/DNA mixmer 솔루션으로 바꿉니다.
- CO2 배양 기에서 37 ° C에서 24-48 h에 대 한 셀을 품 어.
3. RNA 추출
- 매체를 제거 하 고 셀에 guanidinium 안산 클로 페 놀 프롬-시 약의 1 mL를 추가 합니다. 하단의 guanidinium 안산-페 놀-클로 프롬과 잘 여러 번 세척 하 고 1.5 mL 튜브에 수집.
- 30 s 및 1 시간 또는 밤새-80 ° C에서 저장소에 대 한 높은 속도 소용돌이.
- 실내 온도 소용돌이에서 샘플을 잘 녹여.
- 추가 200 µ L 클로 프롬, 15에 대 한 적극적으로 악수 s, 그리고 3 분 동안 실 온에서 품 어.
- 4 ° c.에 15 분 동안 12000 x g에서 원심 분리기
- 새로운 관으로 가기 명확한 수성 단계를 수집 합니다. 위와 더 낮은 단계 사이 형성 하는 백색 interphase의 수집을 피하기 위해 있는지 확인 합니다.
- 추가 500 µ L 소 프로 파 놀과 1 µ L 8 µ g / µ L glycogen (RNA 등급). 10 소용돌이 s와 10 분 동안 실내 온도에 또는-20 ° C에서 밤새 품 어.
- 4 ° C에서 10 분 동안 12000 x g에서 centrifuge 고는 상쾌한의 모든을 제거 합니다. 흰색 펠 릿은 튜브의 맨 아래에 형성할 것 이다.
- 4 ° c.에서 5 분 동안 7500 x g에 1 mL 찬 75% 에탄올과 원심 분리기를 추가
- 모든 에탄올을 제거 하 고 아무 에탄올 튜브에 남아 때까지 실내 온도에 펠 릿을 건조.
- 30 µ L DNase/RNase 무료 물, 펠 릿을 녹이 고 60 ° c.에서 10 분 동안 품 어
- 분 광 광도 계를 사용 하 여 RNA 농도 측정 (260에 nm), RNA 농도 50 ng / µ L를 조정.
4. 1 단계 RT-PCR SMN2 의 exon 포함 속도 측정 하
- RT-PCR 반응 버퍼 x 2의 믹스 12.5 µ L, 1.0 µ L 원스텝 RT-PCR 효소의 혼합, 각 뇌관의 0.5 µ L (SMN2 앞으로: 5'-CTGCCTCCATTTCCTTCTG-3', SMN2 역: 5'-TGGTGTCATTTAGTGCTGCTC-3', GAPDH 앞으로: 5'-TCCCTGAGCTGAACGGGAAG-3', GAPDH 역: 5'-GGAGGAGTTTGGTCGCTGT-3', 2 µ L 총 RNA의 (50 ng / µ L), RNase/DNase 무료의 8.5 µ L의 증류수와.
- 15 분 동안 50 ° C에서 cDNA를 합성 후 PCR 반응을 시작 합니다. 증폭 30 PCR 사이클 SMN2 exon 6-8 (15 94 ° C s, 60 ° C 30에 대 한 s, 25 ° C 68 s). 20 PCR 사이클 GAPDH 증폭 (15 94 ° C s, 60 ° C 30에 대 한 s, 20 ° C 68 s).
- PCR 제품에 염료를 로드 x 5 μ 6 추가 및 2 %agarose 젤에 혼합물의 5 µ L을 로드 하 고 40 분 동안 100 V에서 실행.
- 젤 이미지 및 ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여 분석.
- 전체 길이 밴드와 Δ7 밴드의 강도 측정 합니다. (전체 길이)의 강도 값의 exon 7 포함 계산 / (전체 길이 + Δ7 SMN2).
5. 정량 PCR (정량) SMN2 의 exon 포함 속도 측정 하
- 1 µ L 10 mM dNTPs, 및 11 µ L 총 RNA, cDNA 합성, 혼합 1 µ L 올리고 dT (50 ng / µ L). 5 분 동안 65 ° C에서 품 어.
- 얼음에 샘플을 놓고 각 샘플 버퍼, 1 µ L 0.1 M DTT, 1 µ L RNase 억제제, 역전사 1 µ L x 4 µ L 5를 추가 합니다.
- 60 분, 50 ° C에서 품 어 그리고 반응을 중지를 10 분 동안 80 ° C까지가 열. -20 ° c.에는 cDNA는 저장 될 수 있다
- RNase 무료 물 (1:5 희석) cDNAs를 희석. SYBR 녹색 정량 Pcr 효소 믹스 엑스 믹스 10 µ L 2, 0.8 µ L 10 µ M 뇌관 (전장 SMN2 앞으로: 5 '-GCTATCATACTGGCTATTATATGGGTTTT-3, 전체 길이 SMN2 반전: 5 '-CTCTATGCCAGCATTTCTCCTTAAT-3, Δ7 SMN2 앞으로: 5 '- TCTGGACCACCAATAATTCCCC-3′, Δ7 SMN2 역: 5 '-ATGCCAGCATTTCCATATAATAGCC-3, GAPDH 앞으로: 5 '-GCAAATTCCATGGCACCGT-3, GAPDH 역: 5 '-AGGGATCTCGCTCCTGGAA-3), 3 µ L 희석 cDNA 및 5.4 µ L RNase 무료 물.
- 정량 Pcr 반응을 시작 합니다. 사용 조건: 95 ° C 30에 대 한 s, 다음 40 주기 반복 95 ° C에서 5 s 및 20 60 ° C에 대 한 s.
- GAPDH 에 전체 길이 SMN2 또는 Δ7 SMN2의 상대 식을 계산 하 고 ΔΔCt 알고리즘으로 처리 되지 않은 셀에 정상화.
6. 서 부 럽
- 셀에서 transfection 매체를 제거 하 고 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)로 한 번 씻어.
- 프로 테아 제 억제제를 100 µ L 세포의 용 해 버퍼를 추가 합니다.
- 살 균 세포 스 크레이 퍼를 사용 하 여 각의 아래에서 세포를 분리 하 고 1.5 mL 튜브에 수집. 30 분 동안 얼음에 샘플을 품 어.
- 통과 세포 lysate 21 G 바늘 10 번 셀 호감.
- 4 ° C에서 15 분 동안 20,800 x g에서 centrifuge 고 새로운 1.5 mL 튜브에는 상쾌한을 수집 합니다. 샘플-80 ° C 깊은 냉동 실에 저장할 수 있습니다.
- BCA 단백질 분석 실험 키트를 사용 하 여 단백질 농도 결정 하 고 1.0 µ g / µ L를 농도 조정 합니다.
- 믹스 5 µ L 샘플 및 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS) 샘플 버퍼 x 5 µ L 2 (10 %SDS; 14 %0.5 M Tris HCl 용액, pH 6.7; 1 %0.5 M EDTA 2Na 재고 솔루션, pH 8.0; 20% 글리세롤; 0.004 %bromophenol 파랑 염료, 5% β-mercaptoethanol)와 10 분 동안 70 ° C에서 열.
- 두번째-트리 스 단백질 젤 4-12%에 샘플을 로드 하 고 150 V에 1 시간에 대 한 실행.
- 각 버퍼에 두꺼운 필터 종이 담근 다: (집중된 양극 버퍼: 0.3 M Tris HCl, 20% 메탄올; 양극 버퍼: 0.03 M Tris HCl, 20% 메탄올; 음극 버퍼: 25mm Tris, 20% 메탄올, 40mm 6-아미노-n-hexanoic 산, 0.01 %SDS).
- Polyvinylidene difluoride (PVDF) 막 20 메탄올에 담가 s, 양극 버퍼에 그것을 전송.
- 동요에서 5-10 분 동안 음극 버퍼를 가진 SDS-PAGE 후 젤 equilibrate.
- 다음과 같이 필터 종이, PVDF 막과 젤 세미 드라이 더 럽 히 기계에 배치: 집중 양극 버퍼 종이/양극 버퍼 종이/PVDF 막/단백질 젤/음극 버퍼 종이 (그림 2).
- 스택을 커버 하 고 30 분 동안 20 V에서 시작.
- 송금 후 린스 PBST와 PVDF 막 (0.05%와 PBS 트윈 20) 일단.
- 차단 막 5% 탈지 분유 PBST에서 해산에 30 분 동안 실내 온도에 또는 하룻밤에 4 ° C에서.
- 순화 마우스 안티 SMN 항 체와 5% 탈지 분유 PBST에 있는 1:10,000에 토끼 안티-Cofilin 항 체 희석. 하룻밤 실 온에서 또는 4 ° C에서 1 시간을 위해 그것에 막 품 어.
- PBST 3 시간 10 분 동안 씻어.
- 2 차 항 체 (HRP 활용 된 염소 반대로 마우스와 반대로 토끼 IgG (H + L)) 1:10,000에 PBST에 5% 탈지 분유를 희석. 어둠 속에서 실 온에서 1 h에 품 어.
- 3 시간 10 분 동안 PBST와 막 씻으십시오.
- 화학 서 부 더 럽 히 감지 키트를 사용 하 여 밴드 신호를 감지 합니다.
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Representative Results
우리 7 8 다른 센스 LNA/DNA mixmers 5 nM 농도 (그림 3)에서 페 했다를 가진 SMN2 유전자의 intron에서 ISS N1 소음 지역 대상 SMA 환자의 섬유 아 세포를 사용 하 여. mixmers의 각 포함 수정된 phosphorothioated 백본 nuclease 저하를 저항 하는 그들을 활성화. Mixmers, SMN2 exon의 속도의 효능을 평가 하기 위해 7 포함 RT-PCR 및 SMN2에 뇌관을 사용 하 여 정량 정량 했다. Exon transfection 동일한 복용량에서 mixmers #6-8을 이용 하는 동안 mixmers 환자 세포 (그림 4a, b)에 #1-5와 페 때 78-98%에서 배열 했다 7의 포함 효율에 비해 상당한 차이 발생 하지 않았다 컨트롤입니다. 결과 얻은 표시 하는 정량 분석에서 전체 길이 SMN2 mRNA 사본의 수량 mixmers #1-3 및 #5 치료 컨트롤그림 4(c)에 비해 크게 증가 했다.
또한, 서 부 럽의 결과 그 transfection mixmers를 사용 하 여 #1-5 사용된 높은 수준을 보여주었다 SMN 단백질 식의 환자 fibroblasts에 (1.5-a 컨트롤 그림 5에서 1.9-fold 증가). Mixmers #6-8을 사용 하 여 치료 셀에서 SMN 단백질 표정 수준에서 변화를 발생 하지 않았다. 이러한 데이터 보여 그 transfection LNA/DNA의 mixmers #1-5 유도 SMA 환자의 섬유 아 세포에 효율적으로 SMN2 exon 7 포함.
그림 1 : SMA 치료 antisense 중재 exon 포함 전략. (a) SMN2 의 exon 7에서에서 C-T 전환의 exon 7 SMN2 증명서의 약 90%에서 건너뛰는에 리드. 이러한 성적 프레임 밖 고는 빠르게 셀에 타락 한. 센스 oligonucleotides (AONs) intronic 접합 소음 기 N1 바인딩할 (ISS-N1)는 SMN2에 exon 포함 유도. Exon 7 포함 SMN2 mRNAs 기능 SMN 단백질을 생성할 수 있습니다. (b) RNA와 phosphorothioated LNA의 화학 구조. 우리가이 문서에서 사용 되는 mixmers의 전체 백본 저하를 방지 하기 위해 phosphorothioated 있습니다. Touznik에서이 그림 수정 되었습니다 et.al. 13. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 서쪽에 게 더 럽 히기 위한 세미 드라이 전송 방법. 두꺼운 필터 종이에 배어 집중 (Con.) 양극 버퍼, 양극 버퍼에 배어 두꺼운 필터 종이, PVDF 막, 젤 및 음극 버퍼에 배어 두꺼운 필터 종이 세미 드라이 기계를 더 럽 히의 2 개의 격판덮개 사이 누적. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : SMN2 exon 7 포함 LNA/DNA mixmer 순서. DNA 자료: G, A, T, C. LNA 베이스 (레드): G, + A, T, + C. Phosphorothioated DNA 기본: G *, A *, T *, C *. Phosphorothioated LNA 베이스 (레드): G *, A *, + T * + + C *. 이 그림은 Touznik에서 재현 et.al. 13. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : RT-PCR과 정량 LNA/DNA mixmers의 효능 평가의 대표적인 결과. Mixmers #1-5의 transfection SMN2 exon 7 포함 모의 transfection 보다 훨씬 더 높은 속도로 이끌어 낸다. (한) RT-PCR SMN2 및 GAPDH SMA 환자 fibroblasts 다음에 transfection 5 nM 농도에서. 탑 밴드: exon 7 포함 전체 길이 SMN2 mRNA. 하단 밴드: exon 7 제외 SMN2 mRNA. (b) SMN2 exon 7의 정량 분석 RT-PCR를 사용 하 여 mixmer 처리 SMA fibroblasts에 포함 합니다. 전체 길이 SMN2 GAPDH 하의 (c) 상대 식 분석 정량 Pcr를 사용 하 여 측정. 데이터 처리 비 제어 셀을 정상화 했다. 오차 막대는 평균 ± 표준 편차 (3 개의 독립적인 실험)를 나타냅니다. 일방통행 ANOVA Dunnett의 여러 비교 테스트와 함께 수행 되었다. M: 모의 제어, NT: 비-치료, h: 건강 한 제어 fibroblast 세포, b: 빈. 이 그림은 Touznik에서 재현 et.al. 13. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : SMN 단백질 식 측정을 서 부 럽의 대표적인 결과. LNA/DNA mixmers의 transfection는 SMN 단백질 생산을 증가 시킵니다. (SMN의 Cofilin (제어 로드) 건강 하 고 mixmer 처리 SMA 환자의 섬유 아 세포의 a) 서 부 럽. (b) 배 mixmer 처리 SMA fibroblasts SMN 단백질 수준의 증가. Mixmers #1-5 5 nM 농도에서 transfection는 상당히 SMN 단백질의 생산을 증가 시킵니다. 데이터 비 치료 SMA 섬유 아 세포에서 SMN/Cofilin의 비율을 정상화 했다. 평균 ± 표준 편차 (4 개의 독립적인 실험)를 나타내는 막대입니다. 일방통행 ANOVA Dunnett의 여러 비교 테스트와 함께 수행 되었다. M: 모의 제어, NT: 치료 비. 이 그림은 Touznik에서 재현 et.al. 13. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
생체 외에서 평가 여기 설명 된 방법은 빠르고, 쉽고, 충분히 다양 한 AONs의 테스트에 대 한 민감한입니다. 이 프로토콜은 엑손 스키 핑 및 다른 유전자와 다양 한 셀 형식에 널리 적용 됩니다. 또한, 대부분 이온 화학 (PMOs)를 제외 하 고이 메서드를 사용 하 여 페 수 있습니다. AONs 타겟된 유전자를 운반 하는 플라스 미드 벡터와 공동 transfected 수 그리고 사전-mRNA에서 생 하 고 인위적으로 도입 유전자의 접합 하는 것을 통제할 수 있다.
이 방법의 중요 한 단계는 셀 confluency 해야 약 65-80% AONs fibroblasts에 페는 때입니다. 이 조건은 다른 세포 유형 대 한 수 있습니다. Transfection에 대 한 최고의 AONs 농도 다른도 수 (0.5-100 nM), 대상된 시퀀스 및 셀 형식에 따라 다릅니다.
이 방법은 잠재적인 함정 없이 아니다. 예를 들어 mixmers의 효능 mixmers와 LNA/DNA 구성의 순서에 의해 결정 됩니다. ISS-N1, Lna 각 3 뉴클레오티드 위치에서 LNA에 대 한 대체 되 고 dna의 구성 되는 mixmer가 이었다 DNA 대체 모든 다른 뉴클레오티드 또는 모든 LNA oligonucleotide13에서와 동일한 순서를 가진 mixmer 보다 더 효과적 . 그러나,이 다른 대상 시퀀스에 대 한 달라질 수 있습니다. 따라서, 그것은 LNA/DNA mixmers의 시퀀스를 최적화 하 고 더 전에 RNA 수준에서 mixmers의 효능을 평가 하는 데 필요한. Mixmers의 전체 백본 저하를 방지 하기 위해 phosphorothioated 이어야 한다. 또한이 lipotransfection 중재 transfection 방법 대부분 이온 화학에 사용할 수 있습니다, 있지만 사용할 수 없습니다 충전 중립 phosphorodiamidate morpholino 올리고 (PMOs)에 대 한 lipotransfection 부정적인 필요 하므로 충전된 oligonucleotides입니다. PMO transfection 방법 다른23,,2425참조.
이 메서드는 소설 AONs를 테스트 하는 데 유용, SMA fibroblast 세포 모델 전체에서 vivo에서 조건 정리 하지 않습니다. 동물 모델 테스트는 vivo에서 효능과 안전26중요 한 원천이 될 수 있습니다.
Exon 건너뛰기/포함, PMO와 2 '-O-methoxyethyl 수정 (2' 모에) LNA/DNA mixmers,2728대신 사용할 수 있습니다. 그러나, transfection에 대 한 이러한 화학 물질의 최적 농도 일반적으로 훨씬 더 높은29,30. 다른 센스 화학에 비해 더 나은 효능 때문에 LNA/DNA mixmer 기반 센스 oligonucleotides의 사용 미래에 유전자 질환에 의해 발생 하는 접합 결함을 치료 하는 매력적인 치료 전략을 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자는 실험에 대 한 니콜 McRorie 감사합니다. 이 작품은 의학 및 치과, Slipchuk SMA 연구 재단 연구 그랜트, 캐나다 연구소의 건강 연구 (CIHR), 친구의 개렛 Cumming 연구 자금, HM Toupin Neurological의 앨버타의 대학 교수에 의해 지원 되었다 과학 연구 자금, 근 위축 증 캐나다, 혁신, 앨버타 기업 및 고급 교육 및 여 성과 어린이 건강 연구소 (WCHRI)를 위한 캐나다 기초.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SMA Fibroblasts | Coriell NIGMS human genetic cell repository | GM03813 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher | 11320033 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F1051 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher | 25300062 | |
| Serum-deprived media | Thermo Fisher | 31985070 | |
| Transfection reagent | Thermo Fisher | 15338100 | |
| guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform (TRIzol) | Thermo Fisher | 15596-018 | |
| RT-PCR Primers | Sequence 5' to 3' | ||
| SMN2 forward: | CTGCCTCCATTTCCTTCTG | ||
| SMN2 reverse: | TGGTGTCATTTAGTGCTGCTC | ||
| GAPDH forward: | TCCCTGAGCTGAACGGGAAG | ||
| GAPDH reverse: | GGAGGAGTTTGGTCGCTGT | ||
| qPCR Primers | |||
| full-length SMN2 forward: | GCTATCATACTGGCTATTATATGGGTTTT | ||
| full-length SMN2 reverse: | CTCTATGCCAGCATTTCTCCTTAAT | ||
| GAPDH forward: | GCAAATTCCATGGCACCGT | ||
| GAPDH reverse: | AGGGATCTCGCTCCTGGAA | ||
| Chloroform | Sigma-Aldrich | P3803 | |
| Glycogen, RNA grade | Thermo Fisher | R0551 | |
| ImageJ Software | |||
| Protease cocktail inhibitor | Roche | 11836153001 | |
| Cathode Buffer | 0.025 M Tris base + 40 mM 6-aminocaproic acid + 20% Methanol | ||
| Anode Buffer | 0.03 M Tris Base + 20% Methanol | ||
| Concentred Anode Buffer | 0.3 M Tris base + 20% Methanol | ||
| Beta Mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | |
| PVDF membrane | GE | 10600021 | |
| Loading/sample buffer for Western blotting | NuPage Invitrogen | NP007 | |
| One-Step RT-PCR kit | Qiagen | 210210 | |
| dNTPs | Clontech | 3040 |
References
- Iascone, D. M., Henderson, C. E., Lee, J. C. Spinal muscular atrophy: from tissue specificity to therapeutic strategies. F1000Prime Rep. 7, 4 (2015).
- Touznik, A., Lee, J. J., Yokota, T. New developments in exon skipping and splice modulation therapies for neuromuscular diseases. Expert Opin Biol Ther. 14 (6), 809-819 (2014).
- Lefebvre, S., et al. Identification and Characterization of a Spinal Muscular Atrophy-Determining Gene. Cell. 80 (1), 155-165 (1995).
- Lorson, C. L., Hahnen, E., Androphy, E. J., Wirth, B. A single nucleotide in the SMN gene regulates splicing and is responsible for spinal muscular atrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (11), 6307-6311 (1999).
- Monani, U. R., et al. A single nucleotide difference that alters splicing patterns distinguishes the SMA gene SMN1 from the copy gene SMN2. Hum Mol Genet. 8 (7), 1177-1183 (1999).
- Lee, J. J., Yokota, T. Antisense therapy in neurology. J Pers Med. 3 (3), 144-176 (2013).
- Aartsma-Rus, A. FDA Approval of Nusinersen for Spinal Muscular Atrophy Makes 2016 the Year of Splice Modulating Oligonucleotides. Nucleic Acid Ther. 27 (2), 67-69 (2017).
- Hua, Y., et al. Peripheral SMN restoration is essential for long-term rescue of a severe spinal muscular atrophy mouse model. Nature. 478 (7367), 123-126 (2011).
- Hua, Y., Vickers, T. A., Baker, B. F., Bennett, C. F., Krainer, A. R. Enhancement of SMN2 exon 7 inclusion by antisense oligonucleotides targeting the exon. PLoS Biol. 5 (4), 73 (2007).
- Passini, M. A., et al. Antisense oligonucleotides delivered to the mouse CNS ameliorate symptoms of severe spinal muscular atrophy. Sci Transl Med. 3 (72), (2011).
- Hammond, S. M., et al. Systemic peptide-mediated oligonucleotide therapy improves long-term survival in spinal muscular atrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (39), 10962-10967 (2016).
- Porensky, P. N., et al. A single administration of morpholino antisense oligomer rescues spinal muscular atrophy in mouse. Hum Mol Genet. 21 (7), 1625-1638 (2012).
- Touznik, A., Maruyama, R., Hosoki, K., Echigoya, Y., Yokota, T. LNA/DNA mixmer-based antisense oligonucleotides correct alternative splicing of the SMN2 gene and restore SMN protein expression in type 1 SMA fibroblasts. Sci Rep. 7 (1), 3672 (2017).
- Obika, S., et al. Synthesis of 2'-O,4'-C-methyleneuridine and -cytidine. Novel bicyclic nucleosides having a fixed C-3,-endo sugar puckering. Tetrahedron Letters. 38 (50), 8735-8738 (1997).
- Singh, S. K., Nielsen, P., Koshkin, A. A., Wengel, J. LNA (locked nucleic acids): synthesis and high-affinity nucleic acid recognition. Chemical Communications. (4), 455-456 (1998).
- Navarro, E., Serrano-Heras, G., Castano, M. J., Solera, J. Real-time PCR detection chemistry. Clin Chim Acta. 439, 231-250 (2015).
- Urbanek, M. O., Nawrocka, A. U., Krzyzosiak, W. J. Small RNA Detection by in Situ Hybridization Methods. Int J Mol Sci. 16 (6), 13259-13286 (2015).
- Wahlestedt, C., et al. Potent and nontoxic antisense oligonucleotides containing locked nucleic acids. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (10), 5633-5638 (2000).
- Rupaimoole, R., Slack, F. J. MicroRNA therapeutics: towards a new era for the management of cancer and other diseases. Nat Rev Drug Discov. 16 (3), 203-222 (2017).
- Lanford, R. E., et al. Therapeutic silencing of microRNA-122 in primates with chronic hepatitis C virus infection. Science. 327 (5962), 198-201 (2010).
- Shimo, T., Maruyama, R., Yokota, T. Designing Effective Antisense Oligonucleotides for Exon Skipping. Methods Mol Biol. 1687, 143-155 (2018).
- Shimo, T., et al. Design and evaluation of locked nucleic acid-based splice-switching oligonucleotides in vitro. Nucleic Acids Res. 42 (12), 8174-8187 (2014).
- Nguyen, Q., Yokota, T. Immortalized Muscle Cell Model to Test the Exon Skipping Efficacy for Duchenne Muscular Dystrophy. J. Pers. Med. 7 (4), 13 (2017).
- Echigoya, Y., et al. Quantitative Antisense Screening and Optimization for Exon 51 Skipping in Duchenne Muscular Dystrophy. Mol Ther. , (2017).
- Saito, T., et al. Antisense PMO found in dystrophic dog model was effective in cells from exon 7-deleted DMD patient. PLoS One. 5 (8), 12239 (2010).
- Donnelly, E. M., et al. Characterization of a murine model of SMA. Neurobiol Dis. 45 (3), 992-998 (2012).
- Lim, K. R., Maruyama, R., Yokota, T. Eteplirsen in the treatment of Duchenne muscular dystrophy. Drug Des Devel Ther. 11, 533-545 (2017).
- Paton, D. M. Nusinersen: antisense oligonucleotide to increase SMN protein production in spinal muscular atrophy. Drugs Today (Barc). 53 (6), 327-337 (2017).
- Prakash, T. P., et al. Comparing in vitro and in vivo activity of 2'-O-[2-(methylamino)-2-oxoethyl]- and 2'-O-methoxyethyl-modified antisense oligonucleotides. J Med Chem. 51 (9), 2766-2776 (2008).
- Aoki, Y., et al. Bodywide skipping of exons 45-55 in dystrophic mdx52 mice by systemic antisense delivery. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (34), 13763-13768 (2012).
