Summary
Forskellige antisense oligonukleotider (AONs) har vist sig at fremkalde exon integration (splice modulation) og redde SMN udtryk for spinal muskelatrofi (SMA). Her, beskriver vi en protokol for AON lipotransfection til at fremkalde exon integration i SMN2 gen og evalueringsmetoder for at fastlægge effekten i SMA patient fibroblaster.
Abstract
Spinal muskelatrofi (SMA), en dødelig neurologisk sygdom forårsaget af tabet af SMN1, præsenterer et enestående tilfælde i feltet af antisense oligonukleotid (AON)-medieret terapi. Mens SMN1 mutationer er ansvarlige for sygdommen, AONs målretning intronic splice lyddæmper (ISS) websteder i SMN2, herunder FDA-godkendte nusinersen, har vist sig at gendanne SMN udtryk og forbedre symptomerne. I øjeblikket, mange undersøgelser der involverer AON terapi for SMA fokuserer på at undersøge roman AON kemi målretning SMN2 der kan være mere effektiv og mindre giftige end nusinersen. Her, beskriver vi en protokol til in vitro- vurdering af exon integration ved hjælp af lipotransfection af AONs efterfulgt af reverse transkription polymerase kædereaktion (RT-PCR), kvantitative Polymerasekædereaktionen (qPCR) og Western blotting. Denne metode kan anvendes til forskellige typer af AON kemi. Brug denne metode, vi viser, at AONs består af skiftevis låst nukleinsyrer (LNAs) og DNA nukleotider (LNA/DNA mixmers) føre til effektiv SMN2 exon integration og restaurering af SMN protein på en meget lav koncentration, og derfor LNA / DNA mixmer-baserede antisense oligonukleotider kan være en attraktiv terapeutisk strategi til at behandle splejsning defekter forårsaget af genetiske sygdomme. In vitro- vurdering metoden beskrevet her er hurtig, nem og følsomme nok til afprøvning af forskellige roman AONs.
Introduction
Spinal muskelatrofi (SMA) er en dødelig neuromuskulær sygdom nedarvet i en autosomal recessiv mønster. Det er karakteriseret ved nedbrydning af motor neuroner og progressive trunk og lemmer muskel lammelse1,2. Flertal af SMA forekomster skyldes en homozygot mutation i overlevelse motor neuron 1 (SMN1) gen3. Overlevelse af motordrevne neuron 2 (SMN2) genet er en invers dublet af SMN1, og har en næsten identisk sekvens afviger kun fem baser4,5. C til T overgang i SMN2 beliggende i exon 7 gør genet næsten nonfunctional, fordi mutationen fører til den væsentlige exon 7 udelukkes i næsten 90% af SMN2 udskrifter (figur 1en). SMN2 mRNAs mangler exon 7 kan ikke kompensere for funktionen SMN1 fordi dens protein produkt er ustabil og hurtigt nedbrydes.
Antisense terapi for nylig vist sig som en meget lovende strategi for behandling af SMA6. Den nylige godkendelse af nusinersen af den amerikanske Food and Drug Administration (FDA) gjorde det det første lægemiddel til behandling af SMA7. Nusinersen er en 18-mer antisense oligonukleotid (AON) med en 2 '-O-methoxyethyl ændring (MOE) og en phosphorothioate rygrad. Stoffet er rettet mod den intronic splejsning lyddæmper N1 (ISS-N1) beliggende i intron 7 af SMN2 gen. Bindingen af nusinersen til ISS-N1 fremmer inddrivelse af funktionelle fuld længde SMN protein udtryk fra det endogene SMN2 gen ved at inducere exon 7 integration (figur 1en)8,9,10 . I øjeblikket, mange undersøgelser der involverer AON terapi for SMA fokuserer på at undersøge roman AON kemi, der kan være mere effektiv og mindre giftige end nusinersen. Det er blevet påvist, at AONs med andre kemi også effektivt fremkalde exon integration i SMN2 exon 7 både in vitro- og i vivo11,12,13.
Låst nukleinsyrer (LNAs) er kemisk modificerede RNA analoger indeholdende methylen bro forbinder 4′ -Carbon med 2′ -ilt inden for furanose struktur (figur 1b)14,15. Sammenlignet med DNAs eller RNA'er, LNAs har en øget affinitet for binding til komplementær RNA sekvenser og har den ekstra fordel af at være meget modstandsdygtige over for endogene nukleaser. LNA kemi er blevet anvendt til brug som sonder til fluorescens i situ hybridisering (FISH) og i qPCR16,17. Også, det er udnyttet til at regulere genekspression både in vitro- og in vivo. GapmeR AONs er en kombination af enkeltstrenget DNA molekyler flankeret af flere LNAs 5 ' og 3 ' enden. De banke ned Gen-ekspression af bindende supplement til målrettede mRNAs, forårsager dem til at blive nedbrudt af den aktiverede RNase H18. LNA/DNA mixmers er AONs, der består af DNA nukleotider integreret i mellem LNAs. Præsenteret i denne orientering kan de binde miRNA at hæmme dets funktion (LNA-antimiR)19. Nogle LNA-antimiRs har nået kliniske udvikling. For eksempler, miravirsen (AntimiR-122) er en LNA-antimiR, der hæmmer miR-122 til behandling af hepatitis C-infektion og flere fase II kliniske forsøg er igangværende19,20. Det er for nylig påvist, at LNA/DNA mixmers også kan modulere RNA-splicing21. Det kan binde en bestemt sekvens af mRNA og fremkalde exon springe i dystrophin mRNA og exon optagelse i SMN2 mRNA in vitro-13,22.
I denne artikel vil skitsere vi en metode til induktion af exon integration ved hjælp af AONs og evalueringen af effekten på RNA og protein niveau. For at eksemplificere denne metode, brugte vi LNA/DNA mixmers rettet mod ISS-N1 i intron 7 af SMN2. AONs transfekteret i SMA patientens celler af lipotransfection induceret exon 7 integration i den endelige SMN2 udskrift og opregulering af SMN protein produktion. En af fordelene ved at bruge LNA/DNA mixmers til at fremkalde exon integration er, at den effektive koncentration af Transfektion er betydeligt lavere end andre kemi13. Denne metode kan bruges til mange andre AONs bortset fra phosphorodiamidate morpholino oligomerer (projektstyringskontorer), som på grund af deres neutral afgift, skal indtaste celler gennem endocytose induceret af Endo-Porter Co Transfektion reagens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. cellekultur
- Kultur SMA patient fibroblaster i vækstmediet (Dulbeccos modificerede Eagle medium 1: 1 F-12 (skinke) med 10% føtal bovint serum (FBS) og 0,5% penicillin/streptomycin) i en CO2 inkubator ved 37 ° C.
- Bestemmelse af celle koncentration ved hjælp af en automatiseret celle counter og fortyndes celler til 1 x 105 celler/mL i vækstmediet, så frø på en passende tallerken. Bruge 12-godt plader (1 mL pr. brønd) til RT-PCR eller qPCR.
- Inkuber plader til 24 h i en CO2 inkubator ved 37 ° C.
2. LNA/DNA mixmer Transfektion
- Sikre celle confluency på omkring 65-80% for optimal Transfektion effektivitet.
- Tø 10 μM LNA/DNA mixmers langsomt på is.
- En 1,5 mL tube, udarbejde en 20 x mixmer løsning ved at tilføje mixmers serum-berøvet media således at det endelige rumfang når 50 μL.
- Bland mixmer løsning med 50 μL serum-berøvet medier indeholdende 3% Transfektion reagens (1:1 ratio).
- Der inkuberes i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Tilføje 900 μl serum-berøvet medium med 5% FBS til hver tube.
- Opsug den gamle medier fra pladen og erstatte med 1 mL LNA/DNA mixmer løsning indeholdende Transfektion reagens.
- Inkuber celler i 24-48 timer ved 37 ° C i en CO2 inkubator.
3. RNA udvinding
- Fjern mediet og tilsættes 1 mL guanidinium kaliumthiocyanat-phenol-chloroform reagens til cellerne. Vaske bunden af de godt flere gange med guanidinium kaliumthiocyanat-phenol-chloroform og samle det i 1,5 mL rør.
- Vortex ved høj hastighed til 30 s og opbevares ved-80 ° C i 1 time eller natten over.
- Tø prøverne ved stuetemperatur og vortex godt.
- Tilføje 200 µL chloroform, rystes kraftigt for 15 s, og der inkuberes ved stuetemperatur i 3 min.
- Der centrifugeres ved 12.000 x g i 15 min. ved 4 ° C.
- Saml top klar vandig fase i en ny tube. Sørg for at undgå indsamling af nogen af de hvide interfase, der danner mellem de øvre og nedre faser.
- Tilsættes 500 µL isopropanol og 1 µL 8 µg/µL glykogen (RNA grade). Vortex for 10 s og inkuberes ved stuetemperatur i 10 min. eller ved-20 ° C natten over.
- Der centrifugeres ved 12.000 x g i 10 min. ved 4 ° C og fjern alle supernatant. En hvid pellet vil danne på bunden af røret.
- Tilsæt 1 mL koldt 75% ethanol og centrifugeres ved 7.500 x g i 5 min. ved 4 ° C.
- Fjerne alle ethanol og tørre pellet ved stuetemperatur indtil ingen ethanol er tilbage i røret.
- Opløse pellet i 30 µL DNase/RNase gratis vand, og der inkuberes i 10 min. ved 60 ° C.
- Måle RNA koncentration ved hjælp af et spektrofotometer (på 260 nm), og justere RNA koncentration til 50 ng/µL.
4. et skridt RT-PCR til at måle exon optagelse sats af SMN2
- Mix 12,5 µL af 2 x RT-PCR reaktion buffer, 1,0 µL af one-step RT-PCR enzym mix, 0,5 µL af hver primer (SMN2 frem: 5'-CTGCCTCCATTTCCTTCTG-3', SMN2 omvendt: 5'-TGGTGTCATTTAGTGCTGCTC-3', GAPDH frem: 5'-TCCCTGAGCTGAACGGGAAG-3', GAPDH omvendt: 5'-GGAGGAGTTTGGTCGCTGT-3', 2 µL af total RNA (50 ng/µL), og 8,5 µL af RNase/DNase-frit destilleret vand.
- Efter cDNA er syntetiseret ved 50 ° C i 15 min, starte PCR reaktionen. Forstærke SMN2 exon 6-8 med 30 PCR cyklusser (94 ° C i 15 s, 60 ° C i 30 s, 68 ° C til 25 s). Forstærke GAPDH med 20 PCR cyklusser (94 ° C i 15 s, 60 ° C i 30 s, 68 ° C til 20 s).
- Tilsættes 5 μl 6 x lastning farvestof til PCR-produkt, og indlæse 5 µL af blandingen i en 2%-agarosegel og køre i 40 min. ved 100 V.
- Billede gel og analysere det bruger ImageJ software.
- Mål intensiteten af fuld længde bands og Δ7 bands. Beregne antallet af exon 7 integration af intensitetsværdien af (fuld længde) / (fuld længde + Δ7 SMN2).
5. kvantitativ PCR (qPCR) til at måle exon optagelse sats af SMN2
- For cDNA syntese, Bland 1 µL Oligo dT, 1 µL 10 mM dNTP'er og 11 µL total RNA (50 ng/µL). Der inkuberes ved 65 ° C i 5 min.
- Prøveemner på isen og tilføje 4 µL 5 x buffer, 1 µL 0,1 M DTT, 1 µL RNase inhibitor og 1 µL reverse transkriptase til hver prøve.
- Der inkuberes ved 50 ° C i 60 min, og varme op til 80 ° C i 10 min at stoppe reaktionen. CDNA kan opbevares ved-20 ° C.
- Fortynd cDNAs med RNase-fri vand (1:5 fortynding). Mix 10 µL 2 x SYBR Green qPCR enzym mix, 0,8 µL 10 µM primer (fuld længde SMN2 frem: 5 '-GCTATCATACTGGCTATTATATGGGTTTT-3 ', fuld længde SMN2 omvendt: 5 '-CTCTATGCCAGCATTTCTCCTTAAT-3′, Δ7 SMN2 frem: 5 ' - TCTGGACCACCAATAATTCCCC-3′, Δ7 SMN2 omvendt: 5 '-ATGCCAGCATTTCCATATAATAGCC-3′, GAPDH frem: 5 '-GCAAATTCCATGGCACCGT-3 ' GAPDH omvendt: 5 '-AGGGATCTCGCTCCTGGAA-3 '), 3 µL fortyndet cDNA og 5.4 µL RNase-fri vand.
- Start qPCR reaktion. Brug betingelserne: 95 ° C til 30 s, så en 40 cyklus gentager ved 95 ° C til 5 s og 60 ° C i 20 s.
- Beregne den relative udtryk for fuld længde SMN2 til GAPDH eller Δ7 SMN2og normalisere de ubehandlede celler med ΔΔCt algoritme.
6. Western blotting
- Fjern Transfektion medium fra celler og vask med fosfatbufferet saltopløsning (PBS) én gang.
- Tilsæt 100 µL lysisbuffer med en protease hæmmer.
- Frigør celler fra bunden af hver brønd ved hjælp af en steril celle skraber, og indsamler i 1,5 mL rør. Inkuber prøver på is i 30 min.
- Igennem celle lysate 21-G nål 10 gange til at knuse cellerne.
- Der centrifugeres ved 20.800 x g i 15 min. ved 4 ° C og indsamle supernatanten til nye 1,5 mL rør. Prøven kan opbevares i et-80 ° C dybfryser.
- Bestemme proteinkoncentration ved hjælp af en BCA Protein Assay Kit, og justere koncentrationen til 1,0 µg/µL.
- Mix 5 µL prøver og 5 µL 2 x sodium dodecyl sulfat (SDS) prøvebuffer (10% SDS; 14% 0,5 M Tris-HCl løsning, pH 6.7; 1% 0,5 M EDTA-2Na stamopløsning, pH 8,0; 20% Glycerol; 0,004% bromophenol blå farvestof, 5% β-mercaptoethanol) og varme ved 70 ° C i 10 min.
- Indlæse prøverne i en 4-12% Bis-Tris Protein geler og køre i 1 time ved 150 V.
- Sættetid en tyk filterpapir i hver buffer: (koncentreret anode buffer: 0,3 M Tris-HCl, 20% methanol; anode buffer: 0,03 M Tris-HCl, 20% methanol; katode buffer: 25 mM Tris, 20% methanol, 40 mM 6-amino-n-hexanoic syre, 0,01% SDS).
- Nyd en polyvinylidene xenondifluorid (PVDF) membran i methanol til 20 s, derefter overføre det til anoden buffer.
- Reagensglasset gel efter SDS-PAGE med katode buffer i 5-10 min. under omrøring.
- Placer papirfiltre, PVDF membraner og gelen på en semi-tør blotting maskine, som følger: koncentreret anode buffer papir/anode buffer papir/PVDF membran/protein gel/katode buffer papir (figur 2).
- Dække stakken og starte overførslen på 20 V i 30 min.
- Efter overførslen, skyl PVDF membran med PBST (PBS med 0,05% Tween 20) når.
- Blokere membran ved stuetemperatur i 30 min i 5% skummetmælk pulver opløses i i PBST eller ved 4 ° C for natten.
- Fortynde en renset musen anti-SMN antistof og en kanin anti-Cofilin antistof mod 1:10,000 i 5% skummetmælk pulver i PBST. Inkuber membran i det i 1 time ved stuetemperatur eller ved 4 ° C natten over.
- Vask 3 gange med PBST i 10 min.
- Fortynd sekundære antistoffer (HRP-konjugerede ged anti-mus og anti-kanin IgG (H + L)) til 1:10,000 i 5% skummetmælk pulver i PBST. Inkuber i 1 time ved stuetemperatur i mørke.
- Vask membran 3 gange med PBST i 10 min.
- Registrere band signal ved hjælp af kemiluminescens Western blotting detection kit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjælp af SMA patient fibroblaster, målrettet vi regionen ISS-N1 lyddæmper i intron 7 af SMN2 gen med otte forskellige antisense LNA/DNA mixmers, der var transfekteret på en 5 nM koncentrationen (figur 3). Hver af mixmers indeholdt en modificeret phosphorothioated rygrad, som gjorde det muligt at modstå nukleasen nedbrydning. For at vurdere effekten af mixmers, antallet af SMN2 exon var 7 integration kvantificeret af RT-PCR og qPCR ved hjælp af primere specifikke for SMN2. Inklusion effektiviteten af exon 7 varierede fra 78-98% når transfekteret med mixmers #1-5 i patientens celler (figur 4a, b), mens Transfektion udnytter mixmers #6-8 på den samme dosis resulterede ikke i nogen væsentlig forskel i forhold til kontrolelementet. Resultaterne opnået fra qPCR analyse vises også som mængden af fuld længde SMN2 mRNA udskrift blev væsentligt forøget ved mixmers #1-3 og #5 behandlinger i forhold til kontrol (fig. 4c).
Desuden resultatet af den Western blotting viste at Transfektion ved hjælp af mixmers #1-5 aktiveret højere niveauer af SMN protein udtryk i de patient fibroblaster (en 1,5 - 1.9-fold stigningen fra kontrolelementet, figur 5). Behandlinger med mixmers #6-8 ikke resultere i en ændring af SMN protein udtryk niveau i cellerne. Disse data viser, at Transfektion af LNA-DNA mixmers #1-5 inducerer SMN2 exon 7 integration effektivt i SMA patient fibroblaster.
Figur 1 : Antisensstoffer-medieret exon integrationsstrategi til behandling af SMA. a C til T overgang i exon 7 SMN2 fører til overspringelse af exon 7 i ca 90% af SMN2 udskrifter. Disse udskrifter er ud af rammen og er hurtigt nedbrydes i cellerne. Antisense oligonukleotider (AONs) bindes intronic splejsning lyddæmperen N1 (ISS-N1), som inducerer exon integration i SMN2. Exon 7-inkluderet SMN2 mRNAs kan producere funktionelle SMN protein. (b) kemiske strukturer af RNA og phosphorothioated LNA. De hele backbones af den mixmers, vi brugte i denne artikel er phosphorothioated at forhindre nedbrydning. Dette tal er blevet ændret fra Touznik et.al. 13. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Halvtør overførselsmetode for Western blotting. En tyk filtrerpapir gennemblødt koncentreret (Con.) Anode buffer, en tyk filtrerpapir gennemblødt i Anode buffer, en PVDF membran, en gel og en tyk filtrerpapir gennemblødt i katode buffer er stablet mellem de to plader af en halvtør blotting maskine. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : LNA/DNA mixmer sekvens for SMN2 exon 7 integration. DNA base: G, A, T, C. LNA base (red): + G + A, T + C. Phosphorothioated DNA base: G *, A *, T *, C *. Phosphorothioated LNA base (red): + G *, + A *, + T *, + C *. Denne figur er gengivet fra Touznik et.al. 13. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Repræsentative resultater af RT-PCR og qPCR at evaluere effekten af LNA/DNA-mixmers. Transfektion af mixmers #1-5 medfører SMN2 exon 7 integration på et betydeligt højere sats end den forlorne Transfektion. (en) RT-PCR af SMN2 og GAPDH i SMA patient fibroblaster efter Transfektion på 5 nM koncentration. Top band: exon 7-inkluderet fuld længde SMN2 mRNA. Bunden band: exon 7-udelukket SMN2 mRNA. (b) kvantitativ analyse af SMN2 exon 7 integration i mixmer-behandlet SMA fibroblaster ved hjælp af RT-PCR. (c) Relative udtryk analyse af fuld længde SMN2 til GAPDH målt ved hjælp af qPCR. Dataene blev normaliseret til ubehandlede kontrol celler. Fejllinjer udgør gennemsnit ± standardafvigelse (tre uafhængige forsøg). En-vejs ANOVA med Dunnetts flere sammenligning test blev udført. M: mock kontrol, NT: ubehandlede, H: sund kontrol fibroblast celler, B: Tom. Denne figur er gengivet fra Touznik et.al. 13. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Repræsentative resultater af Western blotting for at måle SMN protein udtryk. Transfektion af LNA/DNA-mixmers øger SMN protein produktion. a Western blotting SMN og Cofilin (lastning kontrol) af sunde og mixmer-behandlet SMA patient fibroblaster. b fold stigning i SMN protein niveauer af mixmer-behandlet SMA fibroblaster. Transfektion af mixmers #1-5 på 5 nM koncentration øger produktionen af SMN protein. Dataene blev normaliseret til forholdet mellem SMN/Cofilin i ikke-behandlet SMA fibroblaster. Søjler repræsenterer gennemsnit ± standardafvigelse (fire uafhængige forsøg). En-vejs ANOVA med Dunnetts flere sammenligning test blev udført. M: mock kontrol, NT: ubehandlede. Denne figur er gengivet fra Touznik et.al. 13. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In vitro- vurdering metoden beskrevet her er hurtig, nem og følsomme nok til afprøvning af forskellige AONs. Denne protokol er almindeligt gældende exon overspringelse og inddragelse af andre gener og forskellige celletyper. Desuden kan de fleste AON kemi (undtagen projektstyringskontorer) være transfekteret ved hjælp af denne metode. AONs kan regulere splejsning af pre-mRNA fra både endogene og kunstigt indførte gener, og kan være co transfected med plasmid vektorer transporterer målrettede gener.
Et kritisk trin i denne metode er, at celle confluency bør være omkring 65-80% når AONs er transfekteret i fibroblaster. Denne betingelse kan være anderledes for andre celletyper. Den bedste koncentration af AONs for Transfektion kan også være forskellige (0,5 - 100 nM), afhængigt af målrettede sekvenser og celletyper.
Denne metode er ikke uden potentielle faldgruber. For eksempel, bestemmes effekten af mixmers af sekvenser af mixmers og LNA/DNA-sammensætning. For ISS-N1 var en mixmer, som er sammensat af LNAs med DNA bliver erstatte LNA på hver tredje nukleotid holdning, mere effektiv end en mixmer med en tilsvarende sekvens med DNA substitution på hver andre nukleotid eller all-LNA oligonukleotid13 . Dette kan dog være anderledes for andre mål sekvenser. Det er derfor nødvendigt at optimere sekvenser af LNA/DNA mixmers og evaluere effekten af mixmers på RNA niveau før du går videre. De hele backbones af mixmers skal være phosphorothioated til at forhindre nedbrydning. Derudover selv om denne lipotransfection-medieret Transfektion metode kan bruges til de fleste AON kemi, det kan ikke bruges til opladning-neutral phosphorodiamidate morpholino oligomerer (projektstyringskontorer), da lipotransfection kræver negativt opladet oligonukleotider. For PMO Transfektion metoder, se andetsteds23,24,25.
Selvom denne metode er nyttig ved afprøvning af roman AONs, SMA fibroblast celle model ikke sammenfatte i vivo betingelser i sin helhed. Dyremodeller kan tjene som en vigtig kilde til at teste i vivo effekten og sikkerheden26.
For exon spring integration, kan PMO og 2 '-O-methoxyethyl ændring (2' MOE) bruges i stedet for LNA/DNA mixmers27,28. Men den optimale koncentration af disse kemi for Transfektion er typisk meget højere29,30. På grund af den bedre effektivitet sammenlignet med andre antisense kemi, kan anvendelse af LNA/DNA mixmer-baserede antisense oligonukleotider være en attraktiv terapeutisk strategi til at behandle splejsning defekter forårsaget af genetiske sygdomme i fremtiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne takke Nicole McRorie hjælp til eksperimenter. Dette arbejde blev støttet af University of Alberta fakultetet for medicin og tandpleje, Slipchuk SMA Research Foundation forskning Grant, den canadiske institutter for sundhed Research (CIHR), venner af Garrett Cumming forskningsmidler, HM Toupin Neurological Videnskab forskningsmidler, Canadas muskelsvind, Canada Foundation for Innovation, Alberta Enterprise og avanceret uddannelse, og kvinder og børns sundhed Research Institute (WCHRI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SMA Fibroblasts | Coriell NIGMS human genetic cell repository | GM03813 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher | 11320033 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F1051 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher | 25300062 | |
| Serum-deprived media | Thermo Fisher | 31985070 | |
| Transfection reagent | Thermo Fisher | 15338100 | |
| guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform (TRIzol) | Thermo Fisher | 15596-018 | |
| RT-PCR Primers | Sequence 5' to 3' | ||
| SMN2 forward: | CTGCCTCCATTTCCTTCTG | ||
| SMN2 reverse: | TGGTGTCATTTAGTGCTGCTC | ||
| GAPDH forward: | TCCCTGAGCTGAACGGGAAG | ||
| GAPDH reverse: | GGAGGAGTTTGGTCGCTGT | ||
| qPCR Primers | |||
| full-length SMN2 forward: | GCTATCATACTGGCTATTATATGGGTTTT | ||
| full-length SMN2 reverse: | CTCTATGCCAGCATTTCTCCTTAAT | ||
| GAPDH forward: | GCAAATTCCATGGCACCGT | ||
| GAPDH reverse: | AGGGATCTCGCTCCTGGAA | ||
| Chloroform | Sigma-Aldrich | P3803 | |
| Glycogen, RNA grade | Thermo Fisher | R0551 | |
| ImageJ Software | |||
| Protease cocktail inhibitor | Roche | 11836153001 | |
| Cathode Buffer | 0.025 M Tris base + 40 mM 6-aminocaproic acid + 20% Methanol | ||
| Anode Buffer | 0.03 M Tris Base + 20% Methanol | ||
| Concentred Anode Buffer | 0.3 M Tris base + 20% Methanol | ||
| Beta Mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | |
| PVDF membrane | GE | 10600021 | |
| Loading/sample buffer for Western blotting | NuPage Invitrogen | NP007 | |
| One-Step RT-PCR kit | Qiagen | 210210 | |
| dNTPs | Clontech | 3040 |
References
- Iascone, D. M., Henderson, C. E., Lee, J. C. Spinal muscular atrophy: from tissue specificity to therapeutic strategies. F1000Prime Rep. 7, 4 (2015).
- Touznik, A., Lee, J. J., Yokota, T. New developments in exon skipping and splice modulation therapies for neuromuscular diseases. Expert Opin Biol Ther. 14 (6), 809-819 (2014).
- Lefebvre, S., et al. Identification and Characterization of a Spinal Muscular Atrophy-Determining Gene. Cell. 80 (1), 155-165 (1995).
- Lorson, C. L., Hahnen, E., Androphy, E. J., Wirth, B. A single nucleotide in the SMN gene regulates splicing and is responsible for spinal muscular atrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (11), 6307-6311 (1999).
- Monani, U. R., et al. A single nucleotide difference that alters splicing patterns distinguishes the SMA gene SMN1 from the copy gene SMN2. Hum Mol Genet. 8 (7), 1177-1183 (1999).
- Lee, J. J., Yokota, T. Antisense therapy in neurology. J Pers Med. 3 (3), 144-176 (2013).
- Aartsma-Rus, A. FDA Approval of Nusinersen for Spinal Muscular Atrophy Makes 2016 the Year of Splice Modulating Oligonucleotides. Nucleic Acid Ther. 27 (2), 67-69 (2017).
- Hua, Y., et al. Peripheral SMN restoration is essential for long-term rescue of a severe spinal muscular atrophy mouse model. Nature. 478 (7367), 123-126 (2011).
- Hua, Y., Vickers, T. A., Baker, B. F., Bennett, C. F., Krainer, A. R. Enhancement of SMN2 exon 7 inclusion by antisense oligonucleotides targeting the exon. PLoS Biol. 5 (4), 73 (2007).
- Passini, M. A., et al. Antisense oligonucleotides delivered to the mouse CNS ameliorate symptoms of severe spinal muscular atrophy. Sci Transl Med. 3 (72), (2011).
- Hammond, S. M., et al. Systemic peptide-mediated oligonucleotide therapy improves long-term survival in spinal muscular atrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (39), 10962-10967 (2016).
- Porensky, P. N., et al. A single administration of morpholino antisense oligomer rescues spinal muscular atrophy in mouse. Hum Mol Genet. 21 (7), 1625-1638 (2012).
- Touznik, A., Maruyama, R., Hosoki, K., Echigoya, Y., Yokota, T. LNA/DNA mixmer-based antisense oligonucleotides correct alternative splicing of the SMN2 gene and restore SMN protein expression in type 1 SMA fibroblasts. Sci Rep. 7 (1), 3672 (2017).
- Obika, S., et al. Synthesis of 2'-O,4'-C-methyleneuridine and -cytidine. Novel bicyclic nucleosides having a fixed C-3,-endo sugar puckering. Tetrahedron Letters. 38 (50), 8735-8738 (1997).
- Singh, S. K., Nielsen, P., Koshkin, A. A., Wengel, J. LNA (locked nucleic acids): synthesis and high-affinity nucleic acid recognition. Chemical Communications. (4), 455-456 (1998).
- Navarro, E., Serrano-Heras, G., Castano, M. J., Solera, J. Real-time PCR detection chemistry. Clin Chim Acta. 439, 231-250 (2015).
- Urbanek, M. O., Nawrocka, A. U., Krzyzosiak, W. J. Small RNA Detection by in Situ Hybridization Methods. Int J Mol Sci. 16 (6), 13259-13286 (2015).
- Wahlestedt, C., et al. Potent and nontoxic antisense oligonucleotides containing locked nucleic acids. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (10), 5633-5638 (2000).
- Rupaimoole, R., Slack, F. J. MicroRNA therapeutics: towards a new era for the management of cancer and other diseases. Nat Rev Drug Discov. 16 (3), 203-222 (2017).
- Lanford, R. E., et al. Therapeutic silencing of microRNA-122 in primates with chronic hepatitis C virus infection. Science. 327 (5962), 198-201 (2010).
- Shimo, T., Maruyama, R., Yokota, T. Designing Effective Antisense Oligonucleotides for Exon Skipping. Methods Mol Biol. 1687, 143-155 (2018).
- Shimo, T., et al. Design and evaluation of locked nucleic acid-based splice-switching oligonucleotides in vitro. Nucleic Acids Res. 42 (12), 8174-8187 (2014).
- Nguyen, Q., Yokota, T. Immortalized Muscle Cell Model to Test the Exon Skipping Efficacy for Duchenne Muscular Dystrophy. J. Pers. Med. 7 (4), 13 (2017).
- Echigoya, Y., et al. Quantitative Antisense Screening and Optimization for Exon 51 Skipping in Duchenne Muscular Dystrophy. Mol Ther. , (2017).
- Saito, T., et al. Antisense PMO found in dystrophic dog model was effective in cells from exon 7-deleted DMD patient. PLoS One. 5 (8), 12239 (2010).
- Donnelly, E. M., et al. Characterization of a murine model of SMA. Neurobiol Dis. 45 (3), 992-998 (2012).
- Lim, K. R., Maruyama, R., Yokota, T. Eteplirsen in the treatment of Duchenne muscular dystrophy. Drug Des Devel Ther. 11, 533-545 (2017).
- Paton, D. M. Nusinersen: antisense oligonucleotide to increase SMN protein production in spinal muscular atrophy. Drugs Today (Barc). 53 (6), 327-337 (2017).
- Prakash, T. P., et al. Comparing in vitro and in vivo activity of 2'-O-[2-(methylamino)-2-oxoethyl]- and 2'-O-methoxyethyl-modified antisense oligonucleotides. J Med Chem. 51 (9), 2766-2776 (2008).
- Aoki, Y., et al. Bodywide skipping of exons 45-55 in dystrophic mdx52 mice by systemic antisense delivery. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (34), 13763-13768 (2012).
