Summary
Vi præsenterer her, en protokol for at generere en menneskelig lever kimære musemodel af familiær hyperkolesterolæmi ved hjælp af menneskelige inducerede pluripotente stamceller-afledt hepatocytter. Dette er en værdifuld model til at teste nye behandlinger for hyperkolesterolæmi.
Abstract
Familiær hyperkolesterolæmi (FH) er for det meste forårsaget af low-density lipoprotein receptor (LDLR) mutationer og resulterer i en øget risiko for tidlig debut hjerte-kar-sygdom på grund af markant forhøjede LDL kolesterol (LDL-C) i blodet. Statiner er den første linje af lipid-sænkende medicin til behandling af FH og andre typer af hyperkolesterolæmi, men nye tiltag er på vej, i særlige PCSK9 antistoffer, som er nu ved at blive testet i kliniske forsøg. For at udforske nye terapeutiske tilgange til FH, enten nye lægemidler eller nye formuleringer, har brug for vi passende i vivo modeller. Men forskelle i lipid metaboliske profiler i forhold til mennesker er et centralt problem i de tilgængelige dyremodeller for FH. For at løse dette problem, vi har genereret en menneskelig lever kimære musemodel ved hjælp af FH induceret pluripotente stamceller (iPSC)-afledt hepatocytter (iHeps). Vi brugte/Ldlr- / -/Rag2- / -/Il2rg- / - (LRG) mus undgå immun afvisning af transplanterede menneskelige celler og vurdere effekten af LDLR-mangelfuld iHeps i en LDLR null baggrund. Transplanterede FH iHeps kunne repopulate 5-10% af LRG mus leveren baseret på human albumin farvning. Desuden, den aflægger iHeps reagerede lipid-sænkende stoffer og sammenfattet kliniske observationer af øget effektivitet af PCSK9 antistoffer i forhold til statiner. Vores menneskelige lever kimære model kunne således være nyttige for præklinisk afprøvning af nye behandlinger til FH. Ved hjælp af samme protokol, lignende menneskelige lever kimære Mus for andre FH genetiske varianter, eller mutationer svarende til andre arvelige leversygdomme, kan også blive genereret.
Introduction
Low-density lipoprotein receptor (LDLR) fanger LDL kolesterol (LDL-C) i blodet til at modulere kolesterol syntese i leveren. Mutationer i LDLR genet er den hyppigste årsag til familiær hyperkolesterolæmi (FH)1. Statiner har traditionelt været den første linje af medicin til behandling af FH og andre typer af hyperkolesterolæmi (arvet eller erhvervet). Statiner hæmme 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzym en reduktase til at sænke kolesterol syntese i leveren2. Derudover øge statiner LDLR niveauet på hepatocyt overflade til at fremme plasma LDL-C clearance. En større advarsel af behandling med statiner er dog at de samtidig inducerer udtryk af proprotein convertase subtilisin/hexin 9 (PCSK9), et enzym, der binder sig til LDLR at fremme dets nedbrydning3. Denne effekt er ansvarlig for den utilstrækkelige eller endda null svar på statiner observeret i mange patienter. At studere denne mekanisme har, uventet, førte til opdagelsen af en alternativ metode til behandling af hyperkolesterolæmi. PCSK9 antistoffer for nylig godkendt af FDA i øjeblikket bliver brugt i kliniske forsøg og vise højere effektivitet og bedre tolerance end statiner4. Succesen af PCSK9 antistoffer indebærer også, at der kan være andre terapeutiske muligheder til at modulere LDLR Nedbrydningsvejen (udover PCSK9) hos patienter med hyperkolesterolæmi. Tilsvarende er der interesse i at udvikle nye hæmmere af PCSK9 end antistoffer, eksempelvis siRNA oligos5.
For at teste nye behandlinger for FH og generelt enhver anden type af hyperkolesterolæmi, er passende i vivo modeller nødvendige. Et stort problem for nuværende i vivo modeller, for det meste mus6 og kaniner7, er deres fysiologiske forskelle med mennesker. Afgørende, omfatter disse problemer en forskellige metaboliske lipidprofilen. Generation af menneskelige lever kimære dyr8 kan hjælpe med at overvinde denne advarsel. Den menneskelige lever kimære Mus er en form for "humaniseret" mus med sin leveren genbefolket med humane hepatocytter, for eksempel, primære humane hepatocytter (pHH)9. Et problem med pHH er, at de ikke kan være udvidet ex vivo, hurtigt mister deres funktion på isolation, og er en begrænset kilde. Et alternativ til pHH er brug af induceret pluripotente stamceller (iPSC)-afledt hepatocytter (iHeps)10. Især, iPSCs er patient-specifikke og kan dyrkes på ubestemt tid, så iHeps kan være fremstillet på efterspørgslen, hvilket er en betydelig fordel over frisk pHH. Desuden kan iPSCs også være let genetisk manipuleret med designer nukleaser at korrigere eller indføre mutationer i en isogene baggrund at tillade mere trofaste sammenligninger11.
Menneskelige lever kimære Mus med aflægger pHH udviser ligheder til mennesker i leveren metaboliske profiler, drug svar og modtagelighed for hepatitis virus infektion12. Dette gør dem en god model til at studere hyperlipidæmi i vivo. De mest udbredte musemodeller er baseret på/Fah- / -/Rag2- / -/Il2rg- / - (FRG) mus13 og den uPA Transgene mus8, i hvilken op til 95% af musen leveren kan erstattes af pHH. Interessant nok, beskrives en nylig rapport en menneskelig FH lever kimære Mus (baseret på FRG musen) med pHH fra en patient med en homozygot LDLR mutation14. I denne model, de genopbyggede humane hepatocytter havde ingen funktionel LDLR, men de resterende mus hepatocytter gjorde, hvorved utility til at udføre i vivo test af narkotika påberåbe sig LDLR vej.
Her rapporterer vi en detaljeret protokol baseret på vores nyligt offentliggjorte arbejde15 for engrafting FH iHeps ind i/Ldlr- / -/Rag2- / -/Il2rg- / - (LRG) mus leveren. Denne menneskelige lever kimære Mus er nyttigt for modellering FH og udfører drug test in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder, der beskrives her, indebærer brug af dyr er blevet godkendt af Udvalget om brug af levende dyr i undervisning og forskning (CULATR) af Universitet i Hong Kong.
1. med musen forberedelse og fænotypiske test
-
Generation af immundefekte Ldlr knockout (KO) mus.
- Bruge mus stammer Ldlr- / -, Rag2- /-og Il2rg- / - (Se Tabel af materialer).
- Cross Rag2- / - mus med Il2rg- / - mus til at generere Rag2- / -/ Il2rg- / - mus, så cross Ldlr- / - mus med Rag2- / - / Il2rg- / - mus til at generere/Ldlr- / -/Rag2- / -/Il2rg- / - (LRG) mus15. I en alder af 3-4 uger, skal du indsamle genomisk DNA fra øret til at bestemme genotype af PCR og sekventering.
- I en alder af 8-12 uger, skal du bruge mandlige LRG mus som modtagere for iHeps til at generere menneskelige lever kimære Mus.
- Feed mus med et højt fedtindhold og høj-kolesterol (HFHC) kost 7 dage før iHep transplantation kan hjælpe dem med at udvikle hyperkolesterolæmi.
- For at fremkalde leverskade, der letter udbredelsen af aflægger iHeps i leveren, placere mus i en steril beholder og bestråle dem ved hjælp af en gamma irradiator med γ-stråler i en dosis på 3 Gy 24 h før engraftment. Returnere mus til deres bolig bure. Sund status for disse bestrålede mus kan overvåges ved at måle deres vægt. Mus med 20% vægttab eller større vil være euthanized.
2. iHep differentiering og Dissociation
LDLR heterozygous KO (+/-) eller homozygot KO (- / -) menneskers iPSCs eller FH patient-iPSCs med heterozygous mutationer i LDLR (FH iPSCs) bruges til at producere iHeps. Generation af LDLR +/- eller- / - iPSCs og FH iPSCs er beskrevet i vores tidligere rapport15.
- Styret differentiering af iPSCs i iHeps
Bemærk: Metode til differentiering af humane iPSCs i iHeps er ændret fra en tidligere rapport16.- Tre dage før differentiering (dag -3), frø belagt iPSCs på ekstracellulære matrix 6-godt plader (Se Tabel af materialer) med en tæthed på 300.000 celler/brønd i 1,5 mL (også herefter) menneskelige iPSC vedligeholdelse medium (Se tabel af materialer ) suppleret med 5 µM ROCK hæmmer (Y27632). Kultur celler ved 37 ° C i en 5% CO2 befugtet inkubator. Normalt, er iHeps fra en 6-godt plade tilstrækkelige til at indpode 5 mus.
- 24 timer senere (dag -2) og 48 timer senere (dag -1), ændre mediet til frisk menneskelige iPSC vedligeholdelse medium uden ROCK inhibitor.
Bemærk: iPSCs før differentiering bør udtrykker høje niveauer af OCT4 og NANOG, som kan undersøges ved flowcytometri kvantitativ RT-PCR eller immunfluorescens. - På dag 0 af differentiering, vaske cellerne med RPMI 1640 én gang og derefter tilføje RPMI 1640 suppleret med 100 ng/mL Activin A og 25 ng/mL WNT3a.
- På dag 1 og dag 2 af differentiering, ændre mediet for RPMI 1640 suppleret med 100 ng/mL Activin A.
Bemærk: Hvis der er for meget celledød i denne fase (dage 0-3), op til 0,5% føtal bovint serum (FBS) kan føjes til medium at forbedre cellernes levedygtighed. Men, foreslår vi testning den minimale mængde af FBS tilføjes for hver specifik iPSC linje, som overskydende FBS kan også påvirke differentieringen. - På dag 3, vaske cellerne med DMEM én gang og derefter skifte til 2nd fase medium (20% serum udskiftning, 1 x ikke-essentielle aminosyrer, 2 M L-glutamin, 0,1 M beta-mercaptoethanol og 1% dimethylsulfoxid i DMEM medium). Ændre medium hver anden dag indtil dag 10.
Bemærk: På dag 7, cellerne skal have nået sammenløbet og display klare kanter. Der kan være nogle udifferentierede områder optræder paa dette stadium; ignorere dem, hvis procentdelen af disse områder er lille. Hvis procentdelen er høj, reducere sammenløbet af iPSCs på dag 0 og reducere mængden af FBS brugt i den første fase af differentiering. - På dagen 10, vaske cellerne med hepatocyt basal medium én gang og derefter skifte til hepatocyt næringssubstratet suppleret med 20 ng/mL menneskelige nedsat vækstfaktor og 20 ng/mL oncostatin M fremme iHep modning. Ændre medium hver anden dag.
Bemærk: på dette stadium, > 90% af celler skal være positiv for HNF4A, ifølge immunofluorescens farvning eller flow flowcytometri. - På dag 15-17 er cellerne klar til engraftment. Eventuelt kan cellekultur supernatant indsamles og opbevares ved-80 ° C for kvantificering af udskilles albumin (ALB) af iHeps.
Bemærk: på dette stadium, > 80% iHeps skal være positiv for HNF4A, ALB og en1-antitrypsin (AAT) Ifølge immunofluorescens farvning. Omkring skal 60-70% af dag 17 iHeps være positiv for ASGPR, som vist ved flowcytometri. I vores hænder har iHeps i denne periode optimal kapacitet til repopulate mus leveren; iHeps kan udskille højere niveauer af ALB in vitro- men også blive senescent, hvis engraftment er forsinket.
- Dissociation og indlæsning af iHeps til en insulin sprøjte
- Forbered den nødvendige reagenser og materialer:
- 24 timer før engraftment, tø den nødvendige mængde (V = 40 µL * mus nummer) af ekstracellulære matrix i en ice box i et koldt værelse, og sætte insulin sprøjte og en æske med 200 µL tips til 4 ° C køleskab.
- En time inden engraftment, varm celle dissociation enzym stuetemperatur suppleret med 50 µg/mL DNase og placere RPMI 1640 medium suppleret med 20% serum udskiftning på is.
- Tage fase kontrast billeder (100 X og 200 X) af iHeps til at registrere deres status, herunder celle morfologi, vækst og celle tæthed.
- Vask iHeps med 2 mL/godt af stuetemperatur Ca2 + og Mg2 +-gratis PBS to gange, og derefter tilsættes 1 mL af celle dissociation enzym suppleret med 50 µg/mL DNase jeg til hver brønd. Sætte cellerne tilbage i inkubatoren for 8-10 min.
Bemærk: For at forbedre celle dissociation med celle dissociation enzym, vaske cellerne med Ca2 + og Mg2 +-gratis PBS. For at maksimere cellernes levedygtighed, foreslår vi, at miljøomkostningerne ikke mere end 6 wells pr. parti på et tidspunkt. Derudover foreslår vi begrænser celle dissociation enzym behandling til mindre end 10 minutter. - Overvåge celle morfologi under mikroskop. Når de fleste af cellerne bliver runde, tilføje et lige saa stort volumen af kolde RPMI 1640 suppleret med 20% serum udskiftning til hver brønd, afpipetteres celler forsigtigt at løsne sig fra pladen, og overføre cellesuspension til en ny 15 mL tube.
Bemærk: Dette trin er kritisk for høstede cellernes levedygtighed. Hvis cellerne er svært at løsrive fra pladen, gør det ikke noget hvis nogle af cellerne er tilovers. Hvis cellerne frigøre som store pladser i éncellelag, derefter afpipetteres forsigtigt efter centrifugering at opnå en enkelt cellesuspension. - Gentag trin 2.2.4 for hver godt indtil næsten alle tilknyttede celler er indsamlet. Der centrifugeres ved 200 x g i 3 min. ved 4 ° C.
- Fjern supernatanten og resuspend celler med 2 mL koldt PBS i en 15 mL tube. Med pipette udtages celler forsigtigt for at opnå en enkelt celle suspension og derefter tilføje kolde PBS til en endelige mængden af 1 mL * antallet af dissocierede brønde. Endelig videregive cellerne gennem en 40 µm celle si at fjerne aggregater.
Bemærk: Normalt 1-2 x 106 celler/brønd kan høstes efter filtrering. - Alikvot 20 µL af celle suspension og tilføje 20 µL af 0,4% trypan blå løsning, derefter tælle de celler ved hjælp af en automatiseret celle counter og optage koncentrationen af cellesuspension som "C". Beregne den nødvendige mængde (V1 = [106 * (n + 1)] / C, hvor n er antallet af mus at være aflægger) af cellesuspension (1 million/mus) til intrasplenic injektion.
- Alikvot den krævede mængde cellesuspension til 15 mL rør og centrifugeres ved 200 x g i 3 min. ved 4 ° C.
- Fjern supernatanten, resuspend celler i den passende mængde kold PBS til lydstyrken i cellesuspension (n + 1) * 55/2 µL (n = antallet af mus), og derefter tilføje et lige saa stort volumen af ekstracellulære matrix til at foretage den endelige mængden af cellesuspension (n + 1) * 55 µL.
- Placere den kolde insulin sprøjte på is, afmonterer stemplet, overføre 55 µL af cellesuspension ind i sprøjten og derefter sætte stemplet tilbage. Decharge bobler omhyggeligt og sætte sprøjten tilbage på isen.
- Gentag 2.3.10, indtil alle sprøjter er blevet indlæst med celler. Sprøjter er nu klar til injektion.
Bemærk: For at maksimere cellernes levedygtighed, anbefaler vi at holde cellerne på is efter dissociation. Den ovenstående trin 2.2.4–2.2.11, skal du kontrollere alle reagenser opbevares ved 2 – 8 ° C før brug.
- Forbered den nødvendige reagenser og materialer:
3. intrasplenic injektion af iHeps
- Bedøver mus med ketamin (100 mg/kg) og xylazin (10 mg/kg) injiceres intraperitoneal. Sætte vet salve på mus øjne til at forhindre tørhed under proceduren anæstesi, og overvåge deres muskler reflekser for at observere den bedøvelse virkning og vurdere smerte.
- Når musene har mistet muskel refleks til stimulation, placere dem i højre laterale decubitus position. Anvende et tykt lag af depilatory fløde til området indsnit i den venstre flanke i 5-8 min. Fjern derefter den depilatory fløde og hår ved at tørre området med en vand-fugtet gauze afrivningsblok.
- Skrub den venstre flanke med povidon-jod eller, alternativt, med 70% ethanol 3 gange efterfulgt af en sidste iblødsætning med povidon-jod til desinfektion.
- En niveau 2 biosikkerhed kabinet, Find placeringen af milten, som kan visualiseres gennemsigtigt i venstre flanke, og derefter incise hud og bugvæggen til 0,5-1 cm. Exteriorize milten ved at trække fedtvæv forsigtigt nær det ved hjælp af spidse pincet. Stabilisere milten ved hjælp af en vatpind forsigtigt.
- Indsætte nålen insulin sprøjte 3 – 4 mm i parenkym af milten og injicere ca 50 µL af cellesuspension forsigtigt. Trækker nålen og placere en vatpind over injektionsstedet til 1 minut at forhindre blødning og spild af materiale.
- Returnere milten til bughinden og lukke såret med 5-0 nylon sutur. Derefter holde mus i en varm kammer/inkubator for 3-16 h at returnere dem til deres normale kropstemperatur og at genoplive dem. Mus, der har gennemgået kirurgi er ikke returneres til virksomheden af andre dyr indtil fuldt tilbagebetalt.
- Tilføje meloxicam (26 μg/mL) til drikkevand og injicere buprenorphin (50 μg/kg) intramuskulært som anti-inflammatoriske medicin og smertestillende, henholdsvis. Monitor kirurgiske sår dagligt for at forhindre enhver inflammation.
Bemærk: Sørg for alle instrumenterne og forsyninger, der anvendes i trin 4-7 er sterile.
4. test af Plasma LDL-C niveau
- På dag 0, 7, 14, 21 og 28 efter engraftment, dy LRG mus stramt at minimere side-til-side bevægelse af hovedet ved hjælp af to-hånds begrænse metode, så punktere den ansigts vene ved hjælp af lancet. Blodet begynder at flyde efter fjernelse af lancet. Indsamle omkring 50 µL af blod ind i 1,5 mL rør indeholdende 1 µL af EDTA.
Bemærk: Hvis grebet er for stram, indsamlede blodvolumen kan reduceres og mus kan dø på grund af vejrtrækningsbesvær. - Bland blodet forsigtigt af invertere rør flere gange og derefter centrifugeres ved 950 x g i 15 min. indsamle analysere og gemme dem på-80 ° C umiddelbart.
- Når alle prøver er indsamlet, tø plasma ved stuetemperatur og teste LDL-C niveau ved hjælp af en LDL-C detection kit ifølge producentens manual.
5. in Vivo test af lægemidler i kimære Mus aflægger med LDLR +/- og FH iHeps
- For at fremkalde hyperkolesterolæmi, feed mus en HFHC kost 7 dage før engraftment.
- På 7 dage efter engraftment, behandle hver gruppe af mus med køretøjet (PBS, injiceres subkutant), 10 mg/kg/uge PCSK9 antistoffer (en klinisk-grade formulering af PCSK9 monoklonale antistoffer, injiceres subkutant for), 10 mg/kg/dag simvastatin (40 mg/L mg / mL i drikkevand), eller kombineret PCSK9 antistoffer og simvastatin.
- Indsamle mus plasma på dage 0 (dag i engraftment), 14, 21 og 28 efter engraftment. Gemme prøver på-80 ° C umiddelbart.
- Når alle prøver er tilgængelige, skal du teste plasma LDL niveau ved hjælp af en LDL-C detection kit, ifølge producentens manual.
6. endotelfunktion Test
Endotelfunktion påvirkes tidligt i FH og kan afprøves i vores musemodel som en indikator for sværhedsgraden af sygdommen eller at evaluere forbedring med forskellige behandlinger. En stereomicrocope, dissektion pincet, saks, en wire myograph, erhvervelse hardware (Se Tabel af materialer), og en computer, der er behov for dette.
- Ofre mus ved intraperitoneal injektion af 100 mg/kg phenobarbital. Fjerne indre organer, så den nedadgående aorta parallel til rygsøjlen er synlige og kan blive dissekeret ud af saks samt tilstødende væv og hjertet. Dissekere aortae ved hjælp af fine saks og placere dem i kolde iltet Krebs løsning (mM: 119 NaCl, 4.7 KCl, 2,5 CaCl2, 1 MgCl2, 25 NaHCO3, 1,2 KH2PO4og 11 D-glucose).
- Overføre aortae i Krebs løsning til en silikone-belagt petriskål. PIN bindevæv at fastsætte aorta position uden at strække det. Under et stereomikroskop, brug fine pincet til foråret saksen og dissekere aorta gratis fra det omgivende fedt og adventitial væv uden at beskadige karvæggen, derefter skæres i 1,5-2 mm længde segmenter.
- Skære en ca 2 cm lang og 40 μm tykt rustfrit wire og forsigtigt sætte gennem aorta lumen. Overføre segmentet til wire myograph kammer fyldt med iltet Krebs løsning ved at holde wiren.
- For at måle længden af aortae segmenter, når man studerer kontraktilitet, skal du placere hvert segment vinkelret mellem kæber og post læsning (D1) på mikrometer. Fjern segmentet og bevæge kæberne sammen og optage læsning (D0). Længden af målgruppen ville være L = D1-D0.
- Følg brugervejledningen for at klemme wire og Fastgør det med skruetrækkeren, samtidig med at placere målgruppen i mellem kæberne, men overlade det udglattet.
- For normalisering før forsøget, indstille myograph til nul i positionen må ikke strækkes. Derefter langsomt kæbe apart og observere aorta spændingen ændre indtil nå 3 mN. Efter 15 minutter, drain løsning fra myograph kammer, og erstatte med friske Krebs løsning, vente 15 min og justere spændingen til 3 mN igen.
- Ændre standardopløsningen Krebs til 60 mM KCl-holdige Krebs løsning til at fremkalde en sammentrækning i mindst 15 min. Skyl med friske Krebs løsning 3 gange.
- Tilføje stigende koncentrationer af phenylephrin (Phe; f.eks.fra 10 nM til 100 μM). Vask ud med Krebs standardopløsning og tilføje en enkelt koncentration af Phe på ~ 70% af maksimal sammentrækning fra den tidligere sammentrækning. Når sammentrækningen er stabil, tilføje stigende koncentrationer af acetylkolin (ACh; f.eks.fra 1 eller 3 nM-10 eller 30 µM) til at fremkalde vasodilatation. ACh er tilføjet på ca 2 min interval.
Bemærk: I nogle aorta segmenter med små Phe-induceret sammentrækning, for eksempel mindre end 30% af KCl induceret sammentrækning, U46619 (en anden vasokonstriktor) ved en koncentration fra 1 nM til 30 nM kan bruges til at fremkalde en stabil sammentrækning, der er større end 70% af KCl-induceret sammentrækning. - Ren myograph ifølge producentens manual.
- Bruger data analyse software (Se Tabel af materialer), post kraft (F) efter hver tilsætning af narkotika. Trække markøren til basal spænding (Fbasal) for relativ måling, flyt pilen til det højeste punkt efter Phe som FPhe, og derefter flytte til det laveste punkt efter hver tilsætning af ACh som FACh. Beregne ACh-induceret endotel-afhængig vasodilatation (EDV) af % afslapning = (FACh-Fbasal) / (FPhe-Fbasal) på y-aksen. Forberede en koncentration respons kurven på statistisk software ved hjælp af log10 værdi af koncentration i M på x-aksen.
- For at analysere den statistiske forskel, bruge arealet under kurven for hvert segment fra en mus og analysere forskel af arealet under kurven blandt grupper ved hjælp af en-vejs ANOVA. Enkelte punkter kan også analyseres, hvis nødvendigt.
7. dokumentation af iHep genindsættelse i mus lever
- På slutpunktet, ofre mus ved at indsprøjte intraperitoneal 100 mg/kg phenobarbital.
- Indsamle plasma af cardiac punktering. Dissekere lapper i leveren ved hjælp af oftalmologiske saks, og derefter sætte lever i en 10-cm peri-parabol og vaskes to gange med saltvand. Fjerne saltvand fra leveren overfladen med absorberende papir, derefter skæres lapper ind omkring 0,6 cm længde stykker. Løse lapper i leveren i 10% formalin.
- Integrere de faste lever i paraffin og afsnit ved hjælp af en væv processing system og en glidende mikrotom, henholdsvis, ifølge producentens anvisninger.
- Varme dias til 60 ° C i 1 time til at smelte voks. Derefter, fordybe dias i xylen i 5 min. to gange, og rehydrere væv med 100%, 90% og 70% ethanol successivt.
- Fordyb dias i dias-salen indeholdende omkring 50 mL antigen hentning løsning, og derefter sætte salen i trykkoger, 120 ° C for 1,5 min. vask dias forsigtigt med rør vand i 5 minutter.
- Pletten sektioner med primære antistoffer (ca. 100 µL/afsnit) rettet mod menneskelige ALB (hALB) og menneskelige kerner antigen (hNA). Derefter pletten med sekundære antistoffer konjugeret med et fluorescerende etiket eller peberrodsperoxidase (som reagerer med DAB detection kit).
- For at beregne procentdelen af hALB + områder og hNA + celler, scanne dias farves med anti-hALB og anti-hNA og reagerede med DAB ved hjælp af en automatiseret diasscanning system til at få hele afsnittet billeder.
Bemærk: Hele afsnit-scannede billeder er nyttige til at beregne genopbyggede effektivitet i en fordomsfri måde på grundlag af hALB + områder eller hNA + celler i Immunhistokemi-farvede lever. Som en alternativ metode til at overvåge iHep genindsættelse effektivitet, kan plasma humant albumin niveau testes ved hjælp af en menneskelig specifikke ALB ELISA kit. - Tage snapshot billeder til at dække det hele dias ved hjælp af den tilknyttede digital slide visning software under 5 X visning. For at kvantificere procentdelen af hALB + områder, for hvert snapshot billede, anvende mikroskopet tænkelig programmel for at kvalificere det positive område (P) og det samlede areal (T) af billedet, og brug billede Jørgensen til at kvalificere det tomme område (B). Procentdelen af hALB + områder er udtrykt som P/(T-B) * 100%. For hver gruppe, bør mindst 3 mus vælges. Og for hver mus, der bør vælges mindst 4 sektioner fra forskellige positioner i leveren.
- For at kvantificere procentdelen af hNA + celler, for hvert snapshot billede, vælge tilfældigt 1/16 af området med en billedbehandling software, og derefter tælle manuelt antallet af samlede kerner (T) og hNA + kerner (N). Procentdelen af hNA + er udtrykt i N/T * 100%. For hver gruppe, bør mindst 3 mus vælges. For hver mus, bør mindst 4 sektioner fra forskellige positioner i leveren vælges.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Styret differentiering af humane iPSCs i iHeps
Når nå 70% sammenløb, differentieres menneskelige iPSCs i iHeps med en 3-trins protokol16 (figur 1 øverste panel). Efter 3 dage af endoderm differentiering, blive iPSC kolonier løsnet og spredt sig til fuld sammenløbet (figur 1 nederste panel). Derefter, med 2nd fase medium, hepatoblasts vises og formere. Disse celler er overfyldt men Vis klare kanter på dette tidspunkt (dag 7, figur 1 nederste panel). Efter 17 dage af differentiering vises polariseret iHeps med typisk sekskant morfologi (figur 1 nederste panel). Disse iHeps express pHH markører, herunder AAT og ALB (figur 2A). Desuden bør forholdet mellem ASGPR + iHeps være relativt høj, målt flow flowcytometri (figur 2B)15.
Generation af en FH i Vivo sygdom Model ved hjælp af FH iHeps
For at hjælpe LRG mus udvikle hyperkolesterolæmi, fodrer vi dem med en HFHC kost 7 dage før engraftment (dag -7). På dagen for engraftment (dag 0) vise LRG mus omkring 3-fold plasma LDL-C niveau (omkring 600 mg/dL, figur 3B). Dag 15-17 iHeps er aflægger til LRG mus via intrasplenic injektion; disse iHeps snart opholde sig i leveren parenkym og formere der (figur 3A). På farveprøve, er lever af disse kimære Mus indsamlet og fast, så farves med hALB og hNA, som begge skal vise klare bevis af iHep-medieret lever genindsættelse i LRG mus lever baseret på farvning for hALB og hNA (figur 4A-E). I vores hænder, kunne LDLR +/- og FH iHeps reducere plasma LDL-C niveau betydeligt 21 dage efter engraftment (figur 4F). På dette tidspunkt kan FH menneskelige lever kimære Mus bruges til at teste terapier for FH.
Validering af FH menneskelige lever kimære musen Model ved hjælp af tilgængelige lægemidler
For at validere vores model, brugte vi 2 velkendte LDL-C sænkning narkotika, simvastatin og PCSK9 antistoffer (figur 5A). Vores data bevise, at 21 dage efter behandling, PCSK9 antistoffer har en stærkere mulighed for LDL-sænkende og EDV end simvastatin i FH kimære Mus (figur 5B-D). Især, er den observerede procentvise reduktion af plasma LDL-C med PCSK9 antistoffer i FH kimære Mus samme som rapporteret i kliniske forsøg4. Disse resultater viser, den potentielle nytte af LRG kimære Mus aflægger med FH iHeps for præklinisk afprøvning af nye lægemidler til FH.
Figur 1: instrueret differentiering af menneskelige iPSCs ind i iHeps.Top panelet, tidslinjen til iPSC differentiering i iHeps; centrale cytokiner og medier er vist for hver fase. (Nederste panel) Repræsentative fase kontrast billeder af forskellige tidspunkter for iHep differentiering. KSR: knockout serum udskiftning; HCM: hepatocytter næringssubstratet; HGF: hepatocyt vækstfaktor; OSM: oncostatin M. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: karakterisering af iHeps produceret med modificeret differentiering protokol. (A) immunfluorescens af iHeps på forskellige stadier af differentiering. Kerner er farvet i blå i de flettede kompositioner. (B) Bar graf viser procentdelen af ASGPR + iHeps afledt fremstillet på dag 17, målt ved flowcytometri. Prøverne blev målt i 3 selvstændige eksperimenter; middelværdier er vist og fejllinjer angive standardafvigelse (SD). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Generation af FH In Vivo sygdom Model med iHeps. (A) tid linje for generation af menneskelige lever kimære Mus af intrasplenic injektion af FH iHeps i LRG mus. (B) Bar graf viser, at fodring LRG mus med HFHC kost fører til betydeligt øget LDL-C-niveau (n = 10). P -værdier er angivet på figur og blev opnået med en uparret t-test; middelværdier er vist og fejllinjer angive standard fejl af middelværdien (SEM). Panelet B er ændret fra figur 3I af vores forrige rapport15. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: iHep Mediated genindsættelse af LRG mus lever. (A) repræsentative hele afsnit-scannede billede af hALB farvning i en mus lever genbefolket med LDLR +/-iHeps. Pilene angiver klynger af menneskelige iHeps aflægger ind i musen leveren; zoomede sektioner vises i højre panel. (B) Scatter plot grafen viser procentdelen af genbefolket hALB + svarende til iHep-holdige områder i en mus lever (fra forskellige donor iPSCs), beregning var baseret på hele afsnit-scannede billeder (n = 19). Middelværdier er vist og fejllinjer angive SD. (C) repræsentative billeder af immunhistokemisk farvning for hNA i en mus lever med aflægger FH iHeps. (D) søjlediagrammet viser procentdelen af genopbyggede hNA + iHeps (fra forskellige donor iPSCs) i LRG mus lever (n = 3). Middelværdier er vist og fejllinjer angive SD. (E) hALB og hNA farvning på to på hinanden følgende dele af en mus lever genbefolket med vildtype iHeps. (F) søjlediagrammet viser procentdelen af plasma LDL-C reduktion fra baseline til dag 21 efter engraftment; n = 5 for LDLR +/-iHeps og n = 6 for FH iHeps og køretøjet. P -værdier er angivet på figur og blev opnået med en uparret t-test; mener værdier er vist fejllinjer angive SEM. paneler B, D og E er ændret fra figur 3 g-3I af vores forrige rapport15. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : PCSK9 antistoffer Vis stærkere LDL sænke evne end Simvastatin i menneskets lever kimære LRG mus. (A) skematisk oversigt over i vivo drug test tilgang med FH menneskelige lever kimære Mus. (B og C) procentvise ændring af plasma LDL-C fra baseline dage 14, 21 og 28 i FH kimære Mus fodret med HFHC kost og behandlet med de angivne stoffer; n angiver antallet af mus. P værdier blev opnået ved hjælp af en Kruskal-Wallis test; middelværdier er vist og fejllinjer angive SEM. (D) EDV som reaktion på stigende koncentrationer af ACh. P -værdier er angivet på figur for maalte koncentration. P værdier blev opnået ved hjælp af to-vejs ANOVA justeret med Dunnetts flere sammenligning; fejllinjer angive SEM. figur 5 er ændret fra figur 4A-C-4 og figur 5A i vores tidligere rapport15. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tidligere undersøgelser ved hjælp af iHeps i gnavere har bekræftet, at de er en effektiv måde at studere arvelige leversygdomme17. Yderligere udvide brugen af denne teknologi og fordi aktuelle FH dyremodeller er ikke optimalt, vi aflægger FH iHeps til LRG mus og viste, at den aflægger LDLR +/- eller heterozygous LDLR-muterede FH iHeps kan reducere mus plasma LDL-C niveau og reagere på lipid-sænkende stoffer i vivo.
Der er 3 vigtige trin i vores protokol for at skabe menneskelige FH lever kimære Mus ved hjælp af iHeps:
1) produktionen af højkvalitets iHeps gennem styret differentiering. I betragtning af de klonede variabiliteten mellem iPSC linjer18, er det vigtigt at bruge isogene iPSCs for ordentlig sammenligninger og til at teste iHep differentiering effektiviteten af mor cellelinje før du udfører teknik og engraftment.
2) korrekte iHep upload ind i sprøjten. Anderledes end andre protokoller, vi bruger 50% ekstracellulære matrix (endelig koncentration, v/v) til resuspend iHeps, og derefter uploade dem ind i insulin sprøjten. Vi mener, at den ekstracellulære matrix beskytter celler og giver en mikromiljø, der letter iHep migration i leveren fra milten. Bobler er en dødbringende faktor for kirurgi og bør undgås helt i sprøjten.
3) korrekte antal aflægger celler. Overbelastning af celler kan også føre til høje dødelighed sats. Vi anbefaler engrafting 1 – 1,5 millioner iHeps pr. 25 – 30 g mus.
Vores protokollen også har nogle begrænsninger: leverskade induceres ved bestråling er moderat og enkelt-dosis, og tilstanden modning af vores iHeps er ikke sammenlignelig med pHH. Relateret til begge betragtninger, er graden af kimærisme af vores model magen til de seneste rapporter beskriver NOD/Lt-SCID/IL-2Rγ−/− mus eller Gunn rotter aflægger med iPSC-afledte iHeps17,19 , men væsentligt lavere end FRG mus eller uPA Transgene mus aflægger med pHH. For at overvinde denne advarsel, på den ene side kunne man yderligere optimere hepatisk differentiering protokol for at forbedre modning af iHeps. På den anden side kunne LRG mus krydses med FRG mus til at generere Ldlr- / -/Fah- / -/Rag2- / -/Il2rg- / - mus.
I sammendrag, har her vi beskrevet en detaljeret protokol for at skabe menneskelige lever kimære dyr med FH iHeps, og for at teste funktionaliteten af den aflægger iHeps. Vigtigere, kan disse kimære Mus bruges til i vivo dopingkontrol. Vores model kan sandsynligvis optimeres ved at forbedre funktionaliteten af iHeps eller udskære yderligere gener (fx., Fah) i modtageren LRG mus, og det vil være nyttigt at undersøge patologiske mekanismer af sygdommen og udføre prækliniske undersøgelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
H.-F.T. er den nationale koordinator og Investigator i ODYSSEEN udfald undersøgelsen sponseret af Sanofi og Regeneron Pharmaceuticals.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Shenzhen videnskab og teknologi Rådet grundlæggende Research Program (JCYJ20150331142757383), strategiske prioritet Research Program af kinesiske Academy of Sciences (XDA16030502), Hong Kong forskning tilskud Rådet tema baseret forskning Ordningen (T12-705/11), samarbejde Program tilskud Forskningsråd af Hong Kong Special Administrative Region og National Natural Science Foundation i Kina (N-HKU730/12 og 81261160506), Team forskningsprojekt Guangdong Naturvidenskabelig videnskabsteori Foundation (2014A030312001), Guangzhou videnskab og teknologi Program (201607010086), og Guangdong provinsen videnskab og teknologi Program (2016B030229007 og 2017B050506007).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 40 µm Cell strainer | BD | B4-VW-352340 | |
| 6-Well plate | Thermofisher | 140675 | Extracellular matrix coated |
| Accutase | Millipore | SCR005 | |
| Acetylcholine | Sigma Aldrich | A6625 | Dissolve in water |
| Antigen retrieval solution | IHC World | IW-1100-1L | |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | C8106 | CaCl2 |
| Cell dissociation enzyme | Thermofisher | 12604-013 | TrypLE |
| D-glucose | Sigma Aldrich | D8270 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | D5879 | DMSO |
| DMEM | Thermofisher | 10829 | Knockout DMEM |
| DNase I | Roche | 11284932001 | |
| EDTA | USB | 15694 | 0.5 M, PH=8.0 |
| Extracellular matrix (for cell suspension) | Corning | 354234 | Matrigel |
| Extracellular matrix (for iHep differentiation) | Corning | 354230 | Matrigel |
| Hepatocyte basal medium | Lonza | CC-3199 | |
| Hepatocyte culture medium | Lonza | CC-3198 | |
| High-fat and high-cholesterol diet | Research Diet | D12079B | |
| Human Activin A | Peprotech | 120-14E | |
| Human hepatocyte growth factor | Peprotech | 100-39 | |
| Human iPSC maintenance medium | STEMCELL Technologies | 5850 | mTeSR1 |
| Human oncostatin M | Peprotech | 300-10 | |
| Ketamine 10% | Alfasan | N/A | |
| L-glutamine | Thermofisher | 35050 | |
| LDL-C detection kit | WAKO | 993-00404 and 993-00504 | |
| Magnesium chloride | VWR | P25108 | MgCl2 |
| Meloxicam | Boehringer Ingelheim | NADA 141-213 | |
| Monopotassium phosphate | USB | S20227 | KH2PO4 |
| Non-essential amino acids | Thermofisher | 11140 | |
| PBS | GE | SH30256.02 | Calcium and magnesium-free |
| PCSK9 antibodies | Sanofi and Regeneron Pharmaceuticals | SAR236553/REGN727 | Alirocumab |
| Phenobarbital | Alfamedic company | 013003 | |
| Phenylephrine | RBI | P-133 | Dissolve in water |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P9333 | KCl |
| Povidone-iodine | Mundipharma | Betadine | |
| Recombinant mouse Wnt3a | R&D Systems | 1324-WN-500/CF | |
| ROCK inhibitor Y27632 | Sigma Aldrich | Y0503-5MG | |
| RPMI 1640 | Thermofisher | 21875 | |
| Serum replacement | Thermofisher | 10828 | |
| Silicone coated petri dish | Dow Corning | Sylgard 184 silicone elastomer kit | |
| Simvastatin | Merck Sharp & Dohme | ZOCOR | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6297 | NaHCO3 |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | NaCl |
| Trypan blue solution 0.4% | Thermofisher | 15250061 | |
| U-46619 | Cayman | 16450 | Dissolve in DMSO |
| Xylazine 2% | Alfasan | N/A | |
| β-mercaptoethanol | Thermofisher | 31350 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| AAT | DAKO | A0012 | 1:400 |
| ALB | Bethyl Laboratories | A80-129 | 1:200 |
| ASGPR | Santa Cruz | Sc-28977 | 1:100 |
| HNF4A | Santa Cruz | Sc-6557 | 1:35 |
| NANOG | Stemgent | 09-0020 | 1:200 |
| OCT4 | Stemgent | 09-0023 | 1:200 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| Il2rg-/- | Jacson lab | 003174 | |
| Ldlr-/- | Jacson lab | 002077 | |
| Rag2-/- | Jacson lab | 008449 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Automated cell counter | Invitrogen | Countess | |
| Gamma irradiator | MDS Nordion | Gammacell 3000 Elan II | |
| Insulin syringe | BD | 324911 | |
| Powerlab | ADInstruments | Model 8/30 | |
| Slides scanning system | Leica biosystems | Aperio scanScope system | |
| Sliding Microtome | Leica biosystems | RM2125RT | |
| Stereomicrocope | Nikon | SMZ800 | |
| Tissue processing system | Leica biosystems | ASP200S | |
| Wire myograph | DMT | 610M | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Softwares | |||
| Digital slide viewing software | Leica | Aperio ImageScope Version 12.3.2 | |
| Image J | NIH | Version 1.51e | |
| Image processing software | Adobe | Photoshop CC Version 2015 | |
| Microscope imaging software | Carl Zeiss | AxioVision LE Version 4.7 |
References
- Brown, M. S., Goldstein, J. L. A receptor-mediated pathway for cholesterol homeostasis. Science. 232 (4746), 34-47 (1986).
- Endo, A. The discovery and development of HMG-CoA reductase inhibitors. J Lipid Res. 33 (11), 1569-1582 (1992).
- Dubuc, G., et al. Statins upregulate PCSK9, the gene encoding the proprotein convertase neural apoptosis-regulated convertase-1 implicated in familial hypercholesterolemia. Arterioscler Thrombo Vasc Biol. 24 (8), 1454-1459 (2004).
- Robinson, J. G., et al. Efficacy and safety of alirocumab in reducing lipids and cardiovascular events. N Engl J Med. 372 (16), 1489-1499 (2015).
- Fitzgerald, K., et al. Effect of an RNA interference drug on the synthesis of proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) and the concentration of serum LDL cholesterol in healthy volunteers: a randomised, single-blind, placebo-controlled, phase 1 trial. Lancet. 383 (9911), 60-68 (2014).
- Ishibashi, S., et al. Hypercholesterolemia in low density lipoprotein receptor knockout mice and its reversal by adenovirus-mediated gene delivery. J Clin Invest. 92 (2), 883-893 (1993).
- Watanabe, Y. Serial inbreeding of rabbits with hereditary hyperlipidemia (WHHL-rabbit). Atherosclerosis. 36 (2), 261-268 (1980).
- Carpentier, A., et al. Engrafted human stem cell-derived hepatocytes establish an infectious HCV murine model. J Clin Invest. 124 (11), 4953-4964 (2014).
- Tateno, C., et al. Near completely humanized liver in mice shows human-type metabolic responses to drugs. Am J Pathol. 165 (3), 901-912 (2004).
- Basma, H., et al. Differentiation and transplantation of human embryonic stem cell-derived hepatocytes. Gastroenterology. 136 (3), 990-999 (2009).
- Soldner, F., et al. Generation of isogenic pluripotent stem cells differing exclusively at two early onset Parkinson point mutations. Cell. 146 (2), 318-331 (2011).
- Bissig, K. D., et al. Human liver chimeric mice provide a model for hepatitis B and C virus infection and treatment. J Clin Invest. 120 (3), 924-930 (2010).
- Azuma, H., et al. Robust expansion of human hepatocytes in Fah(-/-)/Rag2(-/-)/Il2rg(-/-) mice. Nat Biotechnol. 25 (8), 903-910 (2007).
- Bissig-Choisat, B., et al. Development and rescue of human familial hypercholesterolaemia in a xenograft mouse model. Nat Commun. 6, 7339 (2015).
- Yang, J., et al. Generation of human liver chimeric mice with hepatocytes from familial hypercholesterolemia induced pluripotent stem cells. Stem Cell Rep. 8 (3), 605-618 (2017).
- Kajiwara, M., et al. Donor-dependent variations in hepatic differentiation from human-induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (31), 12538-12543 (2012).
- Chen, Y., et al. Amelioration of hyperbilirubinemia in gunn rats after transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes. Stem Cell Rep. 5 (1), 22-30 (2015).
- Ortmann, D., Vallier, L. Variability of human pluripotent stem cell lines. Curr Opin Genet Dev. 46, 179-185 (2017).
- Liu, H., Kim, Y., Sharkis, S., Marchionni, L., Jang, Y. Y. In vivo liver regeneration potential of human induced pluripotent stem cells from diverse origins. Sci Transl Med. 3 (82), 82ra39 (2011).
