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Developmental Biology

एक पारिवारिक विटिलिगो मानव जिगर Chimeric माउस प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल का उपयोग कर मॉडल-व्युत्पंन हेपैटोसाइट्स

Published: September 15, 2018 doi: 10.3791/57556
Automatic Translation
*1,2,6, *2, *3, 1,2, 2, 2, 4,5, 4,5, 2, 4,5, 4,5, 4,5, 4,5, 3, 4,5,7, 1,2,6,7
1Department of Medicine, University of Hong Kong-Shenzhen Hospital, 2The Cardiology Division, Department of Medicine, Li Ka Shing Faculty of Medicine, University of Hong Kong, 3School of Biomedical Sciences, Institute of Vascular Medicine, Li Ka Shing Institute of Health Sciences, Chinese University of Hong Kong, 4Key Laboratory of Regenerative Biology of the Chinese Academy of Sciences, Joint School of Life Sciences, Guangzhou Institutes of Biomedicine and Health and Guangzhou Medical University, 5Laboratory of RNA, Chromatin, and Human Disease, CAS Key Laboratory of Regenerative Biology and Guangdong Provincial Key Laboratory of Stem Cells and Regenerative Medicine, Guangzhou Institutes of Biomedicine and Health, Chinese Academy of Sciences, 6Research Centre of Heart, Brain, Hormone, and Healthy Ageing, Li Ka Shing Faculty of Medicine, University of Hong Kong, 7Hong Kong-Guangdong Stem Cell and Regenerative Medicine Research Centre, University of Hong Kong and Guangzhou Institutes of Biomedicine and Health
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल का उपयोग कर विटिलिगो के एक मानव जिगर chimeric माउस मॉडल उत्पंन करने के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद-हेपैटोसाइट्स व्युत्पंन । यह विटिलिगो के लिए नए उपचारों के परीक्षण के लिए एक मूल्यवान मॉडल है ।

Abstract

पारिवारिक विटिलिगो (एफ एच) ज्यादातर कम घनत्व लिपोप्रोटीन रिसेप्टर (LDLR) उत्परिवर्तनों और परिणाम जल्दी शुरुआत हृदय रोग का एक बढ़ा जोखिम में एलडीएल कोलेस्ट्रॉल के चिह्नित उंनयन के कारण होता है (एलडीएल-सी) रक्त में । Statins विटिलिगो के एफ एच और अंय प्रकार के इलाज के लिए लिपिड कम दवाओं की पहली पंक्ति रहे हैं, लेकिन नए दृष्टिकोण विशेष रूप से PCSK9 एंटीबॉडी, जो अब नैदानिक परीक्षणों में परीक्षण किया जा रहा है में उभर रहे हैं । एफ एच, या तो नई दवाओं या नए योगों के लिए उपंयास चिकित्सकीय दृष्टिकोण का पता लगाने के लिए, हम vivo मॉडल में उचित की जरूरत है । हालांकि, मानव की तुलना में लिपिड चयापचय प्रोफाइल में अंतर एफ एच के उपलब्ध पशु मॉडलों की एक प्रमुख समस्या है। इस समस्या को हल करने के लिए, हम एक मानव जिगर chimeric माउस मॉडल एफ एच प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSC) का उपयोग कर उत्पंन किया है-व्युत्पंन हेपैटोसाइट्स (iHeps) । हमने Ldlr-/-/Rag2-/-/Il2rg-/- (LRG) चूहों के लिए प्रत्यारोपण मानव कोशिकाओं की प्रतिरक्षा अस्वीकृति से बचने के लिए और एक Ldlr नल पृष्ठभूमि में iHeps की कमी Ldlr के प्रभाव का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया । ट्रांसप्लांटेशन एफ एच iHeps LRG माउस मानव एल्ब्युमिन धुंधला के आधार पर जिगर के 5-10% फिर से आबाद सकता है । इसके अलावा, engrafted iHeps लिपिड कम दवाओं और statins की तुलना में PCSK9 एंटीबॉडी की वृद्धि की प्रभावकारिता के नैदानिक टिप्पणियों recapitulated के लिए जवाब दिया । हमारे मानव जिगर chimeric मॉडल इस प्रकार एफ एच के लिए नए उपचारों के नैदानिक परीक्षण के लिए उपयोगी हो सकता है । एक ही प्रोटोकॉल, अंय एफ एच आनुवंशिक वेरिएंट, या अंय वंशानुगत जिगर के रोगों के लिए इसी उत्परिवर्तनों के लिए इसी तरह मानव जिगर chimeric चूहों का प्रयोग, भी उत्पंन किया जा सकता है ।

Introduction

कम घनत्व लिपोप्रोटीन रिसेप्टर (LDLR) रक्त में एलडीएल कोलेस्ट्रॉल (एलडीएल सी) कब्जा करने के लिए जिगर में कोलेस्ट्रॉल संश्लेषण का नियमन । LDLR जीन में उत्परिवर्तनों पारिवारिक विटिलिगो (एफ एच)1के सबसे अक्सर कारण हैं । Statins पारंपरिक रूप से दवा की पहली पंक्ति के लिए एफ एच और विटिलिगो के अंय प्रकार के इलाज किया गया है (विरासत या अधिग्रहीत) । Statins बाधित 3-hydroxy-3-methylglutaryl-कोएंजाइम एक रिडक्टेस जिगर2में कोलेस्ट्रॉल संश्लेषण को कम करने के लिए. इसके अतिरिक्त, statins hepatocyte सतह पर LDLR स्तर बढ़ाने के लिए प्लाज्मा एलडीएल सी निकासी को बढ़ावा देने के । हालांकि, statins के साथ उपचार के एक प्रमुख चेतावनी है कि वे एक साथ एक एंजाइम convertase subtilisin/hexin 9 (PCSK9) की अभिव्यक्ति के लिए प्रेरित करता है, जो अपने क्षरण को बढ़ावा देने के लिए LDLR करने के लिए बाइंड कर देता है3. यह प्रभाव कई रोगियों में मनाया statins के लिए अपर्याप्त या यहां तक कि नल प्रतिक्रिया के लिए जिंमेदार है । इस तंत्र का अध्ययन, अप्रत्याशित रूप से, विटिलिगो के इलाज के लिए एक वैकल्पिक रास्ते की खोज के लिए नेतृत्व किया । PCSK9 एंटीबॉडी हाल ही में एफडीए द्वारा अनुमोदित वर्तमान में नैदानिक परीक्षणों में इस्तेमाल किया जा रहा है और उच्च प्रभावकारिता और4statins से बेहतर सहिष्णुता दिखाओ । PCSK9 एंटीबॉडी की सफलता से यह भी तात्पर्य है कि विटिलिगो के साथ रोगियों में LDLR ह्रास मार्ग (PCSK9 के अलावा) का नियमन करने के लिए अन्य चिकित्सीय संभावनाएं हो सकती हैं. इसी तरह, एंटीबॉडी के अलावा PCSK9 के नए अवरोधकों के विकास में रुचि है, उदाहरण के लिए, सिरना ओलिगोस्पर्मिया5.

एफ एच के लिए नए उपचारों और सामांय में विटिलिगो के किसी अंय प्रकार के परीक्षण के लिए, vivo मॉडल में उपयुक्त आवश्यक हैं । vivo मॉडल में वर्तमान की एक प्रमुख समस्या है, ज्यादातर चूहे6 और खरगोश7, मनुष्यों के साथ उनके शारीरिक मतभेद हैं । महत्वपूर्ण, इन समस्याओं का एक अलग लिपिड चयापचय प्रोफ़ाइल शामिल हैं । मानव जिगर chimeric जानवरों की पीढ़ी8 इस चेतावनी को दूर करने में मदद कर सकता है । मानव जिगर chimeric माउस का एक प्रकार है "मानव" माउस के साथ अपने जिगर मानव हेपैटोसाइट्स के साथ repopulateded, उदाहरण के लिए, प्राथमिक मानव हेपैटोसाइट्स (pHH)9. pHH के साथ एक समस्या यह है कि वे पूर्व vivoका विस्तार नहीं किया जा सकता है, जल्दी से अलगाव पर अपने समारोह खो, और एक सीमित स्रोत हैं । pHH के लिए एक विकल्प प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSC) का उपयोग है-व्युत्पंन हेपैटोसाइट्स (iHeps)10। विशेष रूप से, iPSCs रोगी-विशिष्ट हैं और अनिश्चित काल तक उगाया जा सकता है, इसलिए iHeps मांग पर उत्पादन किया जा सकता है, जो ताजा pHH पर एक महत्वपूर्ण लाभ है । इसके अलावा, iPSCs भी आसानी से आनुवंशिक रूप से डिजाइनर nucleases के साथ इंजीनियर को सही या एक isogenic पृष्ठभूमि में उत्परिवर्तनों परिचय कर सकते है और अधिक वफादार तुलना11अनुमति देते हैं ।

मानव जिगर chimeric माउस engrafted pHH के साथ जिगर चयापचय प्रोफाइल में मनुष्यों के लिए समानताएं दिखाने, दवा प्रतिक्रियाओं, और हेपेटाइटिस वायरस के संक्रमण के लिए संवेदनशीलता12. इससे उन्हें वीवो मेंhyperlipidemia का अध्ययन करने के लिए एक अच्छा मॉडल बना है । सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल माउस मॉडल फह-/-/Rag2-/-/Il2rg-/- (FRG) माउस13 और uPA ट्रांसजेनिक माउस8, जिसमें माउस जिगर के ९५% तक pHH द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है पर आधारित हैं । दिलचस्प है, हाल ही में एक रिपोर्ट एक मानव एफ एच जिगर chimeric माउस (FRG माउस के आधार पर) एक रोगी एक homozygous LDLR उत्परिवर्तन14ले जाने से pHH के साथ वर्णित है । इस मॉडल में, repopulateded मानव हेपैटोसाइट्स कोई कार्यात्मक LDLR था, लेकिन अवशिष्ट माउस हेपैटोसाइट्स किया था, इस प्रकार vivo LDLR मार्ग पर निर्भर दवाओं के परीक्षण में प्रदर्शन के लिए उपयोगिता को कम करने ।

यहां, हम Ldlr-/-/Rag2-/-/Il2rg-/- (LRG) माउस जिगर में engrafting एफ एच iHeps के लिए हमारे हाल ही में प्रकाशित काम15 के आधार पर एक विस्तृत प्रोटोकॉल की रिपोर्ट । इस मानव जिगर chimeric माउस एफ एच और vivo में दवा परीक्षण प्रदर्शन मॉडलिंग के लिए उपयोगी है ।

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Protocol

सभी तरीकों यहां वर्णित है कि पशुओं के उपयोग को शामिल करने के शिक्षण और अनुसंधान में जीवित पशुओं के उपयोग पर समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है (CULATR) हांगकांग विश्वविद्यालय के ।

1. माउस तैयारी और Phenotypic परीक्षण

  1. immunodeficient Ldlr नॉकआउट (KO) चूहों की पीढ़ी ।
    1. चूहों उपभेदों Ldlr-/-, Rag2-/-, और Il2rg-/- ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करें ।
    2. cross Rag2-/ -चूहों के साथ Il2rg- /-चूहों को उत्पन्न करने के लिए Rag2-/ Il2rg-/- चूहों, तो पार Ldlr-/- चूहों के साथ Rag2-/ / Il2rg-/- चूहों को उत्पन्न करने के लिए Ldlr-/-/Rag2-/-/Il2rg-/- (LRG) चूहों15. 3 से 4 सप्ताह की उम्र में, पीसीआर और अनुक्रमण द्वारा जीनोटाइप निर्धारित करने के लिए कान से जीनोमिक डीएनए इकट्ठा ।
    3. 8 से 12 सप्ताह की आयु में, iHeps के लिए प्राप्तकर्ताओं के रूप में पुरुष LRG चूहों का उपयोग मानव जिगर chimeric चूहों उत्पन्न करने के लिए.
  2. चूहों को एक उच्च वसा और उच्च कोलेस्ट्रॉल (HFHC) आहार के साथ iHep प्रत्यारोपण से 7 दिन पहले उन्हें विटिलिगो विकसित करने में मदद करने के लिए फ़ीड ।
  3. जिगर की चोट है कि जिगर में engrafted iHeps के प्रसार की सुविधा के लिए प्रेरित करने के लिए, एक बाँझ कंटेनर में चूहों जगह और उन्हें γ के लिए Gy से पहले 3 engraftment 24 एच की एक खुराक में एक गामा irradiator का उपयोग कर विकीर्ण. फिर, चूहों उनके आवास पिंजरों को वापस । इन विकिरणित चूहों की स्वस्थ स्थिति को माप कर उनके वजन पर नजर रखी जा सकती है.  20% वजन घटाने या अधिक के साथ चूहों euthanized किया जाएगा ।

२. iHep विभेद र पृथक्करण

LDLR heterozygous ko (+/-) or homozygous ko (-/-) मानव iPSCs, या एफ एच रोगी-iPSCs में heterozygous उत्परिवर्तनों के साथ LDLR (एफ एच iPSCs) iHeps उत्पादन करने के लिए उपयोग किया जाता है । LDLR +/-या-/iPSCs और एफ एच iPSCs की पीढ़ी हमारी पिछली रिपोर्ट15में बताई गई है ।

  1. iHeps में iPSCs के विभेद का निर्देशन
    नोट: iHeps में मानव iPSCs के अंतर के लिए विधि एक पिछली रिपोर्ट16से संशोधित किया गया है ।
    1. तीन दिन के अंतर से पहले (दिन-3), बीज extracellular मैट्रिक्स पर iPSCs लेपित 6-अच्छी तरह से प्लेटें ( सामग्री की तालिकादेखें) ३००,००० कोशिकाओं के घनत्व में/अच्छी तरह से १.५ मिलीलीटर में (इसके बाद भी) मानव iPSC रखरखाव मध्यम ( सामग्री की तालिका देखें ) 5 µ एम रॉक अवरोधक (Y27632) के साथ पूरक । संस्कृति एक 5% CO2 humidified मशीन में ३७ ° c पर कोशिकाओं । आम तौर पर, एक 6-well प्लेट से iHeps 5 चूहों engraft करने के लिए पर्याप्त हैं ।
    2. 24 घंटे बाद (दिन-2) और ४८ ज बाद में (दिन-1), रॉक अवरोधक के बिना ताजा मानव iPSC रखरखाव माध्यम के माध्यम बदल जाते हैं ।
      नोट: iPSCs से पहले भिंनता OCT4 और NANOG, जो मात्रात्मक आरटी-पीसीआर, इम्यूनोफ्लोरेसेंस, या प्रवाह cytometry द्वारा जांच की जा सकती है के उच्च स्तर व्यक्त करना चाहिए ।
    3. भेदभाव के 0 दिन में, RPMI १६४० एक बार के साथ कोशिकाओं को धोने और फिर RPMI १६४० १०० एनजी/एमएल Activin एक और 25 एनजी/एमएल WNT3a के साथ पूरक जोड़ें ।
    4. 1 दिन और भेदभाव के 2 दिन, RPMI १६४० १०० एनजी के साथ पूरक के लिए माध्यम बदलने के लिए/एमएल Activin ए
      नोट: यदि इस स्तर पर बहुत अधिक सेल मौत है (दिन 0 – 3), अप करने के लिए ०.५% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) मध्यम करने के लिए जोड़ा जा सकता है कोशिका व्यवहार्यता में सुधार । हालांकि, हम प्रत्येक विशिष्ट iPSC लाइन के लिए जोड़ा जा करने के लिए FBS की ंयूनतम राशि का परीक्षण करने का सुझाव देते हैं, के रूप में अतिरिक्त FBS भी भेदभाव को प्रभावित कर सकते हैं ।
    5. 3 दिन में, एक बार DMEM के साथ कोशिकाओं को धोने और फिर 2एन डी स्टेज मध्यम (20% सीरम प्रतिस्थापन, 1x गैर-आवश्यक अमीनो एसिड, 2 एम एल-glutamine, ०.१ एम बीटा-mercaptoethanol, और sulfoxide माध्यम में 1% dimethyl DMEM) स्विच करने के लिए । मध्यम हर दूसरे दिन 10 दिन तक बदलें ।
      नोट: 7 दिन पर, कोशिकाओं संगम तक पहुंच जाना चाहिए और स्पष्ट किनारों प्रदर्शित । इस स्तर पर दिखने वाले कुछ विभेदक क्षेत्र हो सकते हैं; इन क्षेत्रों का प्रतिशत यदि छोटा है तो उन्हें अनदेखा करें. यदि प्रतिशत अधिक है तो 0 दिन में iPSCs का संगम कम करें और विभेद की प्रथम अवस्था में प्रयुक्त FBS की मात्रा को कम करें ।
    6. 10 दिन में, hepatocyte बेसल मध्यम के साथ कोशिकाओं को धोने एक बार और फिर hepatocyte संस्कृति माध्यम के लिए स्विच 20 एनजी/एमएल मानव यकृत विकास कारक और 20 एनजी/एमएल oncostatin एम के साथ पूरक iHep परिपक्वता को बढ़ावा देने के लिए । मध्यम हर दूसरे दिन बदल जाते हैं ।
      नोट: इस स्तर पर, > कोशिकाओं के 90% HNF4A के लिए सकारात्मक होना चाहिए, इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला या प्रवाह cytometry के अनुसार ।
    7. दिन में 15-17, कोशिकाओं engraftment के लिए तैयार हैं । वैकल्पिक रूप से, सेल संस्कृति के supernatant एकत्र किया जा सकता है और iHeps द्वारा स्रावित एल्ब्युमिन (ALB) को बढ़ाता है के लिए-८० डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत ।
      नोट: इस स्तर पर, > 80% iHeps HNF4A के लिए सकारात्मक होना चाहिए, ALB, और हैं1-antitrypsin (AAT) इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला के अनुसार । लगभग 60-70% दिन के 17 iHeps ASGPR के लिए सकारात्मक होना चाहिए, जैसा कि फ्लो cytometry द्वारा दिखाया गया है । हमारे हाथ में, इस अवधि में iHeps माउस जिगर फिर से भरना करने के लिए इष्टतम क्षमता है; iHeps विट्रो में ALB के उच्च स्तर को स्रावित कर सकते हैं, लेकिन यह भी वृद्ध होनेवाला हो अगर engraftment देरी हो रही है ।
  2. पृथक्करण और एक इंसुलिन सिरिंज में iHeps की लोडिंग
    1. आवश्यक रिएजेंट और सामग्री तैयार करें:
      1. 24 ज से पहले engraftment, गल आवश्यक राशि (V = ४० µ एल * चूहों संख्या) extracellular मैट्रिक्स के एक ठंडे कमरे में एक आइस बॉक्स में, और इंसुलिन सिरिंज और २०० µ l सुझावों का एक बॉक्स में डाल दिया 4 ° c रेफ्रिजरेटर.
      2. एक घंटे से पहले engraftment, गर्म सेल पृथक्करण एंजाइम के साथ पूरक ५० µ जी/एमएल DNase मैं कमरे के तापमान के लिए और जगह RPMI १६४० मध्यम बर्फ पर 20% सीरम प्रतिस्थापन के साथ पूरक ।
    2. कक्ष आकृति विज्ञान, विकास, और कोशिका घनत्व सहित अपनी स्थिति को रिकॉर्ड करने के लिए iHeps के चरण कंट्रास्ट चित्र (100X और 200X) लें ।
    3. कमरे के तापमान Ca 2+ और 2 मिलीग्राम+मुक्त पंजाबियों दो बार के साथ 2 मिलीलीटर के साथ iHeps धो लें, और फिर सेल पृथक्करण एंजाइम के 1 मिलीलीटर के साथ पूरक जोड़ें ५० µ g/एमएल DNase मैं एक अच्छी तरह से करने के लिए । कोशिकाओं को वापस डाल 8 के लिए मशीन में-10 मिनट ।
      नोट: सेल पृथक्करण एंजाइम के साथ सेल पृथक्करण में सुधार करने के लिए, सीए2 + और मिलीग्राम2 +मुक्त पंजाबियों के साथ कोशिकाओं को धो लें । सेल व्यवहार्यता को अधिकतम करने के लिए, हम एक समय में बैच प्रति 6 कुओं से अधिक नहीं dissociating सुझाव देते हैं । इसके अलावा, हम से कम 10 मिनट के लिए सेल पृथक्करण एंजाइम उपचार सीमित सुझाव देते हैं ।
    4. माइक्रोस्कोप के तहत सेल आकृति विज्ञान की निगरानी । जब कोशिकाओं के अधिकांश दौर हो, ठंड RPMI १६४० के एक समान मात्रा 20% सीरम प्रतिस्थापन के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से पूरक जोड़ें, कोशिकाओं धीरे प्लेट से अलग करने के लिए पिपेट, और एक नया 15 एमएल ट्यूब के लिए सेल निलंबन स्थानांतरण ।
      नोट: यह चरण काटा गया कक्षों की व्यवहार्यता के लिए महत्वपूर्ण है । कोशिकाओं को थाली से अलग करने के लिए मुश्किल हैं, तो कुछ कोशिकाओं पर छोड़ दिया जाता है, तो यह बात नहीं है । यदि कोशिकाओं monolayer के बड़े वर्गों के रूप में अलग है, तो पिपेट धीरे के बाद एक सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए केंद्रापसारक ।
    5. प्रत्येक अच्छी तरह से लगभग सभी संलग्न कोशिकाओं को एकत्र कर रहे है जब तक चरण 2.2.4 दोहराएं । 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए २०० x g पर केंद्रापसारक ।
    6. एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में ठंडे पंजाबियों के 2 मिलीलीटर के साथ supernatant और resuspend कोशिकाओं को हटा दें । पिपेट कोशिकाओं को धीरे से एक एकल सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए और फिर 1 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा * असंबद्ध कुओं की संख्या के लिए ठंडे पंजाबियों जोड़ें । अंत में, एक ४० µm सेल छलनी के माध्यम से कोशिकाओं के पास समुच्चय को दूर करने के लिए ।
      नोट: आम तौर पर 1-2 x 106 कोशिकाओं/अच्छी तरह से छानने के बाद काटा जा सकता है ।
    7. Aliquot सेल सस्पेंशन के 20 µ एल और ०.४% trypan ब्लू समाधान के 20 µ एल जोड़ने के लिए, तो एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग कर कोशिकाओं की गणना और "सी" के रूप में सेल निलंबन की एकाग्रता रिकॉर्ड. आवश्यक खंड की गणना (V1 = [106 * (n + 1)] परि/0, जहां n engrafted होने के लिए चूहों की संख्या है) intrasplenic इंजेक्शन के लिए सेल निलंबन (1 लाख/
    8. Aliquot 15 मिलीलीटर ट्यूबों में सेल निलंबन के लिए आवश्यक मात्रा में है और 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए २०० x g पर केंद्रापसारक ।
    9. supernatant निकालें, ठंड पंजाबियों की उचित मात्रा में कोशिकाओं को पुनर्निलंबित (n + 1) सेल निलंबन की मात्रा बनाने के लिए * 55/2 µ एल (एन = चूहों की संख्या), और फिर extracellular मैट्रिक्स के एक बराबर मात्रा सेल निलंबन (n + 1) * ५५ µ एल के अंतिम खंड बनाने के लिए जोड़ें ।
    10. बर्फ पर ठंडा इंसुलिन सिरिंज प्लेस, पिस्टन unplug, सिरिंज में सेल निलंबन के ५५ µ एल हस्तांतरण और फिर पिस्टन वापस डाल दिया । ध्यान से बुलबुले का निर्वहन और वापस बर्फ पर सिरिंज डाल दिया ।
    11. दोहराएँ 2.3.10 जब तक सभी सीरिंज कोशिकाओं के साथ लोड किया गया है. अब इंजेक्शन के लिए सीरिंज तैयार कर रहे हैं ।
      नोट: सेल व्यवहार्यता को अधिकतम करने के लिए, हम पृथक्करण के बाद बर्फ पर कोशिकाओं को रखने की सलाह देते हैं । ऊपर दिए गए चरणों के लिए 2.2.4 – 2.2.11, सुनिश्चित करें कि सभी पुनर्अभिकर्ताओं का उपयोग करने से पहले 2-8 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाता है ।

3. iHeps का Intrasplenic इंजेक्शन

  1. चूहों को Anesthetize के साथ ketamine (१०० मिलीग्राम/किग्रा) और xylazine (10 मिलीग्राम/इंजेक्शन intraperitoneally । संज्ञाहरण प्रक्रिया के दौरान सूखापन को रोकने के लिए चूहों आंखों पर पशु चिकित्सक मरहम लगाओ, और संज्ञाहरण के प्रभाव का पालन और दर्द का आकलन करने के लिए उनकी मांसपेशियों की सजगता की निगरानी ।
  2. एक बार चूहों उत्तेजना के लिए मांसपेशियों पलटा खो दिया है, उन्हें सही पार्श्व decubitus स्थिति में जगह है । 5-8 मिनट के लिए बाएं पार्श्व में चीरा क्षेत्र के लिए लोमनाशक क्रीम की एक मोटी परत लागू करें । फिर, एक पानी से लथपथ धुंध पैड के साथ क्षेत्र पोंछते द्वारा लोमनाशक क्रीम और बालों को हटा दें ।
  3. हाथ धोने povidone के साथ बाएं पार्श्व-आयोडीन या, वैकल्पिक रूप से, ७०% इथेनॉल के साथ 3 बार एक अंतिम povidone के साथ भिगोने-संक्रमण के लिए आयोडीन के द्वारा पीछा किया ।
  4. एक स्तर 2 में एक सुरक्षा कैबिनेट, तिल्ली की स्थिति का पता लगाने, जो बाईं पार्श्व में पारदर्शी ढंग से visualized किया जा सकता है, और फिर incise त्वचा और पेट की दीवार के लिए 0.5 – 1 सेमी. Exteriorize तिल्ली बाहर खींच द्वारा वसा ऊतक के पास धीरे से यह नुकीले का उपयोग संदंश. तिल्ली एक झाड़ू धीरे का उपयोग कर स्थिर ।
  5. तिल्ली के पैरेन्काइमा में 3-4 मिमी के इंसुलिन की सुई डालें और सेल सस्पेंशन के लगभग ५० µ l को धीरे से इंजेक्ट करें. सुई वापस लेना और 1 मिनट के लिए इंजेक्शन साइट पर एक कपास झाड़ू जगह खून बह रहा है और सामग्री के छलकने को रोकने के लिए ।
  6. वापस करने के लिए और 5-0 नायलॉन टांके के साथ घाव बंद करने के लिए तिल्ली । फिर, चूहों एक गर्म कक्ष में रखने के लिए 3-16 एच के लिए उन्हें उनके सामान्य शरीर के तापमान पर लौटने के लिए और उन्हें पुनर्जीवित करने के लिए. चूहों कि सर्जरी आया है जब तक पूरी तरह से बरामद अन्य जानवरों की कंपनी को वापस नहीं कर रहे हैं ।
  7. पीने के पानी के लिए meloxicam (26 μg/एमएल) जोड़ें और buprenorphine सुई (५० μg/किग्रा) विरोधी भड़काऊ दवा और एनाल्जेसिक के रूप में पेशी, क्रमशः । किसी भी सूजन को रोकने के लिए दैनिक सर्जिकल घावों की निगरानी ।
    नोट: सुनिश्चित करें कि सभी उपकरणों और आपूर्ति चरणों में इस्तेमाल किया 4-7 बाँझ हैं.

4. प्लाज्मा एलडीएल का परीक्षण-सी स्तर

  1. दिन में 0, 7, 14, 21, और 28 पोस्ट-engraftment, LRG चूहों कसकर दो हाथ निरोधक विधि का उपयोग कर सिर की ओर की ओर आंदोलन को कम करने के लिए, फिर नुकीला का उपयोग कर चेहरे की नस पंचर । नुकीला को हटाने के बाद खून का बहाव शुरू हो जाएगा । EDTA के 1 µ एल युक्त १.५ मिलीलीटर ट्यूबों में रक्त की ५० µ एल के आसपास ले लीजिए ।
    नोट: यदि पकड़ बहुत तंग है, एकत्र रक्त की मात्रा कम हो सकता है और चूहों कठिनाई सांस लेने के कारण मर सकता है ।
  2. कई बार ट्यूबों पलटने से धीरे खून मिश्रण और फिर 15 मिनट के लिए ९५० x g पर केंद्रापसारक । supernatants लीजिए और उन्हें-८० डिग्री पर तुरंत स्टोर ।
  3. एक बार सभी नमूने एकत्र कर लिए जाते हैं, कमरे के तापमान पर प्लाज्मा गल जाते हैं और निर्माता के मैनुअल के अनुसार एलडीएल-सी डिटेक्शन किट का उपयोग कर एलडीएल-सी लेवल का परीक्षण करते हैं ।

5. Vivo में दवा परीक्षण में Chimeric चूहों Engrafted के साथ LDLR +/-और एफ एच iHeps

  1. विटिलिगो प्रेरित करने के लिए, चूहों एक HFHC आहार 7 दिन पहले engraftment करने के लिए फ़ीड ।
  2. 7 दिन बाद engraftment, वाहन के साथ चूहों के प्रत्येक समूह का इलाज (पंजाब, इंजेक्शन चमड़े के नीचे), 10 मिलीग्राम/किलो/सप्ताह PCSK9 एंटीबॉडी (PCSK9 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के एक नैदानिक ग्रेड तैयार, चमड़े के नीचे भी इंजेक्शन), 10 मिलीग्राम/kg/दिन simvastatin (४० mg/L mg/ पीने के पानी में मिलीलीटर), या संयुक्त PCSK9 एंटीबॉडी और simvastatin ।
  3. 0 दिन (engraftment के दिन), 14, 21, और 28 के बाद engraftment पर माउस प्लाज्मा ले लीजिए । नमूने पर-८० ° c तुरंत स्टोर ।
  4. एक बार सभी नमूने उपलब्ध हैं, परीक्षण प्लाज्मा एलडीएल एक एलडीएल सी का पता लगाने किट का उपयोग कर स्तर, निर्माता के मैनुअल के अनुसार ।

6. Endothelial समारोह परीक्षण

Endothelial समारोह एफ एच में जल्दी प्रभावित होता है और रोग की गंभीरता का एक संकेतक के रूप में हमारे माउस मॉडल में परीक्षण किया जा सकता है या विभिंन उपचार के साथ सुधार का मूल्यांकन । एक stereomicrocope, विच्छेदन संदंश, कैंची, एक तार myograph, अधिग्रहण हार्डवेयर ( सामग्री की तालिकादेखें), और इस के लिए एक कंप्यूटर की जरूरत है ।

  1. १०० मिलीग्राम/phenobarbital के intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा चूहों की कुर्बानी । आंतरिक अंगों को निकालें ताकि रीढ़ की हड्डी के समानांतर उतरते महाधमनी दिखाई दे और अगल-बगल के ऊतकों और दिल के साथ कैंची से बाहर निकाल दिया जा सकता है । काटना ठीक कैंची का उपयोग कर aortae और उन्हें ठंड oxygenated Krebs समाधान (मिमी: ११९ NaCl, ४.७ KCl, २.५ CaCl2, 1 MgCl2, 25 NaHCO3, १.२ KH 2 पीओ4, और 11 डी-ग्लूकोज) में जगह है ।
  2. एक सिलिकॉन लेपित पेट्री डिश के लिए Krebs समाधान में aortae स्थानांतरण । महाधमनी स्थिति को खींचे बिना उसे ठीक करने के लिए संयोजी ऊतक पिन करें । एक stereomicroscope के तहत, ठीक संदंश का उपयोग करने के लिए कैंची वसंत और महाधमनी काटना पोत दीवार को नुकसान पहुंचाए बिना चारों ओर वसा और adventitial ऊतक से मुक्त, तो यह १.५ में कटौती 2 मिमी लंबाई क्षेत्रों ।
  3. एक लगभग 2 सेमी लंबी और ४० माइक्रोन मोटी स्टेनलेस तार में कटौती और धीरे महाधमनी लुमेन के माध्यम से डाल दिया । तार को पकड़कर oxygenated Krebs समाधान से भरे तार myograph चैंबर में खंड को हस्तांतरित करें ।
  4. सिकुड़ना का अध्ययन करते समय aortae सेगमेंट की लंबाई मापने के लिए, प्रत्येक सेगमेंट को सीधा जबड़े के बीच में रखें और माइक्रोमीटर पर रीडिंग (D1) रिकॉर्ड करें. खंड निकालें और एक साथ जबड़े चाल और पढ़ने (डी0) रिकॉर्ड । खंड की लंबाई एल = डी1-डी0होगा ।
  5. तार दबाना और इस पेचकश के जबड़े के बीच में खंड रखने whilst के साथ सुरक्षित करने के लिए उपयोगकर्ता गाइड का पालन करें, लेकिन इसे फैला छोड़ दें ।
  6. प्रयोग करने से पहले सामांयीकरण के लिए, myograph को शूंय पर सेट करें । फिर, धीरे से जबड़े के अलावा ले जाएं और 3 mN तक पहुंचने तक महाधमनी तनाव परिवर्तन का निरीक्षण । 15 मिनट के बाद, myograph चैंबर से समाधान नाली, और ताजा Krebs समाधान के साथ बदलने के लिए, 15 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें और 3 mN फिर से तनाव को समायोजित ।
  7. ६० mM KCl-युक्त Krebs समाधान के लिए मानक Krebs समाधान बदलने के लिए एक संकुचन प्रेरित करने के लिए ंयूनतम 15 मिनट । ताजा Krebs समाधान के साथ 3 बार कुल्ला ।
  8. phenylephrine की बढ़ती सांद्रता जोड़ें (Phe; उदा., 10 एनएम से १०० माइक्रोन) । मानक Krebs समाधान के साथ बाहर धोने और पिछले संकुचन से अधिक से अधिक संकुचन के ~ ७०% पर Phe के एक एकल एकाग्रता जोड़ें । जब संकुचन स्थिर है, acetylcholine की बढ़ती सांद्रता जोड़ें ( उदाहरणके लिए, 1 या 3 एनएम से 10 या 30 µ मी करने के लिए) vasodilation प्रेरित करने के लिए । 1, 2 मिनट के अंतराल पर जोड़ा जाता है ।
    नोट: छोटे Phe प्रेरित संकुचन के साथ कुछ महाधमनी खंडों में, उदाहरण के लिए KCl प्रेरित संकुचन के 30% से छोटे, U46619 (एक और vasoconstrictor) 1 एनएम से 30 एनएम के लिए एक एकाग्रता पर एक स्थिर संकुचन है कि ७०% की तुलना में बड़ा है प्रेरित किया जा सकता है KCl-प्रेरित संकुचन ।
  9. निर्माता के मैनुअल के अनुसार myograph को साफ करें ।
  10. डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग ( सामग्री की तालिकादेखें), दवाओं के हर अतिरिक्त के बाद बल (एफ) रिकॉर्ड. बेसल तनाव के लिए मार्कर ड्रा (एफबेसल) सापेक्ष माप के लिए, fPheके रूप में Phe के बाद उच्चतम बिंदु करने के लिए तीर ले जाएँ, और उसके बाद एफ के रूप में के लिएहर अतिरिक्त के बाद सबसे कम अंक के लिए कदम. की गणना endothelium-प्रेरित-निर्भर vasodilation (EDV)% छूट = (f के लिए-f) (एफ) के आधार पर एफ)/(fPhe-fबेसल) Y-अक्ष पर । एक्स धुरी पर एम में एकाग्रता के log10 मूल्य का उपयोग सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर पर एक एकाग्रता प्रतिक्रिया वक्र तैयार करें ।
  11. सांख्यिकीय अंतर का विश्लेषण करने के लिए, एक माउस से प्रत्येक खंड के वक्र के अंतर्गत क्षेत्र का उपयोग करें, और एक-तरफ़ा ANOVA का उपयोग कर समूहों के बीच वक्र के अंतर्गत क्षेत्र के अंतर का विश्लेषण । व्यक्तिगत अंक भी अगर जरूरत विश्लेषण किया जा सकता है ।

7. माउस जिगर में iHep पुनर्जनसंख्या का सबूत

  1. समापन बिंदु पर, चूहों intraperitoneally इंजेक्शन द्वारा कुर्बानी १०० मिलीग्राम/phenobarbital ।
  2. हृदय पंचर द्वारा प्लाज्मा ले लीजिए । जिगर की काटना पालियों नेत्र कैंची का उपयोग कर, तो एक 10 सेमी पेरि-पकवान और खारा के साथ दो बार धोने में जिगर डाल दिया । शोषक कागज के साथ जिगर की सतह से खारा निकालें, तो चारों ओर ०.६-सेमी लंबाई टुकड़े में पालियों में कटौती । 10% formalin में जिगर की पालियों को ठीक करें ।
  3. तेल और खंड में फिक्स्ड जिगर एंबेड एक ऊतक प्रसंस्करण प्रणाली और एक फिसलने microtome, क्रमशः निर्माता के निर्देशों के अनुसार, का उपयोग कर ।
  4. 1 एच के लिए ६० डिग्री सेल्सियस के लिए स्लाइड गर्मी मोम पिघला । फिर, 5 मिनट के लिए xylene में दो बार स्लाइड विसर्जित, और १००%, ९०%, और ७०% इथेनॉल क्रमिक के साथ ऊतक rehydrat ।
  5. स्लाइड में विसर्जित-कक्ष प्रतिजन पुनर्प्राप्ति समाधान के आसपास ५० मिलीलीटर युक्त, और फिर दबाव कुकर, १.५ मिनट के लिए १२० डिग्री सेल्सियस में चैंबर डाल दिया । स्लाइड को 5 मिनट के लिए पाइप के पानी से धीरे धो लें ।
  6. दाग प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ वर्गों (लगभग १०० µ एल/लक्ष्यीकरण मानव ALB (hALB) और मानव नाभिक प्रतिजन (hNA) । फिर, एक फ्लोरोसेंट लेबल या सहिजन peroxidase के साथ माध्यमिक एंटीबॉडी संयुग्मित के साथ दाग (जो ढाब पता लगाने किट के साथ प्रतिक्रिया करता है) ।
  7. hALB + क्षेत्रों और hNA + कोशिकाओं के प्रतिशत की गणना करने के लिए, विरोधी hALB और विरोधी hNA के साथ दाग स्लाइड स्कैन और पूरे अनुभाग छवियों को पाने के लिए एक स्वचालित स्लाइड स्कैनिंग प्रणाली का उपयोग कर ढाब के साथ प्रतिक्रिया व्यक्त की ।
    नोट: पूरे अनुभाग-स्कैन छवियों immunohistochemistry-सना हुआ जिगर में hALB + क्षेत्रों या hNA + कोशिकाओं पर आधारित एक निष्पक्ष तरीके से repopulateded दक्षता की गणना करने के लिए मददगार हैं. iHep पुनर्जनसंख्या दक्षता की निगरानी करने के लिए एक वैकल्पिक विधि के रूप में, प्लाज्मा मानव एल्ब्युमिन स्तर एक मानव विशिष्ट ALB एलिसा किट का उपयोग कर परीक्षण किया जा सकता है ।
  8. 5x दृश्य के अंतर्गत संबंधित डिजिटल स्लाइड देखने के सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके पूरी स्लाइड को कवर करने के लिए स्नैपशॉट छवियां लें । hALB + क्षेत्रों का प्रतिशत, प्रत्येक स्नैपशॉट छवि के लिए, माइक्रोस्कोप इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए सकारात्मक क्षेत्र (पी) और कुल क्षेत्र (टी) छवि के योग्य है, और छवि का उपयोग करें जंमू रिक्त क्षेत्र (ख) अर्हता प्राप्त करने के लिए । hALB + क्षेत्रों का प्रतिशत P/(T-B) * १००% के रूप में व्यक्त किया जाता है । प्रत्येक समूह के लिए, कम से कम 3 चूहों का चयन किया जाना चाहिए । और प्रत्येक माउस के लिए, जिगर के विभिंन पदों से कम से 4 वर्गों का चयन किया जाना चाहिए ।
  9. hNA + कोशिकाओं का प्रतिशत, प्रत्येक स्नैपशॉट छवि के लिए, बेतरतीब ढंग से एक छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर के साथ क्षेत्र के 1/16 का चयन करें, और फिर मैंयुअल रूप से कुल नाभिक (T) और hNA + नाभिक (N) की संख्या गिनती । hNA का प्रतिशत + N/T * १००% के रूप में व्यक्त की है । प्रत्येक समूह के लिए, कम से कम 3 चूहों का चयन किया जाना चाहिए । प्रत्येक माउस के लिए, जिगर के विभिंन पदों से कम से 4 वर्गों का चयन किया जाना चाहिए ।

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Representative Results

iHeps में मानव iPSCs के विभेद का निर्देशन
जब ७०% संगम तक पहुंचने, मानव iPSCs एक 3 कदम प्रोटोकॉल16 (चित्रा 1 ऊपरी पैनल) के साथ iHeps में विभेदित कर रहे हैं । अन्तः विभेद के ३ दिन बाद iPSC कालोनियाँ ढीला हो जाती हैं और पूर्ण संगम में फैल जाती हैं (चित्रा १ निचला फलक). फिर, 2एन डी स्टेज मध्यम के साथ, hepatoblasts दिखाई देते हैं और पैदा करना. इन कोशिकाओं को भीड़ है, लेकिन इस स्तर (7 दिन, चित्रा 1 निचले पैनल) पर स्पष्ट किनारों दिखा । भेदभाव के 17 दिनों के बाद, ठेठ षट्कोण आकृति विज्ञान के साथ ध्रुवीकरण iHeps प्रकट (चित्रा 1 निचले पैनल) । ये iHeps एक्सप्रेस pHH मार्कर, जिसमें AAT और ALB (चित्रा 2a) शामिल हैं । इसके अलावा, ASGPR का अनुपात + iHeps अपेक्षाकृत अधिक होना चाहिए, के रूप में प्रवाह cytometry (चित्रा बी)15द्वारा मापा ।

Vivo रोग मॉडल में एक एफ एच के उत्पादन एफ एच iHeps का उपयोग
LRG चूहों विटिलिगो विकसित करने में मदद करने के लिए, हम उन्हें एक HFHC आहार के साथ फ़ीड 7 दिन से पहले engraftment (day-7). engraftment के दिन (0 दिन), LRG चूहों के आसपास प्रदर्शन 3-गुना प्लाज्मा एलडीएल सी स्तर (चारों ओर ६०० मिलीग्राम/ 15 दिन-17 iHeps intrasplenic इंजेक्शन के माध्यम से LRG चूहों में engrafted हैं; ये iHeps जल्द ही लिवर पैरेन्काइमा और वहां पैदा करना (चित्रा 3ए) में रहते हैं । अंत बिंदु पर, इन chimeric चूहों के जिगर एकत्र और तय कर रहे हैं, तो hALB और hNA के साथ दाग, दोनों जिनमें से iHep की स्पष्ट सबूत-LRG माउस जिगर में मध्यस्थता जिगर की आबादी hALB और hNA के लिए धुंधलाना के आधार पर दिखाने चाहिए (4a-ए) आंकड़ा । हमारे हाथ में, दोनों LDLR +/और एफ एच iHeps को कम कर सकता है प्लाज्मा एलडीएल सी स्तर काफी 21 दिनों के बाद engraftment (चित्रा 4F) । इस बिंदु पर, एफ एच मानव जिगर chimeric चूहों एफ एच के लिए चिकित्सा परीक्षण किया जा सकता है ।

एफ एच मानव जिगर Chimeric माउस का सत्यापन उपलब्ध दवाओं का उपयोग कर मॉडल
हमारे मॉडल को मांय करने के लिए, हम 2 अच्छी तरह से ज्ञात एलडीएल सी कम दवाओं, simvastatin और PCSK9 एंटीबॉडी (आंकड़ा 5 ए) का इस्तेमाल किया । हमारे डेटा का प्रदर्शन है कि 21 दिनों के उपचार के बाद, PCSK9 एंटीबॉडी के लिए एक मजबूत क्षमता है एलडीएल कम और एफ एच chimeric चूहों में simvastatin से EDV (चित्रा 5B-डी). विशेष रूप से, एच. एफ. chimeric चूहों में PCSK9 एंटीबॉडी के साथ एलडीएल-सी प्लाज्मा की प्रतिशत कमी देखा है कि नैदानिक परीक्षणों में रिपोर्ट4के समान है । इन परिणामों एफ एच के लिए उपंयास दवाओं के नैदानिक परीक्षण के लिए एफ एच iHeps के साथ LRG chimeric चूहों engrafted की क्षमता उपयोगिता प्रदर्शित करता है ।

Figure 1
चित्रा 1: iHeps में मानव iPSCs के विभेद का निर्देशन किया. शीर्ष पैनल, iHeps में iPSC भेदभाव के लिए समयरेखा; कुंजी साइटोकिंस और मीडिया प्रत्येक चरण के लिए दिखाए जाते हैं। (निचला फलक) प्रतिनिधि चरण iHep भेदभाव के विभिंन समय अंक के विपरीत छवियां । KSR: नॉकआउट सीरम प्रतिस्थापन; HCM: हेपैटोसाइट्स संस्कृति माध्यम; एचजीएफ: hepatocyte वृद्धि कारक; OSM: oncostatin मी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: संशोधित भेदभाव प्रोटोकॉल के साथ उत्पादित iHeps के लक्षण वर्णन । (क) विभेद के विभिन्न चरणों में iHeps का इम्यूनोफ्लोरेसेंस. नाभिक की मर्जी रचनाओं में नीले रंग में दाग हैं । (ख) बार ग्राफ ASGPR के प्रतिशत से पता चलता है + iHeps 17 दिन में प्राप्त व्युत्पंन, के रूप में प्रवाह cytometry द्वारा मापा । नमूने 3 स्वतंत्र प्रयोगों में मापा गया; माध्य मान दिखाए जाते हैं और त्रुटि पट्टियां मानक विचलन (SD) इंगित करते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: iHeps के साथ Vivo रोग मॉडल में एक एफ एच के उत्पादन । (एक) LRG चूहों में एफ एच iHeps के intrasplenic इंजेक्शन द्वारा मानव जिगर chimeric चूहों की पीढ़ी के लिए समय रेखा । (ख) बार ग्राफ से पता चलता है कि खिला LRG चूहों HFHC आहार के साथ काफी वृद्धि हुई एलडीएल-C स्तर (n = 10) होता है । P मान चित्र पर इंगित किए गए हैं और एक ख़राब t-परीक्षण का उपयोग करके प्राप्त किए गए थे; माध्य मान दिखाए जाते हैं और त्रुटि पट्टियां माध्य (SEM) के मानक त्रुटि इंगित करते हैं । पैनल बी हमारी पिछली रिपोर्ट15के चित्रा 3I से संशोधित किया गया है। कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: LRG चूहों जिगर की iHep मध्यस्थता जनसंख्या. (एक) प्रतिनिधि पूरे अनुभाग-एक चूहा जिगर में धुंधला hALB की छवि स्कैन LDLR के साथ repopulateded +/iHeps । तीर माउस जिगर में मानव iHeps engrafted के समूहों का संकेत; ज़ूम किए गए अनुभाग दाएँ फलक में दिखाए जाते हैं. (ख) तितर बितर भूखंड ग्राफ (अलग दाता iPSCs से) एक माउस जिगर में iHep-युक्त क्षेत्रों के लिए इसी repopulateded hALB के प्रतिशत से पता चलता है, गणना पूरे खंड पर आधारित था-स्कैन छवियों (n = 19) । मतलब मान दिखाए जाते हैं और त्रुटि पट्टियों एसडी. (ग) engrafted एफ iHeps के साथ एक माउस जिगर में hNA के लिए immunohistochemical धुंधला के प्रतिनिधि छवियों का संकेत मिलता है. (घ) बार ग्राफ LRG माउस जिगर (n = 3) में repopulateded hNA + iHeps (अलग दाता iPSCs से) के प्रतिशत से पता चलता है । मतलब मान दिखाए जाते हैं और त्रुटि पट्टियों को इंगित करते हैं SD. (E) hALB और hNA एक माउस जिगर की लगातार दो वर्गों पर दाग जंगली प्रकार iHeps के साथ repopulateded । (च) बार ग्राफ 21 के बाद दिन engraftment में बेसलाइन से प्लाज्मा एलडीएल सी कमी के प्रतिशत से पता चलता है; n = 5 के लिए LDLR +/-iHeps और n = 6 एफ एच iHeps और वाहन के लिए । P मान चित्र पर इंगित किए गए हैं और एक ख़राब t-परीक्षण का उपयोग करके प्राप्त किए गए थे; मतलब मान दिखाया त्रुटि सलाखों SEM. पैनलों बी, डी, और ई आंकड़ा 3 जीसे संशोधित कर रहे है संकेत मिलता है हमारी पिछली रिपोर्ट15के3I । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5 : PCSK9 एंटीबॉडी मानव जिगर Chimeric LRG चूहों में Simvastatin की तुलना में मजबूत एलडीएल कम करने की क्षमता दिखातेहैं । (क) के योजनाबद्ध दृश्य में vivo ड्रग परीक्षण दृष्टिकोण का उपयोग एफ एच मानव जिगर chimeric चूहों. (बी और सी) प्लाज्मा एलडीएल के प्रतिशत परिवर्तन 14, 21 दिनों में बेसलाइन से सी, और 28 एफ एच chimeric HFHC आहार के साथ खिलाया चूहों में और संकेत दवाओं के साथ इलाज; n चूहों की संख्या इंगित करता है । P मान Kruskal-वालिस परीक्षण का उपयोग करके प्राप्त किए गए थे; मतलब मान और दिखाया त्रुटि पट्टियां SEM. (घ) EDV की सांद्रता बढ़ाने के जवाब में संकेत मिलता है । P मान इंगित की गई एकाग्रता के लिए चित्र पर इंगित किए गए हैं । P मान Dunnett की एकाधिक तुलना के साथ समायोजित दो-तरफ़ा ANOVA का उपयोग कर प्राप्त किए गए; त्रुटि पट्टियों का संकेत SEM. चित्रा 5 हमारी पिछली रिपोर्ट15के चित्र 4a-4c और चित्रा धारा 4 से संशोधित किया गया है। कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

पिछले iHeps कुतर में प्रयोग अध्ययन की पुष्टि की है कि वे एक प्रभावी तरीका है विरासत में मिली जिगर की बीमारियों का अध्ययन17। आगे इस प्रौद्योगिकी के उपयोग का विस्तार करने के लिए और क्योंकि वर्तमान एफ एच पशु मॉडल है इष्टतम, हम LRG चूहों में एफ एच iHeps engrafted और पता चला कि engrafted LDLR +/-या heterozygous LDLR-रूपांतरित होने वाले एफ एच iHeps चूहों प्लाज्मा एलडीएल सी स्तर को कम कर सकते है और vivo मेंलिपिड कम करने वाली दवाओं का जवाब ।

वहां 3 मानव एफ एच जिगर chimeric iHeps का उपयोग कर चूहों पैदा करने के लिए हमारे प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं:
1) उच्च गुणवत्ता का उत्पादन iHeps के माध्यम से निर्देशित विभेद । iPSC लाइनों18के बीच क्लोनिंग परिवर्तनशीलता को देखते हुए, यह उचित तुलना के लिए isogenic iPSCs का उपयोग करने के लिए और इंजीनियरिंग और engraftment प्रदर्शन करने से पहले मां सेल लाइन के iHep विभेदक दक्षता का परीक्षण करने के लिए महत्वपूर्ण है ।

2) सही सिरिंज में iHep अपलोड करें । अंय प्रोटोकॉल से अलग है, हम ५०% extracellular मैट्रिक्स का उपयोग करें (अंतिम एकाग्रता, वी/iHeps resuspend करने के लिए, और फिर उंहें इंसुलिन सिरिंज में अपलोड । हम मानते है कि extracellular मैट्रिक्स कोशिकाओं की रक्षा और एक microenvironment है कि तिल्ली से जिगर में iHep प्रवास की सुविधा प्रदान करता है । बुलबुले सर्जरी के लिए एक घातक कारक हैं और सिरिंज में पूरी तरह से बचा जाना चाहिए ।

3) engrafted कोशिकाओं की सही संख्या । कोशिकाओं के अधिभार भी उच्च मृत्यु दर के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । हम अनुशंसा करते हैं engrafting 1 – 1.5 मिलियन iHeps प्रति 25 – 30 g माउस.

हमारे प्रोटोकॉल भी कुछ सीमाएं हैं: विकिरण द्वारा प्रेरित जिगर की चोट मध्यम और एकल खुराक है, और हमारे iHeps की परिपक्वता राज्य pHH करने के लिए तुलनीय नहीं है । दोनों बातों से संबंधित है, हमारे मॉडल के chimerism की डिग्री हाल ही में मंजूरी का वर्णन की रिपोर्ट के समान है/ SCID/IL-2Rγ−/− चूहों या साध चूहों के साथ engrafted iPSC-व्युत्पन्न iHeps17,19 है, लेकिन काफी कम FRG चूहों से या उपा ट्रांसजेनिक चूहों से engrafted pHH । इस चेतावनी को दूर करने के लिए, एक हाथ पर, एक आगे यकृत भेदभाव प्रोटोकॉल iHeps की परिपक्वता में सुधार करने के लिए अनुकूलित कर सकता है । दूसरी ओर, LRG चूहों को FRG चूहों के साथ पार किया जा सकता है Ldlr-/-/Fah-/-/Rag2-/-/Il2rg- चूहों ।

सारांश में, यहां हम एफ एच iHeps के साथ मानव जिगर chimeric पशुओं पैदा करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन किया है, और engrafted iHeps की कार्यक्षमता के परीक्षण के लिए । महत्वपूर्ण बात, इन chimeric चूहों के लिए vivo दवा परीक्षण में इस्तेमाल किया जा सकता है । हमारे मॉडल की संभावना iHeps की कार्यक्षमता में सुधार या प्राप्तकर्ता LRG चूहों में बाहर दस्तक अतिरिक्त जीन (जैसे, फह) द्वारा अनुकूलित किया जा सकता है, और यह रोग की बीमारी तंत्र की जांच और नैदानिक प्रदर्शन करने के लिए उपयोगी हो जाएगा अध्ययन.

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Disclosures

H.-F.T. ओडिसी परिणाम सनोफी और Regeneron फार्मास्यूटिकल्स द्वारा प्रायोजित अध्ययन के राष्ट्रीय समंवयक और अंवेषक है ।

Acknowledgments

यह काम शेन्ज़ेन विज्ञान और प्रौद्योगिकी परिषद के बुनियादी अनुसंधान कार्यक्रम (JCYJ20150331142757383), चीनी विज्ञान अकादमी (XDA16030502) के सामरिक प्राथमिकता अनुसंधान कार्यक्रम, हांगकांग अनुसंधान अनुदान परिषद विषय आधारित अनुसंधान द्वारा समर्थित किया गया योजना (T12-705/11), हांगकांग विशेष प्रशासनिक क्षेत्र के अनुसंधान अनुदान परिषद के सहयोग कार्यक्रम और चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (एन-HKU730/गुआंग्डोंग प्राकृतिक विज्ञान की अनुसंधान टीम परियोजना) । फाउंडेशन (2014A030312001), गुआंगज़ौ विज्ञान और प्रौद्योगिकी कार्यक्रम (२०१६०७०१००८६), और गुआंग्डोंग प्रांत विज्ञान और प्रौद्योगिकी कार्यक्रम (2016B030229007 और 2017B050506007) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
40 µm Cell strainer BD B4-VW-352340
6-Well plate Thermofisher 140675 Extracellular matrix coated
Accutase Millipore SCR005
Acetylcholine Sigma Aldrich A6625 Dissolve in water
Antigen retrieval solution IHC World IW-1100-1L
Calcium chloride Sigma Aldrich C8106 CaCl2
Cell dissociation enzyme Thermofisher 12604-013 TrypLE
D-glucose Sigma Aldrich D8270
Dimethyl sulfoxide Sigma Aldrich D5879 DMSO
DMEM Thermofisher 10829 Knockout DMEM
DNase I Roche 11284932001
EDTA USB 15694 0.5 M, PH=8.0
Extracellular matrix (for cell suspension) Corning 354234 Matrigel
Extracellular matrix (for iHep differentiation) Corning 354230 Matrigel
Hepatocyte basal medium Lonza CC-3199
Hepatocyte culture medium Lonza CC-3198
High-fat and high-cholesterol diet Research Diet D12079B
Human Activin A Peprotech 120-14E
Human hepatocyte growth factor Peprotech 100-39
Human iPSC maintenance medium STEMCELL Technologies 5850 mTeSR1
Human oncostatin M Peprotech 300-10
Ketamine 10% Alfasan N/A
L-glutamine Thermofisher 35050
LDL-C detection kit WAKO 993-00404 and 993-00504
Magnesium chloride VWR P25108 MgCl2
Meloxicam Boehringer Ingelheim NADA 141-213
Monopotassium phosphate USB S20227 KH2PO4
Non-essential amino acids Thermofisher 11140
PBS GE SH30256.02 Calcium and magnesium-free
PCSK9 antibodies Sanofi and Regeneron Pharmaceuticals SAR236553/REGN727 Alirocumab
Phenobarbital Alfamedic company 013003
Phenylephrine RBI P-133 Dissolve in water
Potassium chloride Sigma Aldrich P9333 KCl
Povidone-iodine Mundipharma Betadine
Recombinant mouse Wnt3a R&D Systems 1324-WN-500/CF
ROCK inhibitor Y27632 Sigma Aldrich Y0503-5MG
RPMI 1640 Thermofisher 21875
Serum replacement Thermofisher 10828
Silicone coated petri dish Dow Corning Sylgard 184 silicone elastomer kit
Simvastatin Merck Sharp & Dohme ZOCOR
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich S6297 NaHCO3
Sodium chloride Sigma Aldrich S7653 NaCl
Trypan blue solution 0.4% Thermofisher 15250061
U-46619 Cayman 16450 Dissolve in DMSO
Xylazine 2% Alfasan N/A
β-mercaptoethanol Thermofisher 31350
Name Company Catalog Number Comments
Antibodies
AAT DAKO A0012 1:400
ALB Bethyl Laboratories A80-129 1:200
ASGPR Santa Cruz Sc-28977 1:100
HNF4A Santa Cruz Sc-6557 1:35
NANOG Stemgent 09-0020 1:200
OCT4 Stemgent 09-0023 1:200
Name Company Catalog Number Comments
Mice
Il2rg-/- Jacson lab 003174
Ldlr-/- Jacson lab 002077
Rag2-/- Jacson lab 008449
Name Company Catalog Number Comments
Equipments
Automated cell counter Invitrogen Countess
Gamma irradiator MDS Nordion Gammacell 3000 Elan II
Insulin syringe BD 324911
Powerlab ADInstruments Model 8/30
Slides scanning system Leica biosystems Aperio scanScope system
Sliding Microtome Leica biosystems RM2125RT
Stereomicrocope Nikon SMZ800
Tissue processing system Leica biosystems ASP200S
Wire myograph DMT 610M
Name Company Catalog Number Comments
Softwares
Digital slide viewing software Leica Aperio ImageScope Version 12.3.2
Image J NIH Version 1.51e
Image processing software Adobe Photoshop CC Version 2015
Microscope imaging software Carl Zeiss AxioVision LE Version 4.7

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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विकास जीवविज्ञान अंक १३९ पारिवारिक विटिलिगो हेपैटोसाइट्स मानव जिगर chimeric चूहों प्रेरित pluripotent स्टेम सेल एलडीएल रिसेप्टर statins PCSK9 एंटीबॉडी
एक पारिवारिक विटिलिगो मानव जिगर Chimeric माउस प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल का उपयोग कर मॉडल-व्युत्पंन हेपैटोसाइट्स
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