Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att generera en människa lever chimära musmodell av familjär hyperkolesterolemi med mänskliga inducerade pluripotenta stamceller-derived hepatocyter. Detta är en värdefull modell för att testa nya terapier för hyperkolesterolemi.
Abstract
Familjär hyperkolesterolemi (FH) är oftast orsakas av LDL-receptorn (Receptorn) mutationer och resulterar i en ökad risk för tidig debut hjärt-kärlsjukdom på grund av markant förhöjda LDL kolesterol (LDL-C) i blodet. Statiner är den första raden av lipidsänkande läkemedel för att behandla FH och andra typer av hyperkolesterolemi, men nya metoder växer fram, i särskilt PCSK9-antikroppar, som nu testas i kliniska prövningar. För att utforska nya terapeutiska metoder för FH, antingen nya läkemedel eller nya formuleringar, behöver vi lämpliga i vivo modeller. Skillnader i de metaboliska lipidprofiler jämfört med människor är dock ett nyckelproblem för de tillgängliga djurmodeller av FH. För att lösa problemet, vi har genererat en människa lever chimära musmodell med FH inducerade pluripotenta stamceller (iPSC)-härledda hepatocyter (iHeps). Vi använde/receptorn- / -/Rag2- / -/Il2rg- / - (LRG) möss att undvika immun avstötning av transplanterade mänskliga celler och bedöma effekten av Receptorn-bristfällig iHeps i en Receptorn null bakgrund. Transplanterade FH iHeps kunde återbefolka 5-10% av LRG mus levern baserat på humant albumin färgning. Dessutom den engrafted iHeps svarat på lipidsänkande läkemedel och återgetts kliniska observationer av ökad effekt av PCSK9 antikroppar jämfört med statiner. Vår mänskliga levern chimära modell kan således vara användbar för preklinisk testning av nya terapier för FH. Med hjälp av samma protokoll, liknande mänskliga levern chimära möss för andra FH genetiska varianter eller mutationer som motsvarar andra ärftliga leversjukdomar, kan också genereras.
Introduction
LDL-receptorn (Receptorn) fångar LDL-kolesterol (LDL-C) i blod att modulera syntesen av kolesterol i levern. Mutationer i Receptorn gen är den vanligaste orsaken till familjär hyperkolesterolemi (FH)1. Statiner har traditionellt varit den första raden i medicin för att behandla FH och andra typer av hyperkolesterolemi (ärvda eller förvärvade). Statiner hämmar 3-hydroxi-3-methylglutaryl-coenzym en reduktas till lägre kolesterolsyntes i levern2. Dessutom ökar statiner Receptorn nivåer på hepatocyte ytan att främja plasma LDL-C clearance. En stor varning för behandling med statiner är dock att de samtidigt inducerar uttryck av proprotein convertase subtilisin/hexin 9 (PCSK9), ett enzym som binder till Receptorn för att främja dess nedbrytning3. Denna effekt är ansvarar för otillräcklig eller ens null svar till statiner hos många patienter. Studera denna mekanism har oväntat lett till upptäckten av ett alternativt sätt att behandla hyperkolesterolemi. PCSK9-antikroppar som nyligen godkändes av FDA används för närvarande i kliniska prövningar och Visa högre effekt och bättre tolerans än statiner4. Framgången av PCSK9 antikroppar innebär också att det kan finnas andra terapeutiska möjligheter att differentiera den Receptorn nedbrytningsvägen (förutom PCSK9) hos patienter med hyperkolesterolemi. Likaså finns det intresse att utveckla nya hämmare av PCSK9 än antikroppar, exempelvis siRNA oligos5.
För att testa nya behandlingar för FH och i allmänhet någon annan typ av hyperkolesterolemi, är lämpligt i vivo modeller nödvändigt. Ett stort problem för nuvarande i vivo modeller, mestadels möss6 och kaniner7, deras fysiologiska skillnader med människor. Dessa problem inkluderar avgörande, en olika metaboliska lipidprofilen. Generering av mänskliga levern chimära djur8 kan bidra till att övervinna denna varning. Den mänskliga leverskada chimär mus är en typ av ”humaniserad” mus med dess levern nyinsatta med humana hepatocyter, exempelvis primära humana hepatocyter (pHH)9. Ett problem med pHH är att de inte kan utökad ex vivo, snabbt förlorar sin funktion vid isolering, och är en begränsad källa. Ett alternativ till pHH är användningen av inducerade pluripotenta stamceller (iPSC)-härledda hepatocyter (iHeps)10. Noterbart iPSCs är patient-specifika och kan odlas på obestämd tid, så iHeps kan produceras på efterfrågan, som är en betydande fördel över färska pHH. Dessutom iPSCs kan också vara enkelt genetiskt manipulerade med designer nukleaser att korrigera eller införa mutationer i en syngena bakgrund att tillåta mer trogen jämförelser11.
Mänskliga levern chimär mus med rekonstituerades pHH uppvisar likheter till människor i leverns metaboliska profiler, drog svaren och känslighet för hepatit virus infektion12. Detta gör dem en bra modell för att studera hyperlipidemi i vivo. Mest använda musmodeller är baserade på/Fah- / -/Rag2- / -/Il2rg- / - (FRG) mus13 och uPA transgena möss8, varav upp till 95% av musen levern kan ersättas pHH. Intressant, beskrivs en färsk rapport en mänsklig FH lever chimär mus (baserat på FRG musen) med pHH från en patient som bär en homozygot Receptorn mutation14. I denna modell, de nyinsatta humana hepatocyterna hade inga funktionella Receptorn, men kvarstående mus hepatocyter gjorde, vilket minskar verktyget för att utföra i vivo tester av droger att förlita sig på Receptorn vägen.
Vi rapporterar här, ett detaljerat protokoll baserat på våra nyligen publicerade arbete15 för implantation FH iHeps in i/receptorn- / -/Rag2- / -/Il2rg- / - (LRG) mus levern. Denna mänskliga levern chimär mus är användbar för modellering FH och utföra drogtester invivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoder som beskrivs här som inbegriper användning av djur har godkänts av utskottet för använda av levande djur i undervisning och forskning (CULATR) av University of Hong Kong.
1. mus förberedelse och fenotypiska test
-
Generering av nedsatt immunförsvar receptorn (KO) knockoutmöss.
- Använda möss stammar receptorn- / -, Rag2- / -, och Il2rg- / - (se Tabell för material).
- Korsa Rag2- / - möss med Il2rg- / - möss att generera Rag2- / -/ Il2rg- / - möss, sedan cross receptorn- / - möss med Rag2- / - / Il2rg- / - möss att generera/receptorn- / -/Rag2- / -/Il2rg- / - (LRG) möss15. På 3 till 4 veckors ålder, samla genomiskt DNA från örat för att ta reda på genotypen av PCR och sekvensering.
- På 8 till 12 veckors ålder, använda LRG hanmöss som mottagare för iHeps för att skapa mänskliga levern chimära möss.
- Mata möss med en hög fetthalt och hög kolesterolhalt (HFHC) diet 7 dagar före iHep transplantation att hjälpa dem att utveckla hyperkolesterolemi.
- För att inducera leverskada som underlättar spridningen av rekonstituerades iHeps i levern, placera mössen i en steril behållare och bestråla dem med en gamma irradiator med γ-strålning vid en dos på 3 Gy 24 h före engraftment. Tillbaka möss till sina bostäder burar. Dessa bestrålade möss friska status kan övervakas genom att mäta deras vikt. Möss med 20% viktminskning eller större kommer bli euthanized.
2. iHep differentiering och Dissociation
Receptorn heterozygot KO (+ /-) eller homozygot KO (- / -) mänskliga iPSCs eller FH patient-iPSCs med heterozygota mutationer i Receptorn (FH iPSCs) används för att producera iHeps. Generering av Receptorn +/- eller- / - iPSCs och FH iPSCs beskrivs i våra tidigare rapport15.
- Dirigerad differentiering av iPSCs in iHeps
Obs: Metoden för differentiering av mänskliga iPSCs in iHeps ändras från en tidigare rapport16.- Tre dagar före differentiering (dag -3), utsäde belagda iPSCs på extracellular matris 6 brunnar (se Tabell för material) med en täthet av 300.000 celler per brunn i 1,5 mL (också nedan) mänskliga iPSC underhåll medium (se tabellen av material ) kompletteras med 5 µM ROCK hämmare (Y27632). Odla cellerna vid 37 ° C i en 5% CO2 befuktade inkubator. Normalt, är iHeps från en 6-well platta tillräckliga för att engraft 5 möss.
- 24 timmar senare (dag -2) och 48 h senare (dag -1), ändra mediet till färska mänskliga iPSC underhåll medium utan ROCK-hämmare.
Obs: iPSCs innan differentiering bör uttrycka höga nivåer av OCT4 och NANOG, som kan undersökas genom kvantitativ RT-PCR, immunofluorescens eller flödescytometri. - På dag 0 av differentiering, tvätta cellerna med RPMI 1640 en gång och sedan lägga RPMI 1640 kompletteras med 100 ng/mL Activin A och 25 ng/mL WNT3a.
- På dag 1 och dag 2 av differentiering, ändra mediet för RPMI 1640 kompletteras med 100 ng/mL Activin A.
Obs: Om det finns för mycket celldöd i detta skede (dagar 0 – 3), upp till 0,5% fetalt bovint serum (FBS) kan läggas till medium att förbättra cellernas viabilitet. Dock föreslår vi testar minimala mängden FBS som ska läggas till för varje specifik iPSC linje, som överskott FBS kan också påverka differentiering. - På dag 3, tvätta cellerna med DMEM en gång och sedan växla till 2nd skede medium (20% serum ersättare, 1 x icke-essentiella aminosyror, 2 M L-glutamin, 0.1 M beta-merkaptoetanol och 1% dimetyl sulfoxid i DMEM medium). Ändra mediet varannan dag tills dag 10.
Obs: På dag 7, cellerna bör ha nått sammanflödet och displayen tydliga kanter. Det kan finnas vissa odifferentierade områden som visas i detta skede. ignorera dem om procentandelen av dessa områden är liten. Om andelen är hög, minska sammanflödet av iPSCs på dag 0 och minska mängden FBS som används i den första etappen av differentiering. - Dag 10, tvätta cellerna med hepatocyte basala medium en gång och sedan växla till hepatocyte odlingsmedium kompletteras med 20 ng/mL mänskliga nedsatt tillväxtfaktor och 20 ng/mL oncostatin M att främja iHep mognad. Ändra mediet varannan dag.
Obs: I detta skede, > 90% av cellerna bör vara positivt för HNF4A, enligt immunofluorescens färgning eller flöde flödescytometri. - Dag 15 – 17 är cellerna redo för engraftment. Alternativt, kan supernatanten av cellkulturen samlas in och lagras vid-80 ° C för att kvantifiera den utsöndrade albumin (ALB) av iHeps.
Obs: I detta skede, > 80% iHeps bör vara positivt för HNF4A, ALB och α1-antitrypsin (AAT) enligt immunofluorescens färgning. Omkring bör 60 – 70% av dag 17 iHeps vara positivt för ASGPR, som framgår av flödescytometri. I våra händer har iHeps på denna period optimal kapacitet att återbefolka mus levern; iHeps kan utsöndra högre nivåer av ALBEN in vitro- men också blivit senescent om engraftment är försenad.
- Dissociation och lastning av iHeps in i en insulinspruta
- Förbereda den nödvändiga reagens och material:
- 24 h före engraftment, Tina det erforderliga beloppet (V = 40 µL * möss nummer) av extracellulära matrix i en is i ett kylrum, och sätta insulinspruta och en låda med 200 µL tips i kylskåp 4 ° C.
- En timme före engraftment, varma cell dissociation enzymet kompletterades med 50 µg/mL DNAS jag till rumstemperatur och placera RPMI 1640 medium kompletteras med 20% serum ersättare på is.
- Ta fas bilder med kontrast (100 X och 200 X) av iHeps att spela in deras status, inklusive cellmorfologi, tillväxt och cell densiteten.
- Tvätta iHeps med 2 mL/väl i rumstemperatur Ca2 + och Mg2 +-fri PBS två gånger, och Lägg sedan till 1 mL av cell dissociation enzym kompletterades med 50 µg/mL DNAS jag till varje brunn. Placera cellerna i inkubatorn för 8 – 10 min.
Obs: För att förbättra cell dissociation med cell dissociation enzym, tvätta cellerna med Ca2 + och Mg2 +-gratis PBS. För att maximera cellernas viabilitet, föreslår vi att separera högst 6 wells per sats i taget. Dessutom föreslår vi att begränsa cell dissociation enzym behandling till mindre än 10 minuter. - Övervaka cellmorfologi under mikroskopet. När de flesta av cellerna blir runda, tillsätt en motsvarande volym av kall RPMI 1640 kompletteras med 20% serum ersättare till varje brunn, Pipettera cellerna försiktigt för att lossa från plåten och överföra cellsuspensionen till en ny 15 mL tub.
Obs: Detta steg är avgörande för skördade cellernas livskraft. Om cellerna är svåra att lossa från plåten, spelar det ingen roll om några av cellerna är kvar. Om cellerna kopplar loss som stora fyrkanter av enskiktslager, sedan Pipettera försiktigt efter centrifugeringen att erhålla en enda cellsuspension. - Upprepa steg 2.2.4 för varje väl tills nästan alla anslutna celler samlas. Centrifugera vid 200 x g under 3 minuter vid 4 ° C.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna med 2 mL kall PBS i en 15 mL tub. Pipettera cellerna försiktigt för att få en encellig suspension och sedan lägga till kalla PBS till en slutlig volym av 1 mL * antal dissocierade brunnar. Slutligen passera cellerna genom en 40 µm cell SIL ta bort aggregat.
Obs: Normalt 1-2 x 106 celler per brunn kan skördas efter filtrering. - Alikvotens 20 µL av cell fjädring och tillsätt 20 µL av 0,4% trypan blå lösning, sedan räkna cellerna med hjälp av en automatiserad cell räknare och anteckna cellsuspension koncentration som ”C”. Beräkna önskad volym (V1 = [106 * (n + 1)] / C, där n är antalet möss att vara rekonstituerades) i (1 miljon/mus) intrasplenic injektionsvätska, cellsuspension.
- Alikvot volymen som krävs av cellsuspensionen i 15 mL rör och centrifugera vid 200 x g under 3 minuter vid 4 ° C.
- Ta bort supernatanten, resuspendera cellerna i lämplig volym av kall PBS att göra volymen av cellsuspensionen (n + 1) * 55/2 µL (n = antal möss), och Lägg sedan till en lika stor volym av extracellulär matrix att göra den slutliga volymen av cellsuspension (n + 1) * 55 µL.
- Placera den kalla insulinspruta på is, dra ut kolven, överför 55 µL cellsuspension i sprutan och sedan sätta kolven tillbaka. Ansvarsfrihet bubblor noggrant och sätta sprutan tillbaka på isen.
- Upprepa 2.3.10 tills alla sprutor har laddats med celler. Sprutorna är nu redo för injektion.
Obs: För att maximera cellernas viabilitet, rekommenderar vi att hålla cellerna på is efter dissociation. De ovanstående stegen 2.2.4–2.2.11, kontrollera alla reagensen förvaras vid 2 – 8 ° C före användning.
- Förbereda den nödvändiga reagens och material:
3. intrasplenic injektion av iHeps
- Söva möss med ketamin (100 mg/kg) och xylazin (10 mg/kg) injiceras intraperitonealt. Sätta vet salva på möss ögon att förhindra torrhet under förfarandet för anestesi, och övervaka deras muskel reflexer för att observera den anestesi effekt och bedöma smärta.
- När möss har förlorat muskelmassa reflex att stimulering, placera dem i rätt laterala decubitus position. Applicera ett tjockt lager av hårborttagningsprodukter grädde till området snitt i den vänstra flanken under 5 – 8 minuter. Ta sedan bort hårborttagningsprodukter grädde och hår genom att torka av området med en vatten fuktad kompress.
- Skrubba den vänstra flanken med povidonjod eller, alternativt, med 70% etanol 3 gånger följt av en sista blötläggning med povidonjod för desinfektion.
- I en nivå 2 biosäkerhet skåp, lokalisera positionen av mjälten, som kan visualiseras transparent i den vänstra flanken, och sedan incisionsfilm hud och bukväggen för 0,5 – 1 cm. Exteriorize mjälte genom att dra ut fettvävnaden försiktigt nära den med spetsiga tången. Stabilisera mjälte med en bomullstuss försiktigt.
- Stick in nålen i insulin sprutan 3 – 4 mm i parenkymet av mjälten och injicera ca 50 µL cellsuspension försiktigt. Kör in nålen och placera en bomullstuss över injektionsstället för 1 minut att förhindra blödning och spill av material.
- Återgå mjälte till bukhinnan och nära såret med 5 – 0 nylon suturer. Sedan, hålla möss i en varm kammare/inkubator för 3 – 16 h att återvända dem till deras normala kroppstemperatur och återuppliva dem. Möss som har opererats returneras inte till företaget av andra djur tills återhämtat sig helt.
- Lägga till meloxikam (26 μg/mL) i dricksvattnet och injicera buprenorfin (50 μg/kg) intramuskulärt som antiinflammatoriska läkemedel och smärtstillande, respektive. Övervaka kirurgiska sår dagligen för att förhindra någon inflammation.
Obs: Kontrollera att alla instrument och förbrukningsartiklar som används i steg 4-7 är sterila.
4. test av Plasma LDL-C nivå
- På dagar 0 hindra 7, 14, 21 och 28 efter engraftment, LRG mössen tätt för att minimera sida-till-sida rörelse av huvudet med dubbelfattad hindra metod, sedan punktera ansikts venen använda lancet. Blod börjar rinna efter avlägsnande av lancet. Samla in cirka 50 µL blod i 1,5 mL rör som innehåller 1 µL av EDTA.
Obs: Om greppet är för snäv, insamlade blodvolymen kan minskas och möss kan dö på grund av andningssvårigheter. - Blanda blodet försiktigt genom att vända rören flera gånger och sedan Centrifugera vid 950 x g i 15 min. samla supernatanterna och lagra dem vid-80 ° C omedelbart.
- När alla prover samlas in, Tina plasma vid rumstemperatur och testa LDL-C nivån med en LDL-C upptäckt kit enligt tillverkarens bruksanvisning.
5. in Vivo drogtester i chimära möss rekonstituerades med Receptorn +/- och FH iHeps
- För att inducera hyperkolesterolemi, mata möss en HFHC diet 7 dagar före engraftment.
- På 7 dagar efter engraftment, behandla varje grupp av möss med fordon (PBS, injiceras subkutant), 10 mg/kg/vecka PCSK9 antikroppar (en klinisk-grade formulering av PCSK9 monoklonala antikroppar, injiceras subkutant alltför), 10 mg/kg/dag simvastatin (40 mg/L mg / mL i dricksvatten), eller kombinerade PCSK9 antikroppar och simvastatin.
- Samla in mus plasma vid dagar 0 (dagen av engraftment), 14, 21 och 28 efter engraftment. Lagra proverna vid-80 ° C omedelbart.
- När alla prover är tillgängliga, testa plasma LDL nivån med en LDL-C upptäckt kit, enligt tillverkarens bruksanvisning.
6. endotelfunktion Test
Endotelfunktion påverkas tidigt i FH och kan provas i vår musmodell som en indikator på svårighetsgraden av sjukdomen eller att utvärdera förbättring med olika behandlingar. En stereomicrocope, dissektion peang, sax, tråd myograph, förvärv hårdvara (se Tabell för material), och en dator behövs för detta.
- Offra möss av intraperitoneal injektion av 100 mg/kg fenobarbital. Ta bort inre organ så att fallande aorta parallellt med ryggraden är synlig och kan vara dissekerade ut av sax tillsammans med intilliggande vävnad och hjärta. Dissekera de aortae med fina sax och placera dem i kall syresatt Krebs lösning (mM: 119 NaCl, 4,7 KCl, 2,5 CaCl2, 1 MgCl2, 25 NaHCO3, 1,2 KH2PO4och 11 D-glukos).
- Överföra aortae i Krebs lösning till en silikon-belagd petriskål. Fäst det connective silkespappret fixar aorta position utan stretching. Under ett stereomikroskop, Använd fin pincett till våren saxen och dissekera aorta fria från omgivande fett och adventitial vävnad utan att skada kärlväggen, sedan skär den i 1,5 till 2 mm längd segment.
- Klipp ett ca 2 cm lång och 40 μm tjock rostfri tråd och försiktigt lägga genom aorta lumen. Överföra segmentet till tråd myograph kammare fylld med syresatt Krebs lösning genom att hålla tråden.
- För att mäta längden på segmenten aortae när man studerar kontraktilitet, placera varje segment vinkelrätt mellan käftarna och post behandlingen (D1) på Mikrometern. Ta bort segmentet och flytta käkarna ihop och spela in läsningen (D0). Längden på segmentet skulle vara L = D1-D0.
- Följ guiden användaren för att klämma kabeln och fäst det med skruvmejseln samtidigt som segmentet mellan käkarna, men lämna det outsträckt.
- För normalisering innan experimentet, ange myograph till noll i positionen utan töjning. Sedan långsamt flytta käken apart och iaktta aorta spänningen ändrar tills de når 3 mN. Efter 15 minuter, drain lösningen från myograph kammaren, och ersätta med färsk Krebs lösning, vänta 15 min och justera spänningen till 3 mN igen.
- Ändra standard Krebs lösningen till 60 mM KCl-innehållande Krebs lösning att inducera en sammandragning i minst 15 min. Skölj med färska Krebs lösning 3 gånger.
- Lägg till ökande koncentrationer av fenylefrin (Phe; t.ex., från 10 nM till 100 μM). Tvätta med Krebs standardlösning och lägga till en enda koncentration av Phe ~ 70% av maximal kontraktion från tidigare sammandragning. När sammandragning är stabil, tillsätt ökande koncentrationen av acetylkolin (ACh; t.ex., från 1 eller 3 nM till 10 eller 30 µM) att framkalla vasodilatation. ACh läggs på ungefär 2 min intervall.
Obs: I vissa aorta segment med små Phe-inducerad kontraktion, till exempel mindre än 30% av KCl inducerade kontraktion, U46619 (en annan vasokonstriktor) vid en koncentration från 1 nM till 30 nM kan användas för att inducera en stabil sammandragning som är större än 70% av KCl-inducerad kontraktion. - Ren myograph enligt tillverkarens bruksanvisning.
- Använda data analys programvara (se Tabell för material), posten kraften (F) efter varje tillsats av droger. Dra markören till basala spänningen (Fbasal) för relativ mätning, flytta pilen till den högsta punkten efter Phe som FPheoch sedan flytta till den lägsta punkten efter varje tillsats av ACh som FACh. Beräkna den ACh-inducerad endotel-beroende vasodilatation (EDV) av % avkoppling = (FACh-Fbasal) / (FPhe-Fbasal) på y-axeln. Förbereda en koncentration responskurva på statistisk programvara med log10 värdet av koncentration i M på x-axeln.
- För att analysera statistiska skillnaden, använda arean under kurvan för varje segment från en mus, och analysera skillnaden mellan arean under kurvan bland grupper med envägs ANOVA. Enskilda punkter kan också analyseras om det behövs.
7. bevis på iHep återinsättning i mus levern
- Vid slutpunkten, offra möss genom att injicera intraperitonealt 100 mg/kg fenobarbital.
- Samla plasma av hjärt punktering. Dissekera lober av levern med oftalmologiska sax, sedan sätta lever i en 10-cm peri-skålen och tvätta två gånger med koksaltlösning. Ta bort saltlösning från levern ytan med absorberande papper, sedan skärs loberna i runt 0,6-cm-långa bitar. Fixa loberna i levern i 10% formalin.
- Bädda in fasta lever i avsnittet använda en vävnad bearbetning system och en slädmikrotom, respektive, enligt tillverkarens instruktioner och paraffin.
- Hetta upp bilderna till 60 ° C för 1 h att smälta vaxet. Sedan doppa glasen i xylen för 5 min två gånger och rehydrera vävnaden med 100%, 90% och 70% etanol successivt.
- Sänk ner bilderna in i bilden-kammaren innehållande cirka 50 mL antigen retrieval lösning, och sedan lägga kammaren i tryckkokaren, 120 ° C i 1,5 min. Tvätta bilderna försiktigt med röret vatten i 5 minuter.
- Fläcken avsnitten med primära antikroppar (ca 100 µL/avsnitt) inriktning mänskliga ALB (hALB) och mänskliga atomkärnor antigen (hNA). Sedan fläcken med sekundära antikroppar konjugerat med en fluorescerande etikett eller pepparrotsperoxidas (som reagerar med DAB upptäckt kit).
- För att beräkna procentandelen hALB + områden och hNA + celler, skanna bilderna fläckade anti-hALB och anti-hNA och reagerade med DAB använder ett automatiserat system för diabilder för att få hela avsnittet bilder.
Obs: Hela avsnitt-scannade bilder är till hjälp att beräkna nyinsatta effektivitet på ett opartiskt sätt baserat på hALB + områden eller hNA + celler i levern immunohistokemi-färgade. Som en alternativ metod för att övervaka iHep återinsättning effektivitet, kan plasma humant albuminnivå testas med hjälp av en mänsklig specifika ALB ELISA kit. - Ta stillbilder att täcka hela bilden med tillhörande digitala bilden visar programvaran under 5 X vy. För att kvantifiera andelen hALB + områden, för varje ögonblicksbild bild, Använd mikroskopet bildprogram för att kvalificera området positivt (P) och den totala arealen (T) av bilden, och bilden J för att kvalificera det tomma området (B). Procentandelen av hALB + områden uttrycks som P/(T-B) * 100%. För varje grupp, bör minst 3 möss väljas. Och för varje mus, minst 4 avsnitt från olika positioner i levern bör väljas.
- För att kvantifiera andelen hNA + celler, för varje ögonblicksbild bild, väljer slumpmässigt 1/16 av området med ett bildbehandlingsprogram, och sedan räkna manuellt antalet totala atomkärnor (T) och hNA + kärnor (N). Procentandelen av hNA + uttrycks som N/T * 100%. För varje grupp, bör minst 3 möss väljas. För varje mus, bör minst 4 avsnitt från olika positioner i levern väljas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dirigerad differentiering av mänskliga iPSCs i iHeps
När den når 70% sammanflödet, mänskliga iPSCs göras åtskillnad mellan in i iHeps med en 3-stegs protokoll16 (figur 1 övre panel). Efter 3 dagar av endoderm differentiering, blivit iPSC kolonier lossade och spred sig till full sammanflödet (figur 1 nedre panelen). Sedan med 2nd skede medium, hepatoblasts visas och föröka. Dessa celler är trångt men visar tydliga kanter i detta skede (dag 7, figur 1 nedre panelen). Efter 17 dagar av differentiering visas polariserade iHeps med typiska hexagon morfologi (figur 1 nedre panelen). Dessa iHeps express pHH markörer, inklusive AAT och ALB (figur 2A). Dessutom bör förhållandet av ASGPR + iHeps vara relativt hög, mätt som flödet flödescytometri (figur 2B)15.
Generation av en FH i Vivo sjukdom modell med FH iHeps
För att hjälpa LRG möss utvecklar hyperkolesterolemi, matar vi dem med en HFHC diet 7 dagar före engraftment (dag -7). På dagen för engraftment (dag 0) Visa LRG möss runt 3-faldig plasma LDL-C-nivå (cirka 600 mg/dL, figur 3B). Dag 15 – 17 iHeps är rekonstituerades till LRG möss via intrasplenic injektion; dessa iHeps snart bor i levern parenkymet och föröka det (figur 3A). Vid slutpunkten, är lever av dessa chimära möss insamlade och fast, sedan fläckade hALB och hNA, som båda bör Visa tydliga bevis på iHep-medierad leversjukdom återinsättning i LRG mus lever baserat på färgning för hALB och hNA (figur 4A-E). I våra händer, kunde både Receptorn +/- och FH iHeps minska plasma LDL-C nivån betydligt 21 dagar efter engraftment (figur 4F). Vid denna punkt, kan FH mänskliga levern chimära möss användas för att testa terapier för FH.
Validering av FH mänskliga levern chimär musmodellen med hjälp av tillgängliga läkemedel
För att validera vår modell, använt vi 2 välkända LDL-C sänkning droger, simvastatin och PCSK9 antikroppar (figur 5A). Våra data visar att 21 dagar efter behandling, PCSK9 antikroppar har en starkare förmåga för LDL-sänkande och EDV än simvastatin i FH chimära möss (figur 5B-D). Särskilt är den observerade procentuell minskningen av plasma LDL-C med PCSK9 antikroppar i FH chimära möss liknande som rapporterats i kliniska prövningar4. Dessa resultat visar den potentiella nyttan av LRG chimära möss rekonstituerades med FH iHeps för preklinisk testning av nya läkemedel för FH.
Figur 1: regi differentiering av mänskliga iPSCs in iHeps.Top panelen, tidslinje för iPSC differentiering in iHeps; viktiga cytokiner och media visas för varje etapp. (Nedre panelen) Representativa fas bilder av olika tidpunkter iHep differentiering i kontrast. KSR: knockout serum ersättning; HCM: hepatocyter odlingsmedium; HGF: hepatocyte tillväxtfaktor; OSM: oncostatin M. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2: karakterisering av iHeps producerad med modifierade differentiering protokoll. (A) immunofluorescens av iHeps i olika skeden av differentiering. Kärnorna är färgade i blått i den sammanslagna kompositioner. (B) Bar graf visar procentandelen av ASGPR + iHeps härrör erhålls på dag 17, mätt med flödescytometri. Prover mättes i 3 oberoende experiment; genomsnittliga värden visas och felstaplar visar standardavvikelsen (SD). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Generation av FH I Vivo sjukdom modell med iHeps. (A) tid linje för generering av mänskliga levern chimära möss som intrasplenic injektion av FH iHeps i LRG möss. (B) Bar visar grafen att utfodra LRG möss med HFHC kost leder till betydligt ökad LDL-C nivå (n = 10). P -värden anges på figuren och erhölls med ett oparat t-test; genomsnittliga värden visas och felstaplar visar standardavvikelsen för medelvärdet (SEM). Panel B ändras från figur 3I våra föregående rapport15. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: iHep Mediated återinsättning av LRG möss lever. (A) representativa hela avsnitt-skannas bilden av hALB färgning i en mus lever nyinsatta med Receptorn +/-iHeps. Pilarna anger kluster av mänskliga iHeps rekonstituerades in i musen levern; zoomade avsnitten visas i den högra panelen. (B) Scatter plot diagrammet visar andelen nyinsatta hALB + motsvarande iHep-innehållande områden i en mus lever (från olika givare iPSCs), beräkningen baserades på hela avsnitt-skannade bilder (n = 19). Genomsnittliga värden visas och felstaplar visar SD. (C) representativa bilder av immunhistokemisk färgning för hNA i en mus lever med rekonstituerades FH iHeps. (D) stapeldiagram visar procentandelen nyinsatta hNA + iHeps (från olika givare iPSCs) i LRG mus lever (n = 3). Genomsnittliga värden visas och felstaplarna indikerar SD. (E) hALB och hNA färgning på två på varandra följande delar av en mus lever nyinsatta med vildtyp iHeps. (F) stapeldiagram visar procentandelen plasma LDL-sänkning från baseline på dag 21 efter engraftment; n = 5 för Receptorn +/-iHeps och n = 6 för FH iHeps och fordonet. P -värden anges på figuren och erhölls med ett oparat t-test; menar värden visas felstaplar visar SEM. paneler B, D och E är modifierad från figur 3 g-3I av våra tidigare rapport15. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : PCSK9 antikroppar visar starkare LDL sänka förmåga än Simvastatin i mänskliga levern chimära LRG möss. (A) Schematisk vy av den i vivo drogtester metod med FH mänskliga levern chimära möss. (B och C) procentuell förändring av LDL-C plasma från baslinjen dagar 14, 21 och 28 i FH chimära möss matas med HFHC kost och behandlas med de angivna läkemedel; n anger antalet möss. P -värden erhölls med ett Kruskal-Wallis test; genomsnittliga värden visas och felstaplarna indikerar SEM. (D), EDV svar på ökande koncentrationer av ACh. P -värden anges på siffran för avlästa koncentrationen. P -värden erhölls med tvåvägs ANOVA justerat med Dunnetts flera jämförelse; felstaplar visar SEM. figur 5 ändras från figur 4A-4 C och figur 5A i våra tidigare rapport15. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tidigare studier med iHeps hos gnagare har bekräftat att de är ett effektivt sätt att studera ärftliga leversjukdomar17. För att ytterligare öka användningen av denna teknik och eftersom nuvarande FH djurmodeller är suboptimal, vi rekonstituerades FH iHeps i LRG möss och visade att den rekonstituerades Receptorn +/- eller heterozygot Receptorn-muterade FH iHeps kan minska möss plasma LDL-C nivå och svara på lipidsänkande läkemedel i vivo.
Det finns 3 kritiska steg i vårt protokoll för generering av mänskliga FH lever chimära möss med iHeps:
(1) produktionen av högkvalitativa iHeps genom riktad differentiering. Tanke klonal variabiliteten mellan iPSC linjer18, är det viktigt att använda syngena iPSCs för korrekt jämförelser och testa iHep differentiering effektiviteten av modercellen linjen innan du utför verkstads och engraftment.
(2) rätt iHep uppladdning i sprutan. Annorlunda än andra protokoll, vi använder 50% extracellulära matrisen (slutliga koncentration, v/v) för att resuspendera iHeps, och sedan överföra dem till insulinspruta. Vi anser att den extracellular matrisen skyddar cellerna och ger ett närmiljön som underlättar iHep migration in i levern från mjälten. Bubblor är en dödlig faktor för kirurgi och bör undvikas helt i sprutan.
(3) rätt antal rekonstituerades celler. Överbelastning av celler kan också leda till hög dödlighet klassar. Vi rekommenderar implantation 1 – 1,5 miljoner iHeps per 25 – 30 g mus.
Våra protokoll också har vissa begränsningar: den leverskada som induceras av bestrålning är måttlig och engångsdos och mognad av vår iHeps inte är jämförbar med pHH. Relaterade till båda överväganden, är graden av chimärism i vår modell liknande till senaste rapporter som beskriver nicka/Lt-SCID/IL-2Rγ−/− möss eller Gunn råttor rekonstituerades med iPSC-derived iHeps17,19 , men betydligt lägre än FRG möss eller uPA transgena möss rekonstituerades med pHH. För att övervinna denna varning, å ena sidan, kan en ytterligare optimera protokollet nedsatt differentiering för att förbättra mognaden av iHeps. Däremot, kunde LRG möss passeras med FRG möss att generera receptorn- / -/Fah- / -/Rag2- / -/Il2rg- / - möss.
I sammanfattning, har här vi beskrivit ett detaljerat protokoll för generering av mänskliga levern chimära djur med FH iHeps, och för att testa funktionaliteten i den engrafted iHeps. Ännu viktigare, kan dessa chimära möss användas för in-vivo drogtester. Vår modell kan sannolikt optimeras genom att förbättra funktionaliteten i iHeps eller slå ut ytterligare gener (t.ex., Fah) i mottagaren LRG möss, och det kommer att vara användbart att undersöka patologiska mekanismer av sjukdomen och utföra prekliniska studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
H.-F.T. är nationell samordnare och utredare av ODYSSEY resultat studien sponsrad av Sanofi och Regeneron Pharmaceuticals.
Acknowledgments
Detta arbete var stöds av Shenzhen Science och Technology rådets grundläggande Research Program (JCYJ20150331142757383), strategisk prioritet forskningsprogram av den kinesiska Vetenskapsakademien (XDA16030502), Hong Kong Research Grant rådet tema baserad forskning Systemet (T12-705/11), samarbete Program av forskning stipendier rådets Hongkongs speciella administrativa Region och National Natural Science Foundation i Kina (N-HKU730/12 och 81261160506), Team forskningsprojekt av Guangdong naturliga vetenskapen Foundation (2014A030312001), Guangzhou Science och Technology Program (201607010086), och Guangdongprovinsen Science och Technology Program (2016B030229007 och 2017B050506007).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 40 µm Cell strainer | BD | B4-VW-352340 | |
| 6-Well plate | Thermofisher | 140675 | Extracellular matrix coated |
| Accutase | Millipore | SCR005 | |
| Acetylcholine | Sigma Aldrich | A6625 | Dissolve in water |
| Antigen retrieval solution | IHC World | IW-1100-1L | |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | C8106 | CaCl2 |
| Cell dissociation enzyme | Thermofisher | 12604-013 | TrypLE |
| D-glucose | Sigma Aldrich | D8270 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | D5879 | DMSO |
| DMEM | Thermofisher | 10829 | Knockout DMEM |
| DNase I | Roche | 11284932001 | |
| EDTA | USB | 15694 | 0.5 M, PH=8.0 |
| Extracellular matrix (for cell suspension) | Corning | 354234 | Matrigel |
| Extracellular matrix (for iHep differentiation) | Corning | 354230 | Matrigel |
| Hepatocyte basal medium | Lonza | CC-3199 | |
| Hepatocyte culture medium | Lonza | CC-3198 | |
| High-fat and high-cholesterol diet | Research Diet | D12079B | |
| Human Activin A | Peprotech | 120-14E | |
| Human hepatocyte growth factor | Peprotech | 100-39 | |
| Human iPSC maintenance medium | STEMCELL Technologies | 5850 | mTeSR1 |
| Human oncostatin M | Peprotech | 300-10 | |
| Ketamine 10% | Alfasan | N/A | |
| L-glutamine | Thermofisher | 35050 | |
| LDL-C detection kit | WAKO | 993-00404 and 993-00504 | |
| Magnesium chloride | VWR | P25108 | MgCl2 |
| Meloxicam | Boehringer Ingelheim | NADA 141-213 | |
| Monopotassium phosphate | USB | S20227 | KH2PO4 |
| Non-essential amino acids | Thermofisher | 11140 | |
| PBS | GE | SH30256.02 | Calcium and magnesium-free |
| PCSK9 antibodies | Sanofi and Regeneron Pharmaceuticals | SAR236553/REGN727 | Alirocumab |
| Phenobarbital | Alfamedic company | 013003 | |
| Phenylephrine | RBI | P-133 | Dissolve in water |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P9333 | KCl |
| Povidone-iodine | Mundipharma | Betadine | |
| Recombinant mouse Wnt3a | R&D Systems | 1324-WN-500/CF | |
| ROCK inhibitor Y27632 | Sigma Aldrich | Y0503-5MG | |
| RPMI 1640 | Thermofisher | 21875 | |
| Serum replacement | Thermofisher | 10828 | |
| Silicone coated petri dish | Dow Corning | Sylgard 184 silicone elastomer kit | |
| Simvastatin | Merck Sharp & Dohme | ZOCOR | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6297 | NaHCO3 |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | NaCl |
| Trypan blue solution 0.4% | Thermofisher | 15250061 | |
| U-46619 | Cayman | 16450 | Dissolve in DMSO |
| Xylazine 2% | Alfasan | N/A | |
| β-mercaptoethanol | Thermofisher | 31350 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| AAT | DAKO | A0012 | 1:400 |
| ALB | Bethyl Laboratories | A80-129 | 1:200 |
| ASGPR | Santa Cruz | Sc-28977 | 1:100 |
| HNF4A | Santa Cruz | Sc-6557 | 1:35 |
| NANOG | Stemgent | 09-0020 | 1:200 |
| OCT4 | Stemgent | 09-0023 | 1:200 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| Il2rg-/- | Jacson lab | 003174 | |
| Ldlr-/- | Jacson lab | 002077 | |
| Rag2-/- | Jacson lab | 008449 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Automated cell counter | Invitrogen | Countess | |
| Gamma irradiator | MDS Nordion | Gammacell 3000 Elan II | |
| Insulin syringe | BD | 324911 | |
| Powerlab | ADInstruments | Model 8/30 | |
| Slides scanning system | Leica biosystems | Aperio scanScope system | |
| Sliding Microtome | Leica biosystems | RM2125RT | |
| Stereomicrocope | Nikon | SMZ800 | |
| Tissue processing system | Leica biosystems | ASP200S | |
| Wire myograph | DMT | 610M | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Softwares | |||
| Digital slide viewing software | Leica | Aperio ImageScope Version 12.3.2 | |
| Image J | NIH | Version 1.51e | |
| Image processing software | Adobe | Photoshop CC Version 2015 | |
| Microscope imaging software | Carl Zeiss | AxioVision LE Version 4.7 |
References
- Brown, M. S., Goldstein, J. L. A receptor-mediated pathway for cholesterol homeostasis. Science. 232 (4746), 34-47 (1986).
- Endo, A. The discovery and development of HMG-CoA reductase inhibitors. J Lipid Res. 33 (11), 1569-1582 (1992).
- Dubuc, G., et al. Statins upregulate PCSK9, the gene encoding the proprotein convertase neural apoptosis-regulated convertase-1 implicated in familial hypercholesterolemia. Arterioscler Thrombo Vasc Biol. 24 (8), 1454-1459 (2004).
- Robinson, J. G., et al. Efficacy and safety of alirocumab in reducing lipids and cardiovascular events. N Engl J Med. 372 (16), 1489-1499 (2015).
- Fitzgerald, K., et al. Effect of an RNA interference drug on the synthesis of proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) and the concentration of serum LDL cholesterol in healthy volunteers: a randomised, single-blind, placebo-controlled, phase 1 trial. Lancet. 383 (9911), 60-68 (2014).
- Ishibashi, S., et al. Hypercholesterolemia in low density lipoprotein receptor knockout mice and its reversal by adenovirus-mediated gene delivery. J Clin Invest. 92 (2), 883-893 (1993).
- Watanabe, Y. Serial inbreeding of rabbits with hereditary hyperlipidemia (WHHL-rabbit). Atherosclerosis. 36 (2), 261-268 (1980).
- Carpentier, A., et al. Engrafted human stem cell-derived hepatocytes establish an infectious HCV murine model. J Clin Invest. 124 (11), 4953-4964 (2014).
- Tateno, C., et al. Near completely humanized liver in mice shows human-type metabolic responses to drugs. Am J Pathol. 165 (3), 901-912 (2004).
- Basma, H., et al. Differentiation and transplantation of human embryonic stem cell-derived hepatocytes. Gastroenterology. 136 (3), 990-999 (2009).
- Soldner, F., et al. Generation of isogenic pluripotent stem cells differing exclusively at two early onset Parkinson point mutations. Cell. 146 (2), 318-331 (2011).
- Bissig, K. D., et al. Human liver chimeric mice provide a model for hepatitis B and C virus infection and treatment. J Clin Invest. 120 (3), 924-930 (2010).
- Azuma, H., et al. Robust expansion of human hepatocytes in Fah(-/-)/Rag2(-/-)/Il2rg(-/-) mice. Nat Biotechnol. 25 (8), 903-910 (2007).
- Bissig-Choisat, B., et al. Development and rescue of human familial hypercholesterolaemia in a xenograft mouse model. Nat Commun. 6, 7339 (2015).
- Yang, J., et al. Generation of human liver chimeric mice with hepatocytes from familial hypercholesterolemia induced pluripotent stem cells. Stem Cell Rep. 8 (3), 605-618 (2017).
- Kajiwara, M., et al. Donor-dependent variations in hepatic differentiation from human-induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (31), 12538-12543 (2012).
- Chen, Y., et al. Amelioration of hyperbilirubinemia in gunn rats after transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes. Stem Cell Rep. 5 (1), 22-30 (2015).
- Ortmann, D., Vallier, L. Variability of human pluripotent stem cell lines. Curr Opin Genet Dev. 46, 179-185 (2017).
- Liu, H., Kim, Y., Sharkis, S., Marchionni, L., Jang, Y. Y. In vivo liver regeneration potential of human induced pluripotent stem cells from diverse origins. Sci Transl Med. 3 (82), 82ra39 (2011).
