Summary
Her presenterer vi en protokoll for å generere en menneskelig leveren chimeric musemodell familiær hyperkolesterolemi med menneskelige indusert pluripotent Stamcelle-avledet hepatocytter. Dette er en verdifull modell for å teste nye behandlingsformer for hyperkolesterolemi.
Abstract
Familiær hyperkolesterolemi (FH) er hovedsakelig forårsaket av lav tetthet lipoprotein reseptor (LDLR) mutasjoner og resulterer i en økt risiko for tidlig kardiovaskulær sykdom på grunn av merket heving av LDL kolesterol (LDL-C) i blodet. Statiner er den første linjen i lipidsenkende legemidler for behandling av FH og andre typer hyperkolesterolemi, men nye tilnærminger er nye, i bestemt PCSK9 antistoffer, som nå blir testet i kliniske forsøk. For å utforske nye behandlingsmetoder for FH, nye stoffer eller nye formuleringer, trenger vi passende i vivo modeller. Forskjeller i lipid metabolske profiler i forhold til mennesker er imidlertid et viktig problem av tilgjengelige dyr modeller av FH. For å løse dette problemet, vi har generert en menneskelig leveren chimeric musemodell med FH indusert pluripotent stilk cellen (iPSC)-avledet hepatocytter (iHeps). Vi brukte/Ldlr- / -/Rag2- / -/Il2rg- / - (LRG) mus å unngå uimottakelig avvisning av transplantert menneskelige celler og å vurdere effekten av LDLR-mangelfull iHeps i en LDLR null bakgrunn. Transplantert FH iHeps kunne gjenbefolke 5-10% av LRG musen leveren basert på menneskelige albumin flekker. Videre engrafted iHeps svart lipidsenkende legemidler og recapitulated kliniske observasjoner av økt effekt av PCSK9 antistoffer sammenlignet statiner. Våre menneskelige leveren chimeric modellen kan dermed være nyttig for prekliniske testing av nye behandlingsformer å FH. Bruke samme protokoll, ligner menneskelige leveren chimeric mus for andre FH genetisk varianter eller mutasjoner tilsvarer andre arvede leversykdom kan også genereres.
Introduction
Lav tetthet lipoprotein reseptor (LDLR) fanger LDL kolesterol (LDL-C) i blodet å modulere syntesen av kolesterol i leveren. Mutasjoner i genet LDLR er den hyppigste årsaken til familiær hyperkolesterolemi (FH)1. Statiner har tradisjonelt vært den første linjen i medisiner til å behandle FH og andre typer hyperkolesterolemi (arvet eller ervervet). Statiner hemme 3-hydroxy-3-methylglutaryl-koenzym en reduktase å senke kolesterol syntese i leveren2. I tillegg øke statiner LDLR nivåene på hepatocyte overflaten å markedsføre plasma LDL-C klaring. En stor påminnelse behandling med statiner er imidlertid at de samtidig induserer uttrykk for proprotein konvertasene subtilisin/hexin 9 (PCSK9), et enzym som binder til LDLR å fremme sin fornedrelse3. Denne effekten er ansvarlig for tilstrekkelig eller selv null svaret statiner observert i mange pasienter. Studere denne mekanismen har uventet førte til oppdagelsen av en alternativ måte å behandle hyperkolesterolemi. PCSK9 antistoffer nylig godkjent av FDA for tiden blir brukt i kliniske forsøk og vise høyere effekt og bedre toleranse enn statiner4. Suksessen til PCSK9 antistoffer innebærer også at det kan være andre terapeutiske muligheter å modulere LDLR fornedrelse veien (foruten PCSK9) hos pasienter med hyperkolesterolemi. Tilsvarende er det interesse i å utvikle nye hemmere av PCSK9 enn antistoffer, for eksempel siRNA oligos5.
For å teste nye behandlingsformer for FH og generelt andre typen hyperkolesterolemi, er riktig i vivo modeller nødvendig. Et stort problem for gjeldende i vivo modeller, hovedsakelig mus6 og kaniner7, deres fysiologiske forskjeller med mennesker. Avgjørende, inkluderer disse problemene en annen lipid metabolske profil. Generering av menneskelig leveren chimeric dyr8 kan bidra til å overvinne denne påminnelse. Menneskelige leveren chimeric musen er en "humanized" mus med sin lever på nytt med menneskelige hepatocytter, for eksempel primære menneskelige hepatocytter (pHH)9. Et problem med pHH er at de ikke kan utvidet ex vivo, raskt mister sin funksjon på isolasjon, og er en begrenset kilde. Et alternativ til pHH er bruk av indusert pluripotent stamceller (iPSC)-avledet hepatocytter (iHeps)10. Spesielt iPSCs er pasient-spesifikk og kan dyrkes på ubestemt tid, slik at iHeps kan produseres på forespørsel, som er en betydelig fordel over ferske pHH. Videre kan iPSCs også være enkelt genetisk konstruert med designer nucleases eller introdusere mutasjoner i en isogenic bakgrunn å tillate mer trofast sammenligninger11.
Menneskelige leveren chimeric mus med engrafted pHH vise likheter til mennesker i leveren metabolske profiler, narkotika svar og mottakelighet for hepatitt virus infeksjon12. Dette gjør dem en god modell å studere hyperlipidemi i vivo. Den mest brukte musen modeller er basert på/Fah- / -/Rag2- / -/Il2rg- / - (FRG) musen13 og uPA transgene musen8, i opptil 95% av musen leveren kan erstattes av pHH. Interessant beskrevet en fersk rapport en menneskelig FH leveren chimeric mus (basert på FRG musen) med pHH fra en pasient med en homozygous LDLR mutasjon14. I denne modellen, de repopulated menneskelige hepatocytter hadde ingen funksjonell LDLR, men gjenværende musen hepatocytter, dermed redusere verktøyet til å utføre i vivo testing av narkotika stole på den LDLR sti.
Vi rapporterer her en detaljert protokoll basert på våre nylig publisert arbeid15 for engrafting FH iHeps inn i/Ldlr- / -/Rag2- / -/Il2rg- / - (LRG) musen leveren. Denne menneskelige leveren chimeric musen er nyttig for modellering FH og utføre narkotikatesting i vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metodene som er beskrevet her, og som involverer bruk av dyr har blitt godkjent av komiteen for bruk av bo dyrene i undervisning og forskning (CULATR) på Universitetet i Hongkong.
1. musen forberedelse og fenotypiske Testing
-
Generering av immunodeficient Ldlr knockout (KO) mus.
- Bruke mus stammer Ldlr- / -, Rag2- /-og Il2rg- / - (se Tabell for materiale).
- Cross Rag2- / - mus med Il2rg- / - mus til å generere Rag2- / -/ Il2rg- / - mus, deretter krysse Ldlr- / - mus med Rag2- / - / Il2rg- / - mus til å generere/Ldlr- / -/Rag2- / -/Il2rg- / - (LRG) mus15. I en alder av 3 til 4 uker, samle genomisk DNA fra øret å bestemme genotype PCR og sekvenser.
- I en alder av 8 til 12 uker, kan du bruke mannlige LRG mus som mottakere av iHeps for å generere menneskelige leveren chimeric mus.
- Mate mus med en høy-basin og høy-kolesterol diett (HFHC) 7 dager før iHep transplantasjon utvikle hyperkolesterolemi.
- For å indusere skader som forenkler spredning av engrafted iHeps i leveren, plassere mus i en sterile containeren og irradiate dem med en gamma irradiator γ-stråler på en dose av 3 Gy 24 h før engraftment. Deretter tilbake mus til burene bolig. Sunne status for disse bestrålt mus kan overvåkes ved å måle deres vekt. Mus med 20% vekttap eller større vil være euthanized.
2. iHep differensiering og dissosiasjon
LDLR heterozygote KO (+/-) eller homozygous KO (- / -) menneskelige iPSCs eller FH pasient-iPSCs med heterozygote mutasjoner i LDLR (FH iPSCs) brukes til å produsere iHeps. Generering av LDLR +/- eller- / - iPSCs og FH iPSCs er beskrevet i vår forrige rapport15.
- Rettet differensiering av iPSCs i iHeps
Merk: Metoden for differensiering av menneskelig iPSCs i iHeps er endret fra en tidligere rapport16.- Tre dager før differensiering (dag -3), frø belagt iPSCs på ekstracellulær matrix 6-vel plater (se Tabell for materiale) på en tetthet av 300.000 celler/godt i 1,5 mL (også heretter) av menneskelig iPSC vedlikehold medium (se tabell for materiale ) med 5 µM ROCK hemmer (Y27632). Kultur cellene på 37 ° C i en 5% CO2 fuktet inkubator. Vanligvis er iHeps fra en 6-vel plate tilstrekkelig til å engraft 5 mus.
- 24 timer senere (dag -2) og 48 timer senere (dag -1), endre mediet til friske menneskelige iPSC vedlikehold medium uten ROCK inhibitor.
Merk: iPSCs før differensiering bør uttrykke høye nivåer av OCT4 og NANOG, som kan undersøkes ved kvantitative RT PCR, immunofluorescence eller flowcytometri. - På dag 0 av differensiering, vaske cellene med RPMI 1640 én gang og deretter legge RPMI 1640 supplert med 100 ng/mL Activin A og 25 ng/mL WNT3a.
- På dag 1 og tid 2 av differensiering, endre mediet for RPMI 1640 supplert med 100 ng/mL Activin A.
Merk: Hvis det er for mye celledød på dette stadiet (dager 0-3), opp til 0,5% fosterets bovin serum (FBS) kan legges til medium å forbedre celle levedyktighet. Imidlertid foreslår vi testing minimalt med FBS legges for hver bestemt iPSC linje, som overflødig FBS kan også påvirke differensiering. - På dag 3, vask cellene med DMEM en gang og deretter bytte til 2nd scenen middels (20% serum erstatning, 1 x ikke-essensielle aminosyrer, 2 M L-glutamin, 0.1 M beta-mercaptoethanol og 1% dimethyl sulfoxide i DMEM medium). Endre mediet annenhver dag til dag 10.
Merk: På dag 7, cellene bør ha nådd samløpet og utfoldelse klare kanter. Det kan være noen udifferensierte områder på dette stadiet; ignorere dem hvis prosentandelen av disse områdene er liten. Hvis prosenten er høy, redusere der iPSCs på dag 0 og redusere FBS brukes i den første fasen av differensiering. - På dag 10 vask cellene med hepatocyte basale medium en gang og deretter bytte til hepatocyte kultur medium med 20 ng/mL menneskelige hepatic vekstfaktor og 20 ng/mL oncostatin M å fremme iHep modning. Endre mediet annenhver dag.
Merk: på dette stadiet, > 90% av cellene skal være positivt for HNF4A, ifølge immunofluorescence flekker eller flow cytometri. - På dag 15 – 17: cellene er klar for engraftment. Nedbryting av cellekultur kan eventuelt samles og lagres ved-80 ° C for kvantifisering av secreted albumin (ALB) av iHeps.
Merk: på dette stadiet, > 80% iHeps bør være positivt for HNF4A, ALB og α1-antitrypsin (AAT) ifølge immunofluorescence flekker. Rundt bør 60-70% av dagen 17 iHeps være positivt for ASGPR, som vist av flowcytometri. I våre hender har iHeps i denne perioden optimal kapasitet å gjenbefolke musen leveren; iHeps kan utsondre høyere nivåer av ALB i vitro men også bli senescent hvis engraftment er forsinket.
- Dissosiasjon og lasting av iHeps i en insulinsprøyte
- Forbered nødvendig reagenser og materiell:
- 24 timer før engraftment, tine den nødvendige mengden (V = 40 µL * mus tall) av ekstracellulær matrix i en isen boksen i en kjølerom, og sette insulin sprøyten og en boks med 200 µL tips i 4 ° C kjøleskap.
- En time før engraftment, varm celle dissosiasjon enzymet supplert med 50 µg/mL DNase jeg til romtemperatur og plasser RPMI 1640 mediet med 20% serum erstatning på is.
- Ta fase kontrast bilder (100 X og 200 X) av iHeps å spille inn deres status, inkludert celle morfologi, vekst og celle tetthet.
- Vask iHeps med 2 mL/vel av romtemperatur Ca2 + og Mg2 +-gratis PBS to ganger, og deretter legge 1 mL av cellen dissosiasjon enzym supplert med 50 µg/mL DNase jeg i hver brønn. Sett cellene tilbake i inkubator for 8-10 minutter.
Merk: For å forbedre celle dissosiasjon med cellen dissosiasjon enzym, vaske cellene med Ca2 + og Mg2 +-gratis PBS. For å maksimere celle levedyktighet, foreslår vi dissociating ikke mer enn 6 brønner per gruppe samtidig. Videre bør begrense celle dissosiasjon enzym behandling til mindre enn 10 minutter. - Overvåke celle morfologi under mikroskopet. Når de fleste av cellene blir runde, legge til en lik mengde kalde RPMI 1640 supplert med 20% serum erstatning i hver brønn, Pipetter cellene forsiktig å koble fra platen og overføre celle suspensjon til en ny 15 mL tube.
Merk: Dette trinnet er viktig for høstet cellenes levedyktighet. Hvis cellene er vanskelig å løsne fra platen, spiller det ingen rolle om noen av cellene er igjen. Hvis cellene koble som store firkanter av monolayer, deretter Pipetter forsiktig etter sentrifugering å få en enkeltcelle suspensjon. - Gjenta trinn 2.2.4 for hver godt til nesten alle tilknyttede celler samlet. Sentrifuger 200 x g i 3 minutter på 4 ° C.
- Fjern nedbryting og resuspend celler med 2 mL kaldt PBS i en 15 mL tube. Pipetter cellene forsiktig å få en enkeltcelle suspensjon og deretter legge til kalde PBS et endelig antall 1 mL * antall dissosiert brønner. Endelig passere cellene gjennom en 40 µm celle sil for å fjerne aggregat.
Merk: Vanligvis 1-2 x 106 celler/godt kan høstes etter filtrering. - Aliquot 20 µL av celle suspensjon og legge til 20 µL av 0,4% trypan blå løsning, telle celler ved hjelp av en automatisert celle teller og registrere konsentrasjonen av cellen suspensjon som "C". Beregne et bestemt volum (V1 = [106 * (n + 1)] / C, der n er antallet mus å være engrafted) av cellen suspensjon (1 million/mus) for intrasplenic injeksjon.
- Aliquot et bestemt volum av cellen suspensjon i 15 mL rør og sentrifuger 200 x g i 3 minutter på 4 ° C.
- Fjerne nedbryting, resuspend cellene i riktig volumet av kaldt PBS å gjøre volumet av cellen suspensjon (n + 1) * 55/2 µL (n = antall mus), og deretter legge til en lik mengde ekstracellulær matrix å gjøre det siste bindet av cellen suspensjon (n + 1) * 55 µL.
- Plasser kaldt insulin sprøyten på is, koble stempelet, overføre 55 µL av cellen suspensjon i sprøyten og deretter sette stempelet tilbake. Utslipp bobler nøye og putte sprøyten tilbake på isen.
- Gjenta 2.3.10 til alle sprøyter er lastet med celler. Sprøyter er nå klar for injeksjon.
Merk: for å maksimere celle levedyktighet, anbefaler vi å holde cellene i isen etter dissosiasjon. For det over skritt 2.2.4–2.2.11, sikre alle reagenser holdes i 2-8 ° C før bruk.
- Forbered nødvendig reagenser og materiell:
3. intrasplenic injeksjon for iHeps
- Bedøve mus med ketamin (100 mg/kg) og xylazine (10 mg/kg) injisert intraperitoneally. Sette vet salve på mus øyne å hindre tørrhet under anesthesia prosedyren og overvåke muskel refleksene å observere av bedøvelsen effekt og vurdere smerter.
- Når mus har mistet muskel refleks til stimulering, plass dem i høyre lateral liggesår posisjon. Bruke et tykt lag av depilatory fløte snitt området i venstre flanke for 5-8 min. Deretter fjerne depilatory fløte og hår ved å tørke området med en vann-fuktet gasbind puten.
- Skrubbe venstre flanke med povidon-jod eller alternativt med 70% etanol 3 ganger etterfulgt av en siste soaking med povidon-jod ved desinfisering.
- En nivå 2 biosafety skap, Finn plasseringen av milten, som kan visualiseres transparent i venstre flanke, og deretter incise huden og bukveggen for 0,5-1 cm. Exteriorize milten ved å trekke ut fettvev forsiktig nær med spisse tang. Stabilisere milten bruker en vattpinne forsiktig.
- Sett inn nålen av insulin 3-4 mm i parenchyma av milten og injisere ca 50 µL av cellen suspensjon forsiktig. Trekke nålen og plassere en bomullspinne over injeksjonsstedet 1 minutt å forhindre blødning og søl av materiale.
- Hjem milten til peritoneum lukke såret med 5-0 nylon sømmer. Så, holde mus i en varm kammer/inkubator 3-16 h å returnere dem til deres normal kroppstemperatur og gjenopplive dem. Mus som har gjennomgått kirurgi tilbake ikke til selskapet av andre dyr til helt frisk.
- Legg har meloksikam (26 μg/mL) i drikkevannet og injisere buprenorfin (50 μg/kg) intramuskulært som anti-inflammatorisk narkotika og smertestillende, henholdsvis. Skjermen kirurgisk sår daglig for å hindre eventuelle betennelse.
Merk: Kontroller at alle instrumenter og utstyr brukt i trinn 4-7 er sterile.
4. test av Plasma LDL-C nivå
- På dager 0 holde 7, 14, 21 og 28 etter engraftment, LRG musene tett for å minimere siden til bevegelse av hodet bruke to-hånds holde metoden, så punktering ansikts venen bruker lancet. Blodet begynner å strømme etter fjerning av lancet. Samle rundt 50 µL av blod inn i 1,5 mL rør som inneholder 1 µL av EDTA.
Merk: Hvis grep er for stramt, samlet blod volumet reduseres og mus kan dø på grunn av åndedrag problemet. - Bland blodet forsiktig ved å snu rør flere ganger og deretter sentrifuge 950 x g for 15 min. samle supernatants og lagre dem på-80 ° C umiddelbart.
- Når alle prøvene er samlet, tine plasma ved romtemperatur og teste LDL-C nivået med en LDL-C oppdagelsen utstyr i henhold til produsentens håndbok.
5. i Vivo narkotikatesting i Chimeric mus Engrafted med LDLR +/- og FH iHeps
- For å indusere hyperkolesterolemi, mate mus HFHC diett 7 dager før engraftment.
- På 7 dager etter engraftment, behandle hver gruppe mus med kjøretøy (PBS, injisert subcutaneously), 10 mg/kg/uke PCSK9 antistoffer (en klinisk-grade formulering av PCSK9 monoklonale antistoffer, injisert subcutaneously også), 10 mg/kg/dag simvastatin (40 mg/L mg / mL i drikkevann), eller kombinert PCSK9 antistoffer og simvastatin.
- Samle musen plasma på dager 0 (dag med engraftment), 14, 21 og 28 etter engraftment. Lagre prøvene ved-80 ° C umiddelbart.
- Når alle prøvene er tilgjengelig, kan du teste plasma LDL nivået med en LDL-C oppdagelsen utstyr, i henhold til produsentens håndbok.
6. endothelial funksjon Test
Endothelial funksjon påvirkes tidlig i FH og kan testes i våre musemodell som en indikator på alvorlighetsgraden av sykdommen eller vurdere forbedring med ulike behandlinger. En stereomicrocope, disseksjon tang, saks, en ledning myograph, oppkjøp maskinvare (se Tabell for materiale), og en datamaskin er nødvendig for dette.
- Ofre mus ved intraperitoneal injeksjon av 100 mg/kg fenobarbital. Fjern indre organer slik at synkende aorta parallell med ryggraden er synlig og kan være dissekert ut av saks tilstøtende vev og hjertet. Analysere aortae med fine saks og legg dem i kaldt oksygenrikt Krebs løsning (mM: 119 NaCl, 4.7 KCl, 2,5 CaCl2, 1 MgCl2, 25 NaHCO3, 1,2 KH2PO4og 11 D-glukose).
- Overføre aortae i Krebs løsning til en silikon-belagt Petriskål. PIN connective vev å fastsette aorta posisjonen uten strekker det. Under en stereomicroscope, bruk fint tang våren saksen og dissekere aorta fri fra de omkringliggende fett og adventitial vev uten å skade fartøyet veggen, deretter skjære den 1,5 til 2 mm lengde segmenter.
- Kutte en ca 2 cm lang og 40 μm tykk rustfritt wire og forsiktig plassere gjennom aorta lumen. Overføre segmentet til wire myograph kammeret fylt med oksygenrikt Krebs løsning ved å holde wire.
- For å måle lengden på aortae segmentene ved å studere contractility, plassere hvert segment vinkelrett mellom jaws og posten lesing (D-1) på mikrometer. Fjerne segmentet og flytte kjevene sammen og registrere lesing (D0). Segmentet ville bli L = D1-D0.
- Følg brukerhåndboken for å klemme ledningen og fest den med skrutrekkeren mens plassere segmentet mellom kjever, men la den unstretched.
- For normalisering før eksperimentet, kan du angi myograph til null i unstretched posisjon. Deretter sakte beveger kjeven fra hverandre og observere aorta spenningen endre fram 3 mN. Etter 15 minutter, avløp løsningen fra myograph kammeret, og erstatte med fersk Krebs løsning, vente 15 min og justere spenningen til 3 mN igjen.
- Endre standard Krebs løsningen til 60 mM KCl inneholder Krebs løsning å indusere en sammentrekning i minst 15 min. skyll med fersk Krebs løsning 3 ganger.
- Legge til økende konsentrasjoner av phenylephrine (Phe; f.eksfra 10 nM til 100 μM). Vaske ut med standard Krebs løsning og Legg en enkelt konsentrasjon av Phe ~ 70% av maksimal sammentrekning fra forrige sammentrekning. Når sammentrekning er stabile, Legg økende konsentrasjoner av acetylcholine (ACh; f.eksfra 1 eller 3 nM til 10 eller 30 µM) å indusere vasodilatasjon. ACh legges ved ca 2 minutter.
Merk: I noen aorta segmenter med små Phe-indusert sammentrekning, for eksempel mindre enn 30% av KCl indusert kontraksjon, U46619 (en annen vasoconstrictor) i en konsentrasjon 1 nM til 30 nM kan brukes å indusere en stabil sammentrekning som er større enn 70% av KCl-indusert sammentrekning. - Rengjør myograph i henhold til produsentens håndbok.
- Ved hjelp av dataanalyse programvare (se Tabell for materiale), post makt (F) etter hver narkotika. Trekke markøren til basale spenning (Fbasale) for relativ måling, flytte pilen til det høyeste punktet etter Phe som FPhe, og flytt deretter til det laveste punktet etter hver ACh som FACh. Beregne ACh-indusert endotelet avhengige av vasodilatasjon (EDV) av % avslapning = (FACh-Fbasale) / (FPhe-Fbasale) på y-aksen. Forberede en konsentrasjon respons kurve på statistisk programvare med log10 verdien av konsentrasjon i M på x-aksen.
- Analysere statistiske forskjellen, bruk området under kurven på hvert segment fra ett museklikk, og analysere forskjellen av området under kurven blant grupper med veis VARIANSANALYSE. Enkelte punktene kan også analyseres om nødvendig.
7. bevis på iHep Repopulation i musen leveren
- På sluttpunktet, ofre mus ved å injisere intraperitoneally 100 mg/kg fenobarbital.
- Samle plasma av cardiac punktering. Dissekere lobes av leveren ved hjelp av ophthalmica saks, og lever inn en 10 cm peri-rett og vaske to ganger med saltvann. Fjern saline fra lever overflaten med tørkepapir og kutte lobes i rundt 0,6 cm lengde stykker. Fastsette lobes av leveren i 10% formalin.
- Bygge inn de faste lever i delen med en vev behandling system og en glidende mikrotom henholdsvis i henhold til produsentens instruksjoner og parafin.
- Varme lysbildene til 60 ° C i 1 time å smelte voksen. Deretter fordype lysbildene i xylen i 5 minutter to ganger og rehydrate vevet med 100%, 90% og 70% etanol suksessivt.
- Fordype lysbildene i lysbilde-kammeret som inneholder rundt 50 mL av antigen henting løsning, og deretter sette kammeret i trykkokeren, 120 ° C 1,5 min. vaskes lysbildene forsiktig med pipe vann i 5 minutter.
- Stain avsnittene med primære antistoffer (rundt 100 µL/inndelingen) menneskelige ALB (hALB) og menneskelige kjerner antigen (hNA). Deretter flekker med sekundær antistoffer konjugert med fluorescerende etiketter eller pepperrotperoksidase (som reagerer med DAB oppdagelsen kit).
- For å beregne prosentdelen av hALB + områder og hNA + celler, skanne lysbilder beiset med anti-hALB og anti-hNA og reagerte med DAB bruker en automatisert skyve skanning systemet for å få hele delen bilder.
Merk: Hele delen skannet bilder er nyttig å beregne nytt effektivitet på en saklig måte basert på hALB + områder eller hNA + celler i lever immunohistochemistry-farget. Som en alternativ å overvåke iHep repopulation effektivitet, kan plasma menneskelige albumin nivå testes ved hjelp av en menneskelig bestemt ALB ELISA kit. - Ta øyeblikksbilder å dekke hele lysbildet med tilhørende digitale lysbildet ser programvare under 5 X visning. For å kvantifisere andelen hALB + områder, for hvert bilde bilde, bruk mikroskopet tenkelig programvare for å kvalifisere positiv området (P) og det totale området (T) av bildet, og bruk bilde J for å kvalifisere det tomme området (B). Andelen hALB + områder uttrykkes som P/(T-B) * 100%. For hver gruppe skal minst 3 mus velges. Og for hver musen, minst 4 inndelinger fra forskjellige posisjoner i leveren bør velges.
- Kvantifisere andelen hNA + celler, for hvert bilde bilde, velger tilfeldig 1/16 av området med en bildebehandling og deretter telle manuelt antall totale kjerner (T) og hNA + kjerner (N). Andelen hNA + uttrykkes som N/T * 100%. For hver gruppe skal minst 3 mus velges. For hver musen, skal minst 4 inndelinger fra forskjellige posisjoner i leveren velges.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Rettet differensiering av menneskelig iPSCs i iHeps
Når nå 70% samløpet, skilles menneskelige iPSCs i iHeps med en 3-trinns protokollen16 (figur 1 øvre panel). Etter 3 dager for endoderm differensiering, blir iPSC kolonier løsnet og spres til hele samløpet (figur 1 nedre panel). Deretter med 2nd scenen medium, hepatoblasts vises og sprer. Disse cellene er overfylt, men viser klart kantene på dette stadiet (dag 7 figur 1 nedre panel). Etter 17 dager av differensiering vises polariserte iHeps med vanlig sekskant morfologi (figur 1 nedre panel). Disse iHeps express pHH markører, inkludert Zootherapy og ALB (figur 2A). Videre bør forholdet ASGPR + iHeps være relativt høy, målt ved flyt cytometri (figur 2B)15.
Generering av en FH i Vivo sykdom modell bruker FH iHeps
For å hjelpe LRG mus utvikle hyperkolesterolemi, feed vi dem med en HFHC diett 7 dager før engraftment (dag -7). Ved engraftment (dag 0) vise LRG mus rundt 3-fold plasma LDL-C nivå (rundt 600 mg/dL, figur 3B). Dag 15-17 iHeps er engrafted i LRG mus via intrasplenic injeksjon; disse iHeps snart bor i leveren parenchyma og sprer det (figur 3A). På slutten-punktet, er lever av disse chimeric mus samlet og fast, så flekker med hALB og hNA, begge skal vise klare bevis på iHep-mediert leveren repopulation i LRG musen leveren basert på flekker for hALB og hNA (figur 4A-E). I våre hender, kan både LDLR +/- og FH iHeps redusere plasma LDL-C nivå betydelig 21 dager etter engraftment (figur 4F). På dette punktet, kan FH menneskelige leveren chimeric mus brukes til å teste terapier FH.
Validering av FH menneskelige leveren Chimeric musemodell bruke tilgjengelig narkotika
For å validere vår modell, brukte vi 2 kjente LDL-C medisiner, simvastatin og PCSK9 antistoffer (figur 5A). Våre data viser at 21 dager etter behandling, PCSK9 antistoffer har en sterkere evne for LDL senking og EDV enn simvastatin i FH chimeric mus (figur 5B-D). Spesielt, er observerte prosent reduksjon av plasma LDL-C med PCSK9 antistoffer i FH chimeric mus lik som rapportert i kliniske studier4. Disse resultatene viser verktøyet potensielle LRG chimeric mus engrafted med FH iHeps for prekliniske testing av romanen narkotika i FH.
Figur 1: rettet differensiering av menneskelig iPSCs inn iHeps.Top panel, tidslinje for iPSC differensiering inn iHeps; nøkkel cytokiner og media vises for hver scene. (Nedre panel) Representant fase kontrast bilder av ulike tidspunkt av iHep differensiering. KSR: knockout serum utskifting; HCM: hepatocytter kultur medium; HGF: hepatocyte vekstfaktor; OSM: oncostatin M. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: karakterisering av iHeps produsert med endret differensiering protokollen. (A) Immunofluorescence av iHeps på ulike stadier av differensiering. Kjerner er farget i blått i de sammenslåtte komposisjonene. (B) Bar diagram viser prosentandelen av ASGPR + iHeps avledet innhentet på dag 17, målt ved flowcytometri. Prøvene ble målt i 3 uavhengige eksperimenter; mener verdiene vises og feilfelt viser standardavviket (SD). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Generasjon FH I Vivo sykdom modell med iHeps. (A) tid linje for generering av menneskelig leveren chimeric mus ved intrasplenic injeksjon av FH iHeps i LRG mus. (B) Bar diagram viser at fôring LRG mus med HFHC kosthold fører til betydelig økt LDL-C nivå (n = 10). P verdiene angis på figuren og ble oppnådd ved hjelp av en kort t-test; mener verdiene vises og feilfelt angir standard feil av gjsnitt (SEM). Panelet B er endret fra figur 3I vår forrige rapport15. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: iHep Mediated Repopulation i LRG mus leveren. (A) representant hele delen skannet bilde av hALB farging i en mus lever på nytt med LDLR +/-iHeps. Pilene angir klynger av menneskelig iHeps engrafted inn i musen leveren; zoomet delene vises i panelet til høyre. (B) Scatter tomten grafen viser prosentandelen av nytt hALB + tilsvarer iHep inneholder områder i en mus lever (fra ulike donor iPSCs), var basert på hele delen skannet bilder (n = 19). Mener verdiene vises og feilfelt viser SD. (C) representant bilder av immunohistochemical flekker for hNA i en mus lever med engrafted FH iHeps. (D) stolpediagram viser prosentandelen av nytt hNA + iHeps (fra ulike donor iPSCs) i LRG musen lever (n = 3). Mener verdiene vises og feilfelt indikerer SD. (E) hALB og hNA flekker på to påfølgende deler av en mus lever på nytt med wild type iHeps. (F) stolpediagram viser prosentandelen av plasma LDL-C reduksjon fra grunnlinjen på dag 21 etter engraftment; n = 5 for LDLR + / iHeps og n = 6 for FH iHeps og bilen. P verdiene angis på figuren og ble oppnådd ved hjelp av en kort t-test; mener vises feilfelt angi SEM. paneler B, D og E er endret fra Figur 3 g-3I av våre tidligere rapporter15. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : PCSK9 antistoffer Vis sterkere LDL senking evner enn Simvastatin i menneskelig leveren Chimeric LRG mus. (A) skjematisk visning av i vivo narkotika testing tilnærming med FH menneskelige leveren chimeric mus. (B og C) Prosentvis endring av plasma LDL-C fra grunnlinjen dager 14, 21 og 28 i FH chimeric mus matet med HFHC diett og behandlet med angitte narkotika; n angir antall mus. P -verdier ble hentet ved hjelp av en Kruskal-Wallis test; mener verdiene vises og feilfelt viser SEM. (D) EDV som svar på økende konsentrasjoner av ACh. P verdiene er angitt på figuren for angitte konsentrasjon. P -verdier ble hentet ved hjelp av toveis VARIANSANALYSE justert med Dunnetts flere sammenligning; feilfelt viser SEM. figur 5 endres fra figur 4A-4 C og figur 5A vår forrige rapport15. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tidligere studier ved hjelp av iHeps i Red har bekreftet at de er en effektiv måte å studere arvet leversykdommer17. Ytterligere utvide bruken av denne teknologien og fordi gjeldende FH dyremodeller suboptimal, vi engrafted FH iHeps i LRG mus og viste at det engrafted LDLR +/- eller heterozygote LDLR-mutert FH iHeps kan redusere mus plasma LDL-C nivå og svare på lipidsenkende legemidler i vivo.
Det er 3 avgjørende skritt i våre protokollen for generering av menneskelig FH leveren chimeric mus med iHeps:
1) produksjon av høykvalitets iHeps gjennom rettet differensiering. Gitt klonal variasjon mellom iPSC linjer18, er det viktig å bruke isogenic iPSCs for riktig sammenligninger og teste iHep differensiering effektiviteten av mor celle linjen før du utfører prosjektering og engraftment.
2) riktig iHep laster inn sprøyten. Forskjellig fra andre protokoller, vi bruker 50% ekstracellulær matrix (siste konsentrasjon, v/v) til resuspend iHeps, og deretter laste dem i insulin sprøyten. Vi tror at den ekstracellulære matrisen beskytter celler og gir en microenvironment som forenkler iHep overføringen i leveren fra milten. Bobler er en dødelig faktor for kirurgi og bør unngås helt i sprøyten.
3) riktig antall engrafted celler. Overbelastning av celler kan også føre til høy dødelighet frekvensen. Vi anbefaler engrafting 1-1,5 millioner iHeps per 25-30 g musen.
Våre protokollen har også noen begrensninger: skaden forårsaket av bestråling er moderat og enkelt dose, og modning delstaten våre iHeps er ikke sammenlignbare med pHH. Knyttet til begge hensyn, ligner graden av chimerism av vår modell på nyere rapporter beskriver NIKK/Lt-SCID/IL-2Rγ−/− mus eller Gunn rotter engrafted med iPSC-avledet iHeps17,19 , men betydelig lavere enn FRG mus eller uPA transgene mus engrafted med pHH. For å overvinne denne påminnelse, på den ene siden kan en videre optimere hepatic differensiering protokollen for å forbedre modning av iHeps. På den annen side, kan LRG mus være krysset med FRG mus til å generere Ldlr- / -/Fah- / -/Rag2- / -/Il2rg- / - mus.
Oppsummert har her vi beskrevet en detaljert protokoll for generering av menneskelig leveren chimeric dyr med FH iHeps og testing av funksjonaliteten til den engrafted iHeps. Viktigere, kan disse chimeric mus brukes i vivo narkotikatesting. Vår modell kan trolig være optimalisert ved å forbedre funksjonaliteten til iHeps eller slå ut flere gener (f.eks., Fah) i mottakeren LRG mus, og det vil være nyttig å undersøke patologisk mekanismer av sykdommen og utføre prekliniske studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
H.-F.T. er nasjonal koordinator og etterforsker ODYSSEY resultater studie sponset av Sanofi og Regeneron Farmasi.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Shenzhen vitenskap og teknologi Council grunnleggende forskningsprogram (JCYJ20150331142757383), strategiske prioritet Research Program av det kinesiske vitenskapsakademi (XDA16030502), Hong Kong Research Grant råd tema basert forskning Ordningen (T12-705/11), Samarbeidsprogrammet av tilskudd forskningsråd Hongkong spesiell administrativ Region og National Natural Science Foundation av Kina (N-HKU730/12 og 81261160506) Team forskningsprosjekt Guangdong naturvitenskapen Foundation (2014A030312001), Guangzhou vitenskap og teknologi Program (201607010086), og Guangdong provinsen vitenskap og teknologi Program (2016B030229007 og 2017B050506007).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 40 µm Cell strainer | BD | B4-VW-352340 | |
| 6-Well plate | Thermofisher | 140675 | Extracellular matrix coated |
| Accutase | Millipore | SCR005 | |
| Acetylcholine | Sigma Aldrich | A6625 | Dissolve in water |
| Antigen retrieval solution | IHC World | IW-1100-1L | |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | C8106 | CaCl2 |
| Cell dissociation enzyme | Thermofisher | 12604-013 | TrypLE |
| D-glucose | Sigma Aldrich | D8270 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | D5879 | DMSO |
| DMEM | Thermofisher | 10829 | Knockout DMEM |
| DNase I | Roche | 11284932001 | |
| EDTA | USB | 15694 | 0.5 M, PH=8.0 |
| Extracellular matrix (for cell suspension) | Corning | 354234 | Matrigel |
| Extracellular matrix (for iHep differentiation) | Corning | 354230 | Matrigel |
| Hepatocyte basal medium | Lonza | CC-3199 | |
| Hepatocyte culture medium | Lonza | CC-3198 | |
| High-fat and high-cholesterol diet | Research Diet | D12079B | |
| Human Activin A | Peprotech | 120-14E | |
| Human hepatocyte growth factor | Peprotech | 100-39 | |
| Human iPSC maintenance medium | STEMCELL Technologies | 5850 | mTeSR1 |
| Human oncostatin M | Peprotech | 300-10 | |
| Ketamine 10% | Alfasan | N/A | |
| L-glutamine | Thermofisher | 35050 | |
| LDL-C detection kit | WAKO | 993-00404 and 993-00504 | |
| Magnesium chloride | VWR | P25108 | MgCl2 |
| Meloxicam | Boehringer Ingelheim | NADA 141-213 | |
| Monopotassium phosphate | USB | S20227 | KH2PO4 |
| Non-essential amino acids | Thermofisher | 11140 | |
| PBS | GE | SH30256.02 | Calcium and magnesium-free |
| PCSK9 antibodies | Sanofi and Regeneron Pharmaceuticals | SAR236553/REGN727 | Alirocumab |
| Phenobarbital | Alfamedic company | 013003 | |
| Phenylephrine | RBI | P-133 | Dissolve in water |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P9333 | KCl |
| Povidone-iodine | Mundipharma | Betadine | |
| Recombinant mouse Wnt3a | R&D Systems | 1324-WN-500/CF | |
| ROCK inhibitor Y27632 | Sigma Aldrich | Y0503-5MG | |
| RPMI 1640 | Thermofisher | 21875 | |
| Serum replacement | Thermofisher | 10828 | |
| Silicone coated petri dish | Dow Corning | Sylgard 184 silicone elastomer kit | |
| Simvastatin | Merck Sharp & Dohme | ZOCOR | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6297 | NaHCO3 |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | NaCl |
| Trypan blue solution 0.4% | Thermofisher | 15250061 | |
| U-46619 | Cayman | 16450 | Dissolve in DMSO |
| Xylazine 2% | Alfasan | N/A | |
| β-mercaptoethanol | Thermofisher | 31350 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| AAT | DAKO | A0012 | 1:400 |
| ALB | Bethyl Laboratories | A80-129 | 1:200 |
| ASGPR | Santa Cruz | Sc-28977 | 1:100 |
| HNF4A | Santa Cruz | Sc-6557 | 1:35 |
| NANOG | Stemgent | 09-0020 | 1:200 |
| OCT4 | Stemgent | 09-0023 | 1:200 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| Il2rg-/- | Jacson lab | 003174 | |
| Ldlr-/- | Jacson lab | 002077 | |
| Rag2-/- | Jacson lab | 008449 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Automated cell counter | Invitrogen | Countess | |
| Gamma irradiator | MDS Nordion | Gammacell 3000 Elan II | |
| Insulin syringe | BD | 324911 | |
| Powerlab | ADInstruments | Model 8/30 | |
| Slides scanning system | Leica biosystems | Aperio scanScope system | |
| Sliding Microtome | Leica biosystems | RM2125RT | |
| Stereomicrocope | Nikon | SMZ800 | |
| Tissue processing system | Leica biosystems | ASP200S | |
| Wire myograph | DMT | 610M | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Softwares | |||
| Digital slide viewing software | Leica | Aperio ImageScope Version 12.3.2 | |
| Image J | NIH | Version 1.51e | |
| Image processing software | Adobe | Photoshop CC Version 2015 | |
| Microscope imaging software | Carl Zeiss | AxioVision LE Version 4.7 |
References
- Brown, M. S., Goldstein, J. L. A receptor-mediated pathway for cholesterol homeostasis. Science. 232 (4746), 34-47 (1986).
- Endo, A. The discovery and development of HMG-CoA reductase inhibitors. J Lipid Res. 33 (11), 1569-1582 (1992).
- Dubuc, G., et al. Statins upregulate PCSK9, the gene encoding the proprotein convertase neural apoptosis-regulated convertase-1 implicated in familial hypercholesterolemia. Arterioscler Thrombo Vasc Biol. 24 (8), 1454-1459 (2004).
- Robinson, J. G., et al. Efficacy and safety of alirocumab in reducing lipids and cardiovascular events. N Engl J Med. 372 (16), 1489-1499 (2015).
- Fitzgerald, K., et al. Effect of an RNA interference drug on the synthesis of proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) and the concentration of serum LDL cholesterol in healthy volunteers: a randomised, single-blind, placebo-controlled, phase 1 trial. Lancet. 383 (9911), 60-68 (2014).
- Ishibashi, S., et al. Hypercholesterolemia in low density lipoprotein receptor knockout mice and its reversal by adenovirus-mediated gene delivery. J Clin Invest. 92 (2), 883-893 (1993).
- Watanabe, Y. Serial inbreeding of rabbits with hereditary hyperlipidemia (WHHL-rabbit). Atherosclerosis. 36 (2), 261-268 (1980).
- Carpentier, A., et al. Engrafted human stem cell-derived hepatocytes establish an infectious HCV murine model. J Clin Invest. 124 (11), 4953-4964 (2014).
- Tateno, C., et al. Near completely humanized liver in mice shows human-type metabolic responses to drugs. Am J Pathol. 165 (3), 901-912 (2004).
- Basma, H., et al. Differentiation and transplantation of human embryonic stem cell-derived hepatocytes. Gastroenterology. 136 (3), 990-999 (2009).
- Soldner, F., et al. Generation of isogenic pluripotent stem cells differing exclusively at two early onset Parkinson point mutations. Cell. 146 (2), 318-331 (2011).
- Bissig, K. D., et al. Human liver chimeric mice provide a model for hepatitis B and C virus infection and treatment. J Clin Invest. 120 (3), 924-930 (2010).
- Azuma, H., et al. Robust expansion of human hepatocytes in Fah(-/-)/Rag2(-/-)/Il2rg(-/-) mice. Nat Biotechnol. 25 (8), 903-910 (2007).
- Bissig-Choisat, B., et al. Development and rescue of human familial hypercholesterolaemia in a xenograft mouse model. Nat Commun. 6, 7339 (2015).
- Yang, J., et al. Generation of human liver chimeric mice with hepatocytes from familial hypercholesterolemia induced pluripotent stem cells. Stem Cell Rep. 8 (3), 605-618 (2017).
- Kajiwara, M., et al. Donor-dependent variations in hepatic differentiation from human-induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (31), 12538-12543 (2012).
- Chen, Y., et al. Amelioration of hyperbilirubinemia in gunn rats after transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes. Stem Cell Rep. 5 (1), 22-30 (2015).
- Ortmann, D., Vallier, L. Variability of human pluripotent stem cell lines. Curr Opin Genet Dev. 46, 179-185 (2017).
- Liu, H., Kim, Y., Sharkis, S., Marchionni, L., Jang, Y. Y. In vivo liver regeneration potential of human induced pluripotent stem cells from diverse origins. Sci Transl Med. 3 (82), 82ra39 (2011).
