Summary
Yeni beyin bölgelerindeki genç nöronlar zorlu nasıl çevre nöronal kader ve olgunlaşma sculpts içine önemli anlayışlar ortaya çıkarabilir. Bu iletişim kuralı interneuron öncüleri belirli beyin bölgelerinden hasat ve onları her iki homotopically nakli için bir yordam açıklanır veya beyin ve postnatal yavrularını içine heterotopically.
Abstract
Nöronal kader tayini ve olgunlaşma genetik programlarla çevre sinyalleri arasında karmaşık bir etkileşim gerektirir. Ancak, bu Farklılaşma süreci düzenleyen dışsal mekanizmaları vs içsel rolleri disentangling tüm gelişimsel neurobiologists için bir bilmece olduğunu. Bu sorun GABAergic interneurons, geçici embriyonik yapılardan tarihi ve telencephalon dağıtmak için uzun süren bir göçmen faz tabi bir inanılmaz türdeş olmayan hücre nüfus için büyütülür. Ne kadar farklı beyin ortamları etkiler interneuron kader ve olgunlaşma keşfetmek için geliştirdiğimiz fluorescently etiketli olgunlaşmamış interneuron öncüleri (P0-P2) yeni doğan farelerde belirli beyin bölgelerinden hasat için bir iletişim kuralı. Bu yaşta interneuron geçiş neredeyse tamamlanmış ve bu hücreler nispeten küçük sinaptik entegrasyonu ile son istirahat ortamlarında bulunan. Toplama tek hücre çözümler akış sitometresi ile bu interneuron öncüleri P0-P2 wildtype Doğum sonrası pups nakledilen. Her iki Homotopik yaparak (örneğin, korteks korteks) veya heterotopik (örneğin, korteks hipokampus) nakillerine, bir can değerlendirmek yeni beyin ortamlarda olgunlaşmamış interneurons zor onların kaderi, olgunlaşma ve devre entegrasyon nasıl etkiler. Beyin yetişkin fareler hasat ve posthoc analiz aşılı hücrelerde immunohistokimyasal, dahil olmak üzere, çok çeşitli ile denetlesinler elektrofizyolojik ve transkripsiyon profil oluşturma. Müfettişler nasıl ayrı beyin ortam tahlil için bir strateji ile çok sayıda nöron gelişim yönlerini etkilemeye ve belirli nöronal özellikleri öncelikle kablolu genetik programlar tarafından tahrik edilmektedir tanımlamak bu genel yaklaşım sağlar veya çevre ipuçları.
Introduction
Düzgün kortikal uyarıcı projeksiyon nöronlar ve inhibitör GABAergic interneurons, farklı türleri morfoloji, elektrofizyolojik özellikleri, connectivity ile son derece heterojen bir nüfus arasında bir denge gerektirir ve nörokimyasal işaretleri. Anormal gelişimi ve interneurons (ve belirli interneuron alt gruplar) fonksiyonu bağlı psikiyatrik bozukluklar şizofreni, otizm ve epilepsi1,2,3gibi pathobiology. Ayrıca, birçok genler bu beyin bozukluklarında karıştığı güçlü genç interneurons4' te zenginleştirilmiş. Böylece, interneuron kader tayini ve olgunlaşma düzenleyen mekanizmalar daha büyük bir anlayış normal gelişim ve potansiyel etiologies çok sayıda beyin hastalıkları anlamak için gereklidir.
Ön interneurons öncelikle iki geçici embriyonik yapılardan, medial ve kaudal ganglionic efendiler tarihi (MGE ve CGE, sırasıyla). Bu postmitotic hücreler (interneuron öncüleri) nerede onlar çok çeşitli devreleri entegre telencephalon dağıtmak için uzun süren teğet geçiş aşaması geçmesi. MGE kaynaklı interneurons oluşur üç büyük ölçüde örtüşen, neurochemically tanımlı alt gruplar: hızlı parvalbumin (PV+) interneurons, hızlı-somatostatin (SST+) interneurons, spiking yükseliyor ve geç yükseldi nöronal nitrik hipokampal neurogliaform ve Ivy hücreleri teşkil oksit sentaz (nNOS+) interneurons. Çok sayıda labs düzenleyen ilk kader kararlar PV+ veya SST + interneurons, morfojenlerdeki, interneuron öncüleri, Doğum tarihi ve nörojenik bölümü modu kayma degradeleri de dahil olmak üzere çeşitli mekanizmalar içinde MGE belirledik 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. interneurons başlangıçta 'Kardinal sınıfa' ayırt etmek ve onların çevre11ile etkileşimde bulunan 'kesin sınıfa' aşamalı olarak olgun önerilmiştir. Son kanıtlar bu hücreler ganglionic efendiler, postmitotic olmak gibi bazı olgun interneuron alt türlerinden genetik olarak kablolu erken tanımlanmış içsel genetik programlar daha önce daha büyük bir rol oynayabilir gösteren olabileceğini gösterir takdir12,13. Ancak, içsel genetik programlar için sürücü farklılaşma ayrı interneuron alt türlerini içine çevre ipuçları ile etkileşimini anahtar soru büyük ölçüde keşfedilmemiş kalır.
Çok sayıda çalışma embriyonik MGE hücreleri doğrudan beyin bölgeleri, hücreler olgun aşılı ve genellikle yerel endojen devresi14,15inhibe GABA bırakın uzlaşma sonuçları ile çeşitli içine nakledilen, 16,17,18,19. İnsan indüklenmiş pluripotent kök hücre (hIPSC) kullanarak önemli ilgi oluşturulan bu gözlemler umut verici-beyin hastalıkları çeşitli tedavi interneurons türetilmiş. Ancak, bu aşılı hücreler olgun interneurons beklenen türlerini olgun olmadığını çok az bu çalışmaların değerlendirmek, ne zaman bir kritik bir bileşeni translasyonel yaklaşımlar hakkında düşünüyor.
Nasıl interneuron farklılaşma ve olgunlaşma çevre etkileri gidermek amacıyla bir strateji aşılı interneurons şekil-in belgili tanımlık ev sahibi kabul olup olmadığını incelemek için yeni beyin ortamlara olgunlaşmamış interneuron öncüleri nakli için geliştirildi çevre veya özelliklerini donör çevre20korumak. MGE nakli MGE nüfus interneuron ve çok sayıda beyin bölgeleri21dağıtmak GABAergic projeksiyon hücreler içerdiğinden bu soruyu çözmek uygun değildir. Nerede bu MGE hücreler göç var bilmeden, bir tam olarak nasıl bu nakillerine beyin ortamı tarafından etkilenen değerlendirmek değil. İnterneuron öncüleri erken postnatal timepoints, hasat tarafından bu sorunu kendi geçiş tamamlayan ve hedeflerine ulaştı olgunlaşmamış hücreleri elde ederek hile beyin bölgesi ama çevre en az etkileşim yok. Differentially farklı beyin bölgeleri arasında ifade edilir interneurons özellikleri üzerinde odaklanarak, kimse o zaman nasıl interneuron özellikleri ana ortamı değiştirir belirleyebilirsiniz. Bu protokol için özetlenen genel yaklaşım herhangi bir araştırmacı için uygulanabilir olmalıdır meydan yeni bir ortamda ne kadar genç nöronlar incelemek istiyor ne zaman davranırlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm deneysel yordamlar Ulusal Sağlık Enstitüleri kılavuzlarınıza uygun olarak yapılmıştır ve NICHD hayvan bakım ve kullanım Komitesi (ACUC) tarafından kabul edildi. Nkx2.1-Cre aşağıda açıklanan protokol kullanırC / +; AI9+ / MGE kaynaklı interneuron öncüleri hasat sersemler, ancak herhangi bir istenen floresan muhabir fare satırında gerçekleştirilebilir. Hem erkek hem de dişi erken postnatal fareler (P0-P2) gelişigüzel donör ve ana bilgisayar doku için kullanılmıştır.
1. çözüm hazırlık
- Sükroz yapay beyin omurilik sıvısı (sACSF) aşağıdaki tarifi (mM biriminde) göre hazırlamak: 87 NaCl, 26 NaHCO3, 2.5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 0.5 CaCl2, 7 MgCl2, 10 glikoz, 75 sükroz O % 95 ile doymuş 2, % 5 CO2 pH 7.4 =.
- Bir ölçek ile 350 mL saf GKD2O dayalı son istenen birimde dolgu (sACSF 500 mL 1-2 çöp için yeterli olmalıdır), manyetik heyecan çubuğu eklemek ve kabı heyecan tabağa yerleştirin.
- Tüm tuz (NaCl, NaHCO3, KCl, NaH2PO4, glikoz, sukroz), bir anda ağırlık ve aşağıdaki tabloya göre su ekleyin. Tutarları bağlı olarak son istenen ses seviyesi ayarlanabilir.
Reaktif Molekül ağırlığı Konsantrasyonu (mM) Gram/500 mL Sodyum klorür 58.44 87 2.54 Sodyum bikarbonat 84.01 26 1,09 Potasyum klorür 74.55 2.5 0,09 Yem mono sodyum fosfat 119.98 1,25 0,08 Glikoz 180.16 10 0,9 Sükroz 342.3 75 12,84 - % 95'i O2, % 5 CO2 (carboxygen) için en az 20-30 dakika CaCl2 (500 mL sACSF için 1 M çözüm 0.25 mL) uygun miktarda eklemeden önce ve MgCl2 (500 mL sACSF için 1 M çözüm 3,5 mL) ile çözüm kabarcık .
- Standart pH metre kullanarak pH kontrol edin. Düzgün hazırlanmış, çözüm pH olmalıdır 7,4 =.
- Son 500 mL saf GKD ile2O mezun silindir hacmi çözüm getirmek.
- sACSF-ebilmek var olmak ilâ 1-2 gün kala hazır. Kullanmadan, buza koyun ve carboxygen kandan başlamadan en az 15 dakika için kabarcık ve sACSF diseksiyon köpüren şişe tutmak.
2. diseksiyon hazırlık
- Aşağıdaki araçları sterilize/autoclaved olmalıdır: en az bir küçük ince keskin makas, 2 iyi forseps (stil #5), kavisli iyi forseps, şüpheliler kalıp ve birkaç jilet kesit beyin. Beyin kafatasından kaldırmak için küçük bir spatula seçime bağlıdır.
- Büyük plastik transfer Pipetler, tüm buz tuttu delik ve çalışma istasyonu yakınında diseksiyon mikroskoplar petri yemekler (9 cm ve 4 cm çapları) ile 50 mL konik Plastik tüpler izole beyin bölgeleri toplamak için ayarlayın. Birkaç 50 mL tüpler carboxygenated sACSF buz dolu hazırlayın. Birden fazla beyin bölgesi anatomi, düzgün için emin olun ve açıkça etiket koleksiyonu tüpler ve transfer pipetler kirlenmesini önlemek için.
- Ve yavrularını hipotermi ile buz anestezi için ek bir buz kovası ve uygun tehlikeli atık torbasına mürekkep imha etme hakkına sahiptir.
- Pasteur pipetler Yangın Cilalı Cam doku toz için hazırlayın. Bunsen burner sterilize ve pipet ucu şekli için kullanın. Birkaç Pipetler ile farklı geçişli açıklıklar hazırlamak: büyük (~ 600 µm), Orta (~ 300 µm) ve küçük (~ 100 µm). Farklı toz hızları sağlamak için su kullanarak ipuçları ile akışı test. Her türlü en az bir pipet her izole beyin bölgesi için gereklidir, ancak birkaç ilave her boyutu için sahip tıkanma veya ipuçları kırılması durumunda önerilir.
3. transplantasyon hazırlığı
- İnce uçlu cam Mikropipetler hazırlamak için bir elektrot çektirmenin kullanın. Kırmak veya eğim açılı bir sivri, yapmak için belgili tanımlık uç çapı ~ 20-40 olan ucu µm. kontrol edin ipuçları toz yok emin olmak için bir mikroskopla veya arta kalan cam parçacıkları diyafram engellenmesi.
- İnce iğne kullanarak, tamamen cam micropipette mineral yağ ile doldurun. Micropipette Nanoject aparatı (veya diğer mikroenjeksiyon aygıt) yerleştirin. Nanoject III için aşağıdaki programı ayarla: birim 60 = nL, oranı = 30, devir = 25, gecikme = 1 s.
- Nanoject manyetik bir baz manipülatör için güvenli ve Nanoject düz aşağı bakacak şekilde manipülatör x veya y eğik değil ayarlayın eksen.
- Bazı yapışkan macun eklemek (~ 1-2 cm P0-P2 yavrular için) Doğum pups kafa dinlenecek yükseltilmiş bir yüzey oluşturmadan bir petri kapaðýn üst kýsmýný için.
- Kesim ~ 6-8 cm uzun şeritler laboratuarının teyp ve ortada bir elmas şeklindeki delik açın. Kaseti yavru fok Başkanı işlem sırasında ayrıca cilt germe ve kolay görsel simge ve hedeflenen bölge olarak izin iken stabilize etmek için kullanılır.
- Enjeksiyon İstasyonu'nun yanında bir ısıtma yastığı hazırlamak ve enjeksiyonları başlamadan önce 'düşük' ayarı açın. Belgili tanımlık yastık kapak biraz kağıt havlu ya da bir bebek bezi yastık ile.
- Küçük makas gerçekleştirmek için hazır birden çok ekimi koşul, performans varsa ayak/kuyruk kırpma etiketlemek için alıcı farklı enjeksiyonları sersemler.
4. P0-P2 fare beyin kaldırılması
- Şu yordamına başlamadan önce birkaç petri yemekler soğutulmuş, carboxygenated sACSF ile doldurun. Ayrıca koleksiyonu tüpler ~ 25 mL sACSF ile doldurun.
- Bazı parafilm veya bir eldiven ve iyi kapalı yerde P0-P2 yavru buzun altında sarın. 5 dakika için bir zamanlayıcı ayarlamak ve başlatın. Bu saatten sonra yavru fok kaldırmak ve bu hindpaw pinching için yanıt vermez kontrol edin.
- Yavru fok başını kesmek ve sACSF ile dolu bir petri kafasından toplamak. Kafatası ortaya çıkarmak için orta çizgi boyunca deriyi kesme.
- Kafatası içinde açılışında arka beyin/omurilik bulun ve forseps kafatası dorsal kısmı boyunca bir ucunu bağlayın. Yavaşça orta hat kafatasına kavramak ve 'yanal beyin beyin zarar vermemesi için dikkatli olmak, ortaya çıkarmak için dış görev adet kabuğu'.
- Kafatası dorsal ve yanal bölümlerini kaldırma üzerine hafifçe herhangi bir yerde zarar vermemeye çalışırken beyin, Menfez yüzey altında scooping tarafından beyin kafatasından kaldırmak için forseps veya spatula kullanın. Beyin carboxygenated sACSF ile dolu başka bir petri kabına yerleştirin.
Not: Biz hipokampus, striatum ve korteks dissekan için iki farklı strateji mevcut. İlk strateji (adım 5.1-5.10) herhangi bir fare hat için yararlı ise ikinci strateji (adımları 6.1-6,7) bir floresan muhabir fare striatum globus pallidus ve diğer beyin yapıları temiz bir şekilde ayırt etmek gerekir. Striatum istenmiyorsa, iki teknik striatum özgü bölümleri göz ardı
Resim 1 : Şematik ve beyin diseksiyon, tekniği #1 görüntülerde
Açıklanan adımları 5.1-5.10 diseksiyonu tekniği. Striatal doku isterseniz, P1 beyin beyin matrisler ventral tarafta yukarı yerleştirin. Jilet koronal bölümleri striatum yoluyla elde etmek için ön beyin aracılığıyla şüpheliler yuvasına yerleştirin. Striatal adet her iki hemisferlerin kaldırmak için hipokampus anterior striatum içeren tüm bölümler için yineleyin. Striatal doku istenmiyorsa, sadece hemisect beyin hemisferlerin medial yan çanak yerleştirin ve hipokampus ortaya çıkarmak için ventral-medial beyin yapıları (talamus, bazal gangliyon, vb) kaldırın. Hipokampus çimdik sonra Yarımküre ters çevirin ve kortikal doku bir parça incelemek için cımbız kullanın için cımbız kullanın. Dikey siyah hatlar nerede kesikler striatal bölümleri kaldırmak için olurdu şematik hemisferlerin arasında. Ölçek çubuğu 500μm =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
5. hasat Striatum, hipokampus ve korteks, tekniği #1
- Tüm beyin kadar şüpheliler kalıp, ventral yan kesit üzerine yerleştirin. 1 jilet aracılığıyla beynin en ön kısmından (anterior koku yolu) yerleştirin.
- Başka bir jilet sadece ilki için 0,5 mm dilim oluşturmak için posterior yerleştirin ve ek bir jilet posterior bu bir yer.
- Bu dilimler carboxygenated sACSF ile petri kabına aktarın ve sACSF ile ayrı bir yemek için beynin geri kalanını yerleştirin. Striatal dilimleri striatum görselleştirmek için diseksiyon kapsama aktarın. Bu dilimler ön striatum büyük bölümlerini içeren ve hipokampus eksikliği. Nkx2.1-Cre+/-kapsamla anatomi bir floresan kullanın; AI9+ /- zayıf striatal tdTomato ayırt etmek için dilimleri sinyal globus pallidus güçlü tdTomato sinyalini.
- Veya floresan olmadan, her iki hemisferlerin tüm bölümler ve transfer striatal topakları üzerinden striatum düzgün etiketli 50 mL tüp ile sACSF için dışarı çimdik, buz üzerinde depolamak.
- Hemisect beyin forseps veya bir tıraş bıçağı kullanarak orta çizgi boyunca ve medial yüzeye karşı karşıya olduğu Yarımküre düzenleyin.
- Ventral beyin dokusu (talamus, bazal gangliyon, vb) bu doku forseps ile pinching tarafından kaldırın. Ne zaman tam, hipokampus (dorsal korteks hastanın ekseninde kapsayan bir sosis şeklinde yapı) ve ventrikül korteks açıkça görünür olur.
- Hipokampüs kaldırmak için ön hipokampus önünde forseps ipuçları eklemek ve yavaşça hipokampüs forseps özafagusu taşıyarak ve kortikal hipokampal sınırı boyunca pinching korteks ayrı. Düzgün etiketli 50 mL tüp sACSF ile izole hipokampus aktarmak, buz üzerinde depolamak.
- Korteks incelemek için aşağı hemisected korteks medial yanına koyun. O zaman forseps en dorsal çimdik kullanmak ve temiz herhangi bir aşırı sigara-kortikal doku (talamus medial tarafı yani korteks medial somatosensor korteks, ~ 2 mm x 2 mm. bir kare parça bırakmak korteks ventral, anterior ve posteiror bölümlerini Flip Bazal gangliyon, vs.) medial görünüşte gerekirse. Korteks yığın düzgün etiketli 50 mL tüp sACSF ile transfer, buz üzerinde depolamak.
- Hippocampi korteks toplamak için diğer Yarımküre ile yordamı yineleyin bölgeler.
- Tüm pups, petri yemeklerinde sACSF soğuk ve taze kalmasını sağlamak için pups arasında sACSF değiştirmek emin olmak için bu yordamı yineleyin.
Resim 2 : Şematik ve görüntüler beyin diseksiyon, tekniği #2 için
Açıklanan adımları 6.1-6,7 diseksiyonu tekniği. PIN beyin üzerine bir diseksiyon çanak dorsal tarafı yukarı. Korteks soyma sonra ileri, hipokampus ve striatum görülebilir ve o zaman bir bölüm korteksin-ebilmek var olmak çıkarmak önceki teknikte açıklandığı gibi kaldırılabilir. Transgenik fare hat bağlı olarak, striatum globus pallidus ve diğer doku kaldırmak için temizlenebilir. Nkx2.1Cre; AI9 fare çizgi, globus pallidus önemli ölçüde yüksek yoğunluklu striatum için karşılaştırıldığında domates + hücre vardır. Ölçek çubuğu 500 mikron =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
6. hasat Striatum, hipokampus ve korteks, tekniği #2
- Beyin ventral yan bir sylgard kaplı sACSF içeren kabında yerleştirin ve pin beyincik ve ön korteks veya Olfaktör ampuller ile.
- Bir yarımküre ile başlayarak, Kıvrımlı pensler hafifçe arka korteks üzerinden temel hipokampus ve diğer doku ayırmak için kullanın. Yavaşça soyulmuş korteks düz petri kabına üzerinde yatıyordu. Diğer Yarımküre için yineleyin. Hippocampi ve striatum maruz kalan beyinde açıkça görünür olmalıdır.
- Forseps bir hipokampus orta hat çimdik ve hipokampus yanal kaldırmak için soyma için kullanın. Koleksiyon şişe buz koyun ve diğer hipokampus ile yineleyin.
- İçin striatum, yavaşça çevre dokudan gevşetmek için striatum kenarlarında kazı. Sonra o uzakta--dan altında pinching tarafından striatum kaldırmak ve toplama tüp buz ekleyin. Diğer striatum için yineleyin.
- Kortikal bölümleri 5,8 adımda anlatıldığı gibi hasat edilebilir.
- Bir transgenik muhabir fare çizgi kullanıyorsanız (örneğin, Nkx2.1-Cre; AI9, Lhx6-GFP, vb), striatum sACSF ile petri kabına aktarmak ve görüntülemek kapsam dissekan floresan altında. Forseps striatum (içinde Nkx2.1-Cre; herhangi bir sigara striatal doku kaldırmak için kullanın. AI9 fareler, kaldırmak tüm 'parlak' doku, globus pallidus striatum için karşılaştırıldığında çok daha yüksek MGE kaynaklı tdTomato + hücre yoğunluğu olduğu gibi). Tüm striatum için yineleyin.
- Tüm pups, petri yemeklerinde sACSF soğuk ve taze kalmasını sağlamak için pups arasında sACSF değiştirmek emin olmak için bu yordamı yineleyin.
7. üreten tek hücre Dissociations
- Diseksiyon tamamlandıktan sonra 1 mg/mL Pronase çözüm 10 mg Pronase tartma ve 10 mL carboxygenated sACSF içinde eriterek hazırlayın.
- Transfer 50 mL Koleksiyonu şişeleri dokudan 5 ml 2 mL Pronase-sACSF çözeltisi içeren alt tüpler yuvarlak. Doku sallayarak flicking/3 - 4 kez parmağınızla tüp örnekleri karıştırmak için kuluçka sırasında oda sıcaklığında 20 dk için kuluçkaya.
- Bu kuluçka sırasında sulandırma çözüm hazırlamak: %1 FBS (100 μL) + DNaz (1:10,000 1 μL stok DNaz) 10 mL carboxygenated sACSF içinde.
- 20 dakika sonra dikkatle alt doku rahatsız etmek pronase çözümü kaldırmak ve bunun yerine 1-2 mL sulandırma çözeltisi (Toplam birim doku miktarını başlangıç üzerinde bağlıdır).
- Mekanik olarak doku doku önceden hazırlanmış Yangın Cilalı Pasteur Pipetler ile triturating ayırmak. Büyük (~ 600 µm) pipet ile başlayarak, Aspire edin ve doku çözüm doku kadar kırmak için en az on kez sınırdışı. Kabarcıklar çözüm içine tanıtmak değil. Ve küçük delik pipet pipet orta delik için bu işlemi yineleyin. Çözüm bulutlu olması gerektiği ve doku yok açık parça toplama tüplerde görünür olmalıdır.
- Damlalıklı herhangi bir hücreyi kaldırmak için 5 mL konik tüpler içine 50 µm filtresi ile hücre lysate çözümü kümeler. Bu tek hücre çözümler akış sitometresi ile devam etmek (ya da doğrudan potansiyel olarak sıralama yaparsanız sayım hücre için gereklidir).
8. cep FACS saf çözümleri ekimi için hazırlanması
- Hücre çözümleri Akış Sitometresi aldığında, çözüm 1.5 mL konik tüpler bir (veya daha fazla) aktarmak ve hücreleri 4oC., 5 min için 500 g de spin Santrifüjü sonra bu yüzden medyayı çıkarın o ~ 20-40 µL tüp içinde kalır. Bu hücrelerde medya kalan yeniden oluşturma (ve birden çok tüpler gerekirse çözüm birleştirir).
- Parafilm küçük bir parçası üzerinde 2 µL hücre çözümü + 8 µL sACSF + trypan mavi leke 10 µL karıştırın. Damlalıklı 10 µL slayt kapaklı bir hemasitometre içine.
- Her bir standart Laboratuvar el taksitli sayaç kullanarak hemasitometre bulunan 4 x 4 kare ızgaralar canlı hücreleri saymak (ölü hücreleri boya mavi olacak), ve ortalama 4 Bu sayar. Bu sayı 100 µL başına hücre sayısını belirlemek için ile çarpın.
- Gerekirse, hücreleri 10.000-30.000 hücre/µL sulandırma çözümde bir konsantrasyon, böylece ses düzeyini ayarlayın. Son konsantrasyonu hücre Toplam tutar ve nakillerine istediğiniz sayıyı bağlıdır. Hücre nakli için buz üstünde tutmak
9. P0-2 WT Pups içine nakli
- Bazı parafilm veya bir eldiven ve iyi kapalı yerde bir WT yavru buzun altında sarın. 5 min için bir zamanlayıcı ayarlamak ve başlatın. Bu saatten sonra yavru fok kaldırmak ve bu hindpaw pinching için yanıt vermez kontrol edin.
- Yavru fok buz üzerinde olmakla birlikte, bu birkaç kez hücre süspansiyon iyi karışık yükleme önce emin olmak için pipetting tarafından hücre çözüm mix (micropipette her enjeksiyon için yükleme önce hücreleri mix). Sonra mineral yağ micropipette boş ve tamamen hücre süspansiyon ile doldurun.
- İmzalat yavru kafasını başın üst nispeten düz olması yapışkan Macun üzerine yalan petri kabına yerleştirin. Elmas delik kasetle deri gerilir ve fare iyi rahat ve nefes ama bu firma başıdır sağlamak için gergin çekerek yavru, Başkanı arasında yerleştirin. Lambda elmas delikten görünür olmalıdır.
Şekil 3 : Şematik ve görüntü nakli için
(A) resimleri enjeksiyon Kur. O lambda pups kafatasını açıkça görülebilir ve micropipette sıfırlanması için kullanılması gerektiğini unutmayın. Ölçek çubuğu 1 inç =. (B)'yı hedeflemesini hippocampus enjeksiyon yordam gösteren şematik. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
- Güvenli yavru Nanoject altında hareket ve micropipette ucu üzerinde doğrudan lambda olması micropipette daha düşük. XY koordinatları manipülatör Tarih kaydedin.
- Micropipette medyolateral hem de hastanın ekseninde baş istenen koordinatları taşımak için manipülatör düğmeleri ayarlamak: S1 korteks → 1.0 mm ön ve 1.0 mm lateral, hipokampus → 0,75-1.0 mm ön ve 1.0-1.2 mm lateral, Striatum → 2.0-2.2 mm ön ve 1.5 mm lateral. Koordinatları biraz yaş yavru (örneğin, P0 P2) ya da fareler (örneğin, CD1 fareler daha geniştir ve C57/B6, P2) suşu telafi etmek için ayarlanabilir.
- Cilt üzerinde küçük bir çukurluk formları dek micropipette indirin. Sonra yavaşça micropipette deri ve kafatası beyin girmek için sürücü ama sıkıca z ekseni manipülatör topuzu açın. Micropipette beyin girdiğinde, kafatası basıncı çıkacak ve çukurluk kaybolacaktır.
- İpucu bir koni şeklinde bir çadır gibi derinin tarafından çevrelenene kadar micropipette biraz geri çek. Koordinatları z eksen boyunca okumak: Bu z ekseni sıfır noktası olacak.
- Micropipette istenen derinliğe indir: korteks → 0,75-1.0 mm, hipokampus → 1.2-1.5 mm, Striatum → 2.0-2.5 mm. derinlik can düzeltilmiş biraz yaş ya da zorlanma yavru için telafi etmek için.
- Yukarıda açıklanan Nanoject III programı kullanarak hücre süspansiyon enjekte. Enjeksiyon sonra programı tamamlandığında, yavaş yavaş enjeksiyon yeri dışarı sızıntı çözüm en aza indirmek için micropipette geri çeker önce 15-20 s bekle.
- İkili performans durumunda enjeksiyonları, lambda yukarıda micropipette yeniden sıfır ve diğer yarımkürede doğru koordinatları taşıyın. Alternatif olarak, bir micropipette 1 mm ilk enjeksiyon ön hareket ettirerek aynı yarımkürede korteks içine iki enjeksiyonları yapabilirsiniz.
- Transplantasyon tamamlandıktan sonra teybi kaldır ve yavru ısıtma yastığını üzerine aktarın. Gerekirse, yavru köpek kuyruk ya da ayak kırpma tarafından etiketleyin. Bir kez yavru bir kırmızı renk kitlendi ve hareket ediyor, annesi ile kafeste geri yerleştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu iletişim kuralı erken postnatal beyin (Şekil 1-2) belirli beyin bölgelerine hasat, tek hücre dissociations interneuron öncüleri, toplamak ve saf WT çeşitli beyin bölgeleri içine bu hücrelerin nakli gösterilmiştir postnatal pups (Şekil 3). Posthoc analiz için interneuron habercisi Greftler alınan beyin P30-35 arasında hücre morfolojisi, nörokimyasal işaretleri ve elektrofizyolojik özellikleri tanımlamak için hasat edildi. Bu tür deneyleri kez P21-P30 normal farelerde arasında yapılmaktadır, ancak bu yana transplante hücre olgunlaşma biraz nedeniyle diseksiyon/ayrılma yordamı gecikebilir, ek bir 5-10 gün bekliyor bunun için telafi etmek için önerilir Gecikmeli olgunlaşma. Yapılması için analiz türü beyin hasat için uygun strateji belirleyecektir. Özellikle, biz ya da belirli alt türlerinden20karşı önyargı belirli interneuron alt gruplar Tercihli hücre ölümü gözlemleme.
İmmunohistokimyasal analiz, fareler %4 paraformaldehyde ile derin ve beyin çıkarıldı. 50 mikron vibratome dilimleri hedeflenen beyin bölgesi ile hazırlanan ve antifriz çözümünde depolanan ve/veya yukarıda açıklanan20olarak immunostaining için işlenmiş. Biraz beyin uygun olmayan (örneğin, çok derine ventrikül içine enjeksiyon) hedefleme, kayıp hücreleri veya aşılama yordamı veya nakledilen hücreler ana makinesi tarafından reddedilmesi sırasında apoptosis geçiren nedeniyle olabilir herhangi bir domates + hücreleri, içermiyordu. Son hücre sayısı üzerinde bağlı olarak, bu tahmin edilmektedir aşılı hücre tek 2-%520diğer nakli yordamlar22,23ile uyumlu olan, hayatta.
Beklendiği gibi domates + hücre başarılı nakli,--dan düzine-birkaç bin domates + hücrelere (Şekil 4A) arasında değişen toplam sayısı önemli değişkenlik yapıldı. Aşılı hücreleri çoğu ile doğru bölgelerde lokalize interneuron türleri Morfoloji ve iyi karakterize interneuron nörokimyasal işaretleri (Şekil 4B) görüntüleme. Benzer hücre hayatta kalma sayıları ve olgunlaşma profilleri bile ne zaman hücre içine heterotopik nakillerine (Şekil 4 c) yeni ortamlarda aşılı tespit edildi.
İmmunohistokimyasal analiz yanı sıra, elektrofizyolojik analiz aşılı hücreleri üzerinde beyin devre entegre etmiş ve beklenen içsel ve ateş özelliklerini görüntüler onaylamak için gerçekleştirildi. Beyin P30-35 fareler hasat edildi ve dilimleri fizyolojik kayıtları daha önce açıklanan20hazır. Yetişkin gibi fizyolojik özellikleri aşılı interneurons sunulan ve farklı ateş desenleri-ebil var olmak vardı iyi karakterize interneuron temsilcisi bu karakterize düşündüren alt türlerinden (Şekil 5A), aşılı interneurons Ana bilgisayar ortamında düzgün olgun başardık. Transplante hücreleri nöronal ağ entegre edildi doğrulamak için sEPSCs da kayıtlı (Şekil 5B) idi. Buna ek olarak, bir alt nakli gerçekleştirilen yakınındaki yerelleştirilmiş transplante interneurons piramit hücrelerden kaydederek takip ChR2 ifade interneurons ile. Bu veriler postsinaptik GABAergic akımlar mavi ışık (Şekil 5C-D) tarafından uyarılmış gösterdi.
Şekil 4 : Aşılı interneuron öncüleri domates + interneuron öncüleri, P1 ile ana bilgisayar beyin bölgeleri nakledilen P30 WT fareler temsilcisi bölümleri doldurmak. (A) Homotopik korteks korteks nakillerine, aşılı hücreleri tüm kortikal katmanları doldurmak ve endojen interneurons taklit türleri morfoloji görüntülemek. Seçilen görüntüler sağ tarafında nakli göre bölüm başına domates + hücreleri çok daha fazla sayıda sahip sol görüntü hücre sayıları farklı nakli, üzerinden değişkenlik vurgulayın. (B) düşük büyütme (solda) ve yüksek büyütme (sağda) temsilcisi Homotopik hippocampus hippocampus Greftler bölümlerden. Birçok domates + hücrelerde stratum pyramidale (SP) PV (büyük olasılıkla sepet hücreleri), endojen hipokampal interneurons benzer hızlı ise domates + hücrelerde tabaka oriens çoğunluğu (çok) SST (büyük olasılıkla O-LM hücreleri) hızlı unutmayın. (C) ile domates + striatum içinde mevcut heterotopik transplantasyon (Cortex Striatum) örneği. Ölçek çubukları B, c 50 mikron ve yüksek güç mag b düşük mag panelinde a 200 mikron = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 : Aşılı interneurons electrophysiologically olgun ve ana bilgisayar nöronal ağ entegre
(A) temsilcisi örnek olarak en yüksek ateş Frekanslar aşılı interneurons kaydetti. Sol, hızlı Spiking interneuron bir kalça Ctx greft dan Injected geçerli adımları:-100 pA ve 520 pA; doğrusigara-hızlı Spiking interneuron Ctx Ctx greft dan Injected geçerli adımları: -100 pA ve 360 baba. (B) sEPSCs örneği Hip Hip nakline üzerinden geç Spiking interneuron kaydedildi. (C) temsili resim Nkx2.1-Cre görüntüleme; Ai32 (YFP) hücrelerden Ctx, Ctx biocytin dolu (kırmızı) piramit sahip bir hücre nakli. Ölçek çubuğu 50 mikron =. (D) örnek mavi ışık darbeleri tarafından uyarılmış bir GABAergic postsinaptik akıntılarının piramidal hücrelerde bir [145 mM] ile Cl - kaydedildi kaydetti. Siyah, ortalama izlemelerini; kırmızıyla, ortalama yanıt Gabazine huzurunda kaydedildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Önemli bir özelliği, bu iletişim kuralı hücrelerin Beka maksimize. Doku ve hücreler her zaman buz gibi carboxygenated sACSF sağlama hücre survival tanıtmak gereklidir. Bu bir verimli diseksiyon ve çeşitli çözüm ve beyin ortamı dışında hücreleri harcamak süreyi en aza indirmek için ayrılma strateji gerektirir. Disseke ve nakledilen beyin bölgeleri sayısına bağlı olarak, diseksiyon ve/veya nakli adımda deneme uzunluğu azaltmak için yardımcı bir arkadaşın olduğu yararlı olabilir. Sağlık ve yavru hayatta kalmasını sağlamak için bu da buz anestezi süresi (< 4 dk) en aza indirmek ve ışık ile nakli işlemi sırasında ısıtmalı yavru tutmak önemlidir.
Transplante beyinlerinde önemli değişkenlik olabilir, diğer beyin binlerce içerirken bazı aşılı hücreler içermeyebilir. Birkaç P0-P2 çöp diseksiyon için birleştirme hangi bırakmak bir-ya nakli hücre yoğunluğu artırmak ve/veya ikisi de olasılığını artıracak aşılı pups sayısını artırmak aşılama için hasat hücre sayısını artırabilir başarılı nakli. Uygun beyin bölgesinde hedeflemek için kritik pups baş stabil ve beyne micropipette düşürücü zaman hareket etmez. Herhangi bir Başkanı değişen veya micropipette mili bükme mistargeting ve yanlış enjeksiyonları (örneğin lateral ventrikül içine hücrelerinin kaybı) neden olabilir. Ayrıca, bir enjeksiyon yeri mistargeted diye başarı oranları (tek taraflı veya çift taraflı) yavru başına birden fazla enjeksiyon site performans geliştirebiliriz. Gelecekte, stabilize etmek pup ve daha doğru ve tutarlı enjeksiyonları sağlamak için daha verimli bir stereotaksik strateji geliştirmek için en iyi olur.
TH P0-P2 zaman dilimi bilimsel ve teknik nedenlerden dolayı seçildi. Bu yaşta çoğu interneuron öncüleri terminal sitelerine göç var ama en az çevresel etkileşime sahip olabilirsiniz. Böylece bir bu timepoints onların belirli amaçlar için ayarlamak isteyebilirsiniz bu zaman dilimi diğer nöronal hücre tipleri ve beyin bölgeleri için doğru tutun olmayabilir. Örneğin, bu P0-P2 hasat interneuron öncüleri MGE hasat hücrelerle tedavi potansiyelini karşılaştırmak ilginç olacaktır: bir yaş daha fazla fayda olabilir ve/veya daha az istenmeyen yan etkileri diğerinden daha. Ayrıca, heterochronic nakli (örneğin, P0-P2 hücreleri toplama ve nakli beyin P7-10 içine veya tam tersi) gerçekleştirmek ilginç olabilir ortamında nasıl zamansal değişiklikleri tanımlamak için hücre kader ve olgunlaşma etkileyebilir. Enjeksiyonları P0-2 performans avantajı kafatası nispeten ince ve keskin bir micropipette ile kolayca nüfuz olmasıdır. P5 üzerinde herhangi bir iğne kaldırma veya kafatası inceltme gerektirir.
Bu protokol için açıklanan analiz differentially beyin bölgeleri arasında ifade edilir interneuron türlerinden belirli özellikleri sınırlıdır. Gelecekte, bir tek hücre sıralama gücünü tam transcriptome aşılı hücre tanımlamak için kullanmak olabilir. Bu tarafsız yaklaşım belirli genler (veya daha büyük sinyal cascades) teşhis edebilecek güçlü zenginleştirilmiş olan veya aday içgörü kaderini etkileyecek çevre yardım sağlamak kontrollere göre transplante hücrelerdeki tükenmiş belirlenmesi veya olgunlaşma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu araştırma Ulusal Sağlık Enstitüleri (K99MH104595) ve T.J.P. NICHD intramural araştırma programı tarafından desteklenen Gord Fishell, kimin Laboratuarı'nda bu yaklaşım başlangıçta kurulmuş teşekkür ediyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6297 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S0751 | |
| Calcium chloride | Sigma | C5080 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M2670 | |
| Glucose | Sigma | G7528 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Brain Matrices | Roboz | SA-2165 | Only needed if harvesting striatum |
| Fine point Dumont Forceps | Roboz | RS-4978 | |
| Microdissecting scissors | Roboz | RS-5940 | |
| Razor blades | ThermoFisher | 12-640 | |
| Pasteur pipettes | ThermoFisher | 1367820C | |
| Nanoject III | Drummond | 3-000-207 | |
| Manual Manipulator w/ stand | World Precision Instruments | M3301R/M10 | |
| 5 ml round bottom plastic tubes | ThermoFisher | 149591A | |
| 60 mm Petri dishes | ThermoFisher | 12556001 | |
| 100 mm Petri dishes | ThermoFisher | 12565100 | |
| Pronase | Sigma | 10165921001 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher | 16140063 | |
| DNase I | Sigma | 4716728001 | |
| Celltrics 50um filters | Sysmex | 04-0042327 | |
| Trypan blue | ThermoFisher | 15-250-061 | |
| Hemocytometer | ThermoFisher | 02-671-6 |
References
- Bozzi, Y., Casarosa, S., Caleo, M. Epilepsy as a neurodevelopmental disorder. Front Psychiatry. 3 (19), (2012).
- Takano, T. Interneuron Dysfunction in Syndromic Autism: Recent Advances. Dev Neurosci. , (2015).
- Inan, M., Petros, T. J., Anderson, S. A. Losing your inhibition: linking cortical GABAergic interneurons to schizophrenia. Neurobiol Dis. 53, 36-48 (2013).
- Batista-Brito, R., Machold, R., Klein, C., Fishell, G. Gene expression in cortical interneuron precursors is prescient of their mature function. Cereb Cortex. 18 (10), 2306-2317 (2008).
- Flames, N., et al. Delineation of multiple subpallial progenitor domains by the combinatorial expression of transcriptional codes. J Neurosci. 27 (36), 9682-9695 (2007).
- Wonders, C. P., et al. A spatial bias for the origins of interneuron subgroups within the medial ganglionic eminence. Dev Biol. 314 (1), 127-136 (2008).
- Inan, M., Welagen, J., Anderson, S. A. Spatial and temporal bias in the mitotic origins of somatostatin- and parvalbumin-expressing interneuron subgroups and the chandelier subtype in the medial ganglionic eminence. Cereb Cortex. 22 (4), 820-827 (2012).
- Petros, T. J., Bultje, R. S., Ross, M. E., Fishell, G., Anderson, S. A. Apical versus Basal Neurogenesis Directs Cortical Interneuron Subclass Fate. Cell Rep. 13 (6), 1090-1095 (2015).
- Taniguchi, H., Lu, J., Huang, Z. J. The spatial and temporal origin of chandelier cells in mouse neocortex. Science. 339 (6115), 70-74 (2013).
- Bandler, R. C., Mayer, C., Fishell, G. Cortical interneuron specification: the juncture of genes, time and geometry. Curr Opin Neurobiol. 42, 17-24 (2017).
- Kepecs, A., Fishell, G. Interneuron cell types are fit to function. Nature. 505 (7483), 318-326 (2014).
- Mayer, C., et al. Developmental diversification of cortical inhibitory interneurons. Nature. 555 (7697), 457-462 (2018).
- Mi, D., et al. Early emergence of cortical interneuron diversity in the mouse embryo. Science. 360 (6384), 81-85 (2018).
- Alvarez-Dolado, M., et al. Cortical inhibition modified by embryonic neural precursors grafted into the postnatal brain. J Neurosci. 26 (28), 7380-7389 (2006).
- Baraban, S. C., et al. Reduction of seizures by transplantation of cortical GABAergic interneuron precursors into Kv1.1 mutant mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (36), 15472-15477 (2009).
- De la Cruz, E., et al. Interneuron progenitors attenuate the power of acute focal ictal discharges. Neurotherapeutics. 8 (4), 763-773 (2011).
- Gilani, A. I., et al. Interneuron precursor transplants in adult hippocampus reverse psychosis-relevant features in a mouse model of hippocampal disinhibition. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (20), 7450-7455 (2014).
- Larimer, P., et al. Caudal Ganglionic Eminence Precursor Transplants Disperse and Integrate as Lineage-Specific Interneurons but Do Not Induce Cortical Plasticity. Cell Rep. 16 (5), 1391-1404 (2016).
- Martinez-Cerdeno, V., et al. Embryonic MGE precursor cells grafted into adult rat striatum integrate and ameliorate motor symptoms in 6-OHDA-lesioned rats. Cell Stem Cell. 6 (3), 238-250 (2010).
- Quattrocolo, G., Fishell, G., Petros, T. J. Heterotopic Transplantations Reveal Environmental Influences on Interneuron Diversity and Maturation. Cell Rep. 21 (3), 721-731 (2017).
- Xu, Q., Tam, M., Anderson, S. A. Fate mapping Nkx2.1-lineage cells in the mouse telencephalon. J Comp Neurol. 506 (1), 16-29 (2008).
- Thompson, L., Bjorklund, A. Survival, differentiation, and connectivity of ventral mesencephalic dopamine neurons following transplantation. Prog Brain Res. 200, 61-95 (2012).
- Liang, Y., Agren, L., Lyczek, A., Walczak, P., Bulte, J. W. Neural progenitor cell survival in mouse brain can be improved by co-transplantation of helper cells expressing bFGF under doxycycline control. Exp Neurol. 247, 73-79 (2013).
