Summary
Utmanande unga nervceller i nya regioner av hjärnan kan avslöja viktiga insikter i hur miljön skulpterar neuronala öde och mognad. Det här protokollet beskriver en procedur för att skörda interneuron prekursorer från delar av hjärnan och transplantera dem antingen homotopically eller heterotopically in i hjärnan av postnatal pups.
Abstract
Neuronala öde beslutsamhet och mognad kräver ett intrikat samspel mellan genetiska program och Miljösignaler. Förgrymmat roller inneboende vs. extrinsic mekanismer som reglerar denna differentiering process är dock en gåta för alla utvecklingstoxicitet neurobiologists. Problemet förstoras för GABAergic interneuroner, en otroligt heterogen cell befolkning som är födda från övergående embryonala strukturer och genomgå en utdragen flyttande fasen att skingra hela telencephalon. För att utforska hur olika hjärnan miljöer påverkar interneuron öde och mognad, utvecklade vi ett protokoll för skörd fluorescently märkt omogna interneuron prekursorer från delar av hjärnan hos nyfödda möss (P0-P2). I den här åldern interneuron migreringen är nästan klar och dessa celler är bosatta i sin sista vila miljöer med relativt liten synaptic integration. Efter insamling av enstaka cell lösningar via flödescytometri, dessa interneuron prekursorer transplanteras in P0-P2 vildtyp postnatal pups. Genom att utföra både homotopic (t.ex. cortex-till-cortex) eller heterotopic (t.ex. cortex-till-hippocampus) transplantationer, man kan bedöma hur utmanande omogna interneuroner i nya hjärnan miljöer påverkar deras öde, mognad och krets integration. Hjärnor kan skördas i vuxna möss och analyseras med en mängd olika posthoc analyser på ympade celler, inklusive immunhistokemisk, elektrofysiologiska och transkriptionell profilering. Detta generella tillvägagångssätt ger utredarna en strategi till assay hur skilda hjärnan miljöer kan påverka många aspekter av neuron utveckling och identifiera om neuronala särdrag är främst driven av hårdkodade genetiska program eller miljömässiga ledtrådar.
Introduction
Kortikal funktion kräver en balans mellan retande projektion nervceller och hämmande GABAergic interneuroner, en extremt heterogen befolkning med distinkta morfologier, elektrofysiologiska egenskaper, connectivity och neurokemiska markörer. Onormal utveckling och funktion av interneuroner (och specifika interneuron undergrupper) har kopplats till patobiologi av psykiatriska sjukdomar som schizofreni, autism och epilepsi1,2,3. Dessutom är många gener inblandade i dessa sjukdomar i hjärnan starkt berikad med unga interneuroner4. Således behövs en större förståelse för de mekanismer som reglerar interneuron öde beslutsamhet och mognad att förstå normala utveckling och potentiella etiologier många hjärnsjukdomar.
Framhjärnan interneuroner föds främst från två övergående embryonala strukturer, de mediala och stjärtfenan ganglieblockerande eminenser (MGE och CGE, respektive). Dessa postmitotic celler (interneuron prekursorer) sedan genomgå en utdragen tangentiella migration fas att skingra hela telencephalon där de integreras i en mängd olika kretsar. MGE-derived interneuroner består av tre till stor del icke-överlappande, neurochemically definierade undergrupper: snabbt tillsatta parvalbumin (PV+) interneuroner, icke-fast tillsatta somatostatin (SST+) interneuroner, och sent tillsatta neuronala nitrat Oxide synthase (nNOS+) interneuroner som utgör Hippocampus neurogliaform och murgröna celler. Talrika labs har identifierat flera mekanismer inom MGE som reglerar inledande öde beslut till PV+ eller SST + interneuroner, inklusive rumsliga övertoningar morphogens, födelsedatum av interneuron prekursorer och funktionsläget av neurogen division 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. det har föreslagits att interneuroner initialt differentieras till 'kardinal klasser' och sedan successivt mogna till 'slutgiltiga klasser' som de interagerar med deras miljö11. Nya rön indikerar att några mogna interneuron undertyper kan vara genetiskt hårdkodade som dessa celler blir postmitotic i de ganglieblockerande eminenser, som visar att tidig definierade inneboende genetiska program kan spela en större roll än tidigare uppskattad12,13. Nyckelfrågan om hur de inneboende genetiska program interagerar med miljön ledtrådar till drive differentiering in distinkta interneuron subtyper är dock fortfarande till stora delar outforskat.
Ett flertal studier har transplanteras embryonala MGE celler direkt in i en mängd olika hjärnregioner, med resultaten konsensus som ympade celler mogen och släppa GABA för att generellt hämma de lokala endogena kretsar14,15, 16,17,18,19. Dessa lovande observationer har genererat betydande intresse i att använda mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hIPSC)-härledda interneuroner för att behandla en mängd olika hjärnsjukdomar. Dock tänker mycket få av dessa studier bedöma om dessa ympade celler mognar till de förvänta typerna av mogna interneuroner, en kritisk komponent när man på translationella angreppssätt.
För att lösa hur miljön påverkar interneuron differentiering och mognad, utformades en strategi för att transplantera omogna interneuron prekursorer till nya hjärnan miljöer för att undersöka huruvida ympade interneuroner anta funktioner i mottagande miljö eller behålla funktioner från givare miljö20. MGE transplantationer är inte lämpliga att ta itu med denna fråga eftersom MGE innehåller en blandad befolkning av interneuron och GABAergic projektion celler som skingra hela talrika hjärnan regioner21. Utan att veta var dessa MGE celler skulle har migrerats, kan man inte fullt ut bedöma hur dessa transplantationer påverkas av hjärnan miljön. Genom att skörda interneuron prekursorer vid tidig postnatal tidpunkter, är detta problem kringgås genom att erhålla omogna celler som har slutfört sin migration och uppnått sina mål hjärnan regionen men har minimal interaktion med miljön. Genom att fokusera på specifika funktioner i interneuroner som uttrycks differentially mellan olika hjärnregioner, kan man då bestämma hur värdmiljön ändrar interneuron egenskaper. En allmän strategi som beskrivs i detta protokoll bör vara tillämplig på någon utredare att vill undersöka hur unga nervceller beter sig när utmanas i en ny miljö.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experimentella rutiner genomfördes i enlighet med riktlinjerna som National Institutes of Health och godkändes av NICHD djur vård och användning kommittén (ACUC). Protokollet beskrivs nedan använder tredjeparts Nkx2.1-CreC / +; Ai9+/- valpar för att skörda MGE-derived interneuron prekursorer, men kan utföras på alla önskade fluorescerande reporter mus linjer. Både manliga och kvinnliga tidig postnatal möss (P0-P2) användes urskillningslöst för givare och värd vävnad.
1. lösningen förberedelse
- Förbereda sackaros konstgjorda cerebrospinalvätska (sACSF) enligt följande recept (enhet i mM): 87 NaCl, 26 NaHCO3, 2,5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 0,5 CaCl2, 7 MgCl2, 10 glukos, 75 sackaros mättad med 95% O 2, 5% CO2 vid pH = 7.4.
- Fyll en bägare med 350 mL ren ddH2O baserat på slutlig önskad volym (500 mL sACSF bör vara tillräckligt för 1-2 kullar), lägga till en magnetisk uppståndelse och placera bägaren på uppståndelse plattan.
- Vikt alla salter (NaCl, NaHCO3, KCl, NaH2PO4, glukos, sackaros), en i taget och tillsätt vatten enligt följande tabell. Belopp kan justeras beroende på slutlig önskad volym.
Reagens Molekylvikt Koncentration (mM) Gram/500 mL Natriumklorid 58.44 87 2,54 Natriumbikarbonat 84.01 26 1,09 Kalium klorid 74.55 2.5 0,09 Monobasiskt natriumfosfat 119.98 1,25 0,08 Glukos 180.16 10 0,9 Sackaros 342,3 75 12,84 - Bubbla lösningen med 95% O2, 5% CO2 (carboxygen) i minst 20-30 minuter innan du lägger till lämplig mängd CaCl2 (0,25 mL från en 1 M lösning för 500 mL sACSF) och MgCl2 (3,5 mL från en 1 M lösning för 500 mL sACSF) .
- Kontrollera pH-värdet med hjälp av en standard pH-mätare. Om beredda korrekt, lösningen bör ha pH = 7.4.
- Ge lösningen till slutlig volym av 500 mL med ren ddH2O i en graderad cylinder.
- sACSF kan vara förberett upp till 1-2 dagar framåt. Före användning, placera på isen och bubbla med carboxygen i minst 15 minuter före start av dissektion, och hålla flaskan med sACSF bubblar hela dissektion.
2. dissektion förberedelse
- Följande verktyg bör steriliseras autoklaverad: minst en liten fin vass sax, 2 fina pincett (stil #5), böjda fina pincett, hjärnan snittning matrice mögel och flera rakblad. En liten spatel ta bort hjärnan från skallen är valfritt.
- Ställ in arbete stationen nära dissektion Mikroskop med petriskålar (9 cm och 4 cm diametrar), 50 mL koniskt plaströr att samla de isolerade hjärnregioner och stora bore plast överföring pipetter, alla höll på is. Förbereda flera 50 mL rör full av carboxygenated sACSF på is. Om dissekera mer än en hjärnregionen, se till att korrekt och tydligt märka både samling rören och överföring pipetterna att undvika kontaminering.
- Har en ytterligare ishink för is anestesi av pups via hypotermi, och en ordentlig farligt avfall väska att avyttra slaktkroppar.
- Förbereda brand-polerat glas Pasteur-pipetter för vävnad sönderdelning. Använd en bunsenbrännare att sterilisera och forma spetsen på pipetten. Förbereda flera pipetter med olika bore öppningar: stor (~ 600 µm), medium (~ 300 µm) och små (~ 100 µm). Testa flödet genom tips med vatten för att säkerställa olika trituration hastigheter. Minst en pipett av varje slag som behövs för varje isolerad hjärnregionen, men med flera extra för varje storlek rekommenderas vid igensättning eller bryta tips.
3. transplantation utarbetandet
- Använda en elektrod avdragare för att förbereda spetsig glas Mikropipetter. Bryta eller avfasning tipset att göra en skarp vinklade punkt, med spetsen med en diameter på ~ 20-40 µm. Inspektera visuellt tips med ett mikroskop för att kontrollera att inget damm eller kvarstående glas partiklar som skymmer bländaren.
- Med en fin nål spruta, Fyll helt i glas mikropipett med mineralolja. Infoga mikropipett i Nanoject apparaten (eller annan Mikroskop enhet). För Nanoject III, ställa in följande program: volym = 60 nL, Rate = 30, cykler = 25, dröjsmål = 1 s.
- Säkra Nanoject till manipulatorn som är kopplad till en magnetisk bas och justera manipulatorn så att Nanoject pekar rakt ned, inte lutas längs x- eller y axeln.
- Fäst några självhäftande spackel (~ 1-2 cm för P0-P2 pups) till toppen av en petriskål att skapa en upphöjd yta att vila pup's huvud på omslaget.
- Snitt ~ 6-8 cm långa ränder av lab tejp och gör ett diamant-formade hål i mitten. Tejpen används för att stabilisera huvudet av pup under förfarandet, medan även stretching huden och möjliggör enkel visualisering av sevärdheter och den berörda regionen.
- Förbereda en värmedyna intill injektion, och slå till 'låg' inställning innan du börjar injektioner. Täcka pad det med några pappershanddukar eller en blöja pad.
- Om utför flera villkor för transplantation, har en liten sax som är redo att utföra PUP tå/svans klippning till taggen mottagande olika injektioner.
4. avlägsnande av P0-P2 mus hjärnan
- Innan du startar proceduren, fylla flera petriskålar med kylda, carboxygenated sACSF. Också fylla den samling rör med ~ 25 mL sACSF.
- Linda en P0-P2 pup i vissa parafilm eller en handske och plats det väl täckt under isen. Ställa in en timer för 5 minuter och starta den. Efter den tiden, ta bort pup och kontrollera att den inte svarar att nypa av hindpaw.
- Halshugga pup och samla in huvudet i en petriskål fylld med sACSF. Skära huden längs mittlinjen att exponera skallen.
- Leta upp öppningen i skallen på hindbrain/ryggmärgen och Anslut ena änden av tången längs dorsala delen av skallen. Försiktigt ta tag skallen vid mittlinjen och 'peel' bort bitar sidled för att exponera hjärnan, att vara noga med att inte skada hjärnan.
- Vid avlägsnande av de dorsala och laterala delarna av skallen, använda tången eller spateln att varsamt ta bort hjärnan från skallen av ösa under ventrala ytan av hjärnan, försöker att inte skada något område. Placera hjärnan i en annan petriskål fylld med carboxygenated sACSF.
Obs: Vi presenterar två olika strategier för dissekera ut hippocampus, striatum och cortex. Den första strategin (steg 5.1-5.10) är användbar för någon mus linje medan den andra strategin (steg 6.1-6,7) skulle behöva en fluorescerande reporter mus renlig separera striatum från den globus pallidus och andra hjärnstrukturer. Om striatum inte är önskvärt, då ignorera den striatum-specifika delen av de två teknikerna
Figur 1 : Schematisk och bilder för hjärnan dissektion, teknik #1
Dissektion teknik som beskrivs i steg 5.1-5.10. Om striatum vävnad önskas, placera P1 hjärnan i hjärnan matriser ventrala sida upp. Placera rakblad i matrice slots genom främre hjärnan att erhålla koronalt avsnitt genom striatum. Ta bort striatum bitar från båda hjärnhalvorna, upprepa för alla sektioner som innehåller striatum som är anterior hippocampus. Om striatum vävnad inte är önskvärd, helt enkelt hemisect hjärnan, placera den halvklot mediala sidan upp i skålen och ta bort de ventrala-mediala hjärna strukturerna (basala ganglierna, thalamus, etc.) för att exponera hippocampus. Använda pincett för att nypa av hippocampus, sedan vänds halvklotet och använda pincett för att dissekera ut en bit av kortikal vävnad. De vertikala svarta linjerna genom den schematiska halvklot där nedskärningarna skulle vara att ta bort avsnitten striatum. Skalstapeln = 500μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
5. skörda Striatum, Hippocampus och Cortex, teknik #1
- Placera hela hjärnan på snittning matrice mögel, ventrala sida upp. Plats 1 rakblad genom den mest främre delen av hjärnan (genom främre lukt-tarmkanalen).
- Infoga en annan rakblad bara posteriort till den första att generera en 0,5 mm skiva, och placera en extra rakblad posteriort här.
- Överföra dessa skivor till en petriskål med carboxygenated sACSF och placera resten av hjärnan till en separat skål med sACSF. Överföra striatum skivor till en dissekera omfattning att visualisera striatum. Dessa skivor bör innehålla stora delar av främre striatum och saknar hippocampus. Använda en fluorescerande dissekera omfattning med Nkx2.1-Cre+/-; Ai9+/- skivor att skilja den svaga striatum tdTomato signal från det starka tdTomato signalerar av den globus pallidus.
- Med eller utan fluorescens, nyp utåt striatum från båda hjärnhalvorna på alla avsnitten och överföring striatum bitar till korrekt märkt 50 mL tub med sACSF, lagra på is.
- Hemisect hjärnan längs mittlinjen med pincett eller ett rakblad, och låg på halvklotet så att den mediala ytan är vänd uppåt.
- Ta bort den ventrala hjärnvävnaden (basala ganglierna, thalamus, etc) genom att nypa av denna vävnad med pincett. När du är klar, hippocampus (en korv formad struktur spanning anteroposterior axel längs den dorsala cortexen) och ventrikulär sida av cortex bör synas tydligt.
- Ta bort hippocampus, infoga tips av tången framför främre hippocampus och försiktigt separera hippocampus från cortex genom att flytta tången posteriort och klämmande längs Hippocampus-kortikala gränsen. Överföra isolerade hippocampus till korrekt märkt 50 mL tub med sACSF, förvaras på is.
- För att dissekera cortex, placera den hemisected cortex mediala sidan nedåt. Sedan använda pincetten nypa den mest dorsala, ventrala, främre och bakre delar av hjärnbarken att lämna en fyrkantig bit av mediala somatosensoriska cortex, ~ 2 mm x 2 mm. Flip cortex så mediala sidan är upp och rent av eventuella överskott icke-kortikal vävnad (thalamus basala ganglierna, etc.) på den mediala ytan om det behövs. Överföra cortex bit till korrekt märkt 50 mL tub med sACSF, förvaras på is.
- Upprepa proceduren med den andra halvklotet att samla både hippocampi och cortex regioner.
- Upprepa proceduren för alla valpar, se till att ersätta sACSF i petriskålar mellan valparna så att sACSF förblir kall och fräsch.
Figur 2 : Schematisk och bilder för hjärnan dissektion, teknik #2
Dissektion teknik som beskrivs i steg 6.1-6,7. Fästa hjärnan på en dissekera maträtt ryggsidan upp. Efter peeling cortex framåt, hippocampus och striatum är synliga och kan tas bort, då en del av hjärnbarken kan tas bort som beskrivs i föregående teknik. Beroende på transgena möss linje, kan striatum saneras bort globus pallidus och annan vävnad. I Nkx2.1Cre; Ai9 mus linje, den globus pallidus har en betydligt högre täthet av tomat +-celler jämfört striatum. Skalstapeln = 500 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
6. skörda Striatum, Hippocampus och Cortex, teknik #2
- Placera den hjärna ventral sidan ner i en sylgard-belagda petriskål som innehåller sACSF och pin det genom lillhjärnan och främre cortex eller luktsinnet lökar.
- Börjar med ena hjärnhalvan, använda böjda pincetten försiktigt separera den bakre cortexen från underliggande hippocampus och andra vävnader. Försiktigt lägga skalade cortex platt på petriskål. Upprepa för andra halvklotet. Hippocampi och striatum bör synas tydligt i exponerade hjärna.
- Använd tången för att nypa en hippocampus vid mittlinjen och skala hippocampus sidled för att ta bort. Placera i injektionsflaskan med samling på isen och upprepa med andra hippocampus.
- För striatum, försiktigt skrapa runt kanterna av striatum att lossa den från den omgivande vävnaden. Sedan bort striatum genom att nypa bort det från undersidan och tillsätt till samling röret på is. Upprepa för andra striatum.
- Kortikala sektioner kan skördas som beskrivs i steg 5,8.
- Om du använder en transgena reporter mus linje (t.ex. Nkx2.1-Cre; Ai9, Lhx6-GFP, etc.), överföra striatum till en petriskål med sACSF och Visa under lysrör dissekera omfattning. Använda pincett för att ta bort alla icke-striatum vävnad från striatum (i Nkx2.1-Cre; Ai9 möss, ta bort alla 'ljus' vävnad, som globus pallidus har mycket högre MGE-derived, tdTomato + cell densiteten jämfört striatum). Upprepa för alla striatum.
- Upprepa proceduren för alla valpar, se till att ersätta sACSF i petriskålar mellan valparna så att sACSF förblir kall och fräsch.
7. generera enda Cell Dissociations
- Efter dissektion är komplett, Bered en 1 mg/mL Pronase genom vägning 10 mg Pronase och upplösning i 10 mL carboxygenated sACSF.
- Överföra vävnad från de 50 mL injektionsflaskorna av insamling till 5 mL rund botten rör innehållande 2 mL av Pronase-sACSF lösningen. Inkubera i vävnaden under 20 minuter vid rumstemperatur, skakningar/snärta röret 3 - 4 gånger med fingret under inkuberingen att blanda proverna.
- Under denna inkubation, förbereda rekonstitutionslösningen: 1% FBS (100 μL) + DNAS (1 μL 1:10,000 lagerför DNAse) i 10 mL carboxygenated sACSF.
- Efter de 20 minuter, försiktigt ta bort den pronase lösningen för att inte störa vävnaden längst och ersätta det med 1-2 mL rekonstitutionslösningen (total volym är beroende av att utgångsbeloppet vävnad).
- Mekaniskt separera vävnaden av triturating vävnaden med de tidigare beredda eld polerade Pasteur-pipetterna. Börjar med stora genomlopp (~ 600 µm) pipetten, aspirera och utvisa vävnad lösningen minst tio gånger för att bryta upp vävnaden. Inte införa bubblor i lösningen. Upprepa denna process för mediet bore pipett och små bore pipett. Lösningen bör vara molnigt och ingen tydlig bit vävnad ska vara synliga i samlingen rören.
- Pipettera cell lysate lösningen genom ett 50 µm filter i 5 mL koniska rör ta bort valfri cell klumpar. Fortsätt med dessa enstaka cell lösningar till flödescytometri (eller potentiellt direkt till cell räknar om ingen sortering behövs).
8. förbereda FACS-renat Cell lösningar för Transplantation
- Vid mottagande cell lösningar från flödescytometer, överför lösningen till en (eller flera) 1,5 mL koniska rör och snurra cellerna vid 500 g i 5 min på 4oC. Efter centrifugering, ta bort media så det ~ 20-40 µL kvar i röret. Rekonstituera celler i detta återstående media (och kombinera lösning om flera rör behövs).
- På en liten bit av parafilm, blanda ihop 2 µL av cell lösning + 8 µL sACSF + 10 µL trypan blå fläck. Pipettera 10 µL till en hemocytometer med Skjutlucka.
- Räkna antalet levande celler i varje 4 x 4 fyrkantiga gallren i hörnen av den hemocytometer som använder en standard laboratorium hand tally counter (döda celler blir blå från färgen), och genomsnittlig dessa 4 räknas. Multiplicera detta tal med 100 för att bestämma antalet celler per µL.
- Om det behövs, justera volymen så att cellerna är vid en koncentration på 10 000-30 000 celler/µL i rekonstitutionslösningen. Slutlig koncentration är beroende av totala mängden celler och önskat antal transplantationer. Hålla celler på is för transplantation
9. transplantation till P0-2 WT valpar
- Linda en WT pup i vissa parafilm eller en handske och plats det väl täckt under isen. Ställa in en timer för 5 min och starta den. Efter den tiden, ta bort pup och kontrollera att den inte svarar att nypa av hindpaw.
- Medan pup är på is, blanda cell lösningen genom pipettering det flera gånger att säkerställa cellsuspensionen blandas väl före lastning (blanda cellerna före lastningen mikropipett för varje injektion). Sedan Töm mikropipett av mineralolja och fyll den helt med cellsuspensionen.
- Placera den sövda pup på petriskål med huvudet liggande på självhäftande spacklet så att toppen av huvudet är relativt platt. Placera bandet med diamond hålet över huvudet av den pup, dra den spända huden sträcks och huvudet är fast men att musen är bekvämt och andas väl. Lambda ska synas genom diamond hålet.
Figur 3 : Schematisk och bilder för transplantation
(A) bilder av injektion setup. Observera att lambda syns tydligt genom den pup's skalle och bör användas för nollställning av mikropipett. Skalstapeln = 1 tum. (B) Schematisk föreställande injektionsproceduren att rikta hippocampus. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Flytta den säkra pup under Nanoject och sänk mikropipett så att spetsen på mikropipett är på direkt ovanför lambda. Spela in i x-y-koordinater på manipulatorn.
- Justera manipulator rattarna för att flytta mikropipett till önskade koordinater längs mediolateral och huvudet anteroposterior axel: S1 Cortex → 1,0 mm främre och 1,0 mm i sidled, Hippocampus → 0,75-1,0 mm främre och 1,0-1,2 mm i sidled, Striatum → 2,0-2,2 mm främre och 1,5 mm i sidled. Koordinater kan justeras något för att kompensera för ålder pup (t.ex. P0 vs. P2) eller stam av möss (t.ex. CD1 möss är större än och C57/B6 på P2).
- Sänk mikropipett tills den bildar en liten konkavitet på huden. Sedan Vrid på z-axeln manipulator kontrollen ordentligt men försiktigt för att köra mikropipett genom huden och skallen till in i hjärnan. När mikropipett träder hjärnan, trycket på skallen kommer att släppas och konkavitet försvinner.
- Återkalla mikropipett något tills spetsen är omgiven av en kon av huden, formad som ett tält. Läs koordinater längs de z-axlarna: detta kommer att vara z-axeln noll.
- Sänka mikropipett till önskat djup: Cortex → 0,75-1,0 mm, Hippocampus → 1,2-1,5 mm, Striatum → 2,0-2,5 mm. djup kan justeras något för att kompensera för ålder eller stam av pup.
- Injicera cellsuspension med hjälp av Nanoject III-programmet som beskrivs ovan. Efter injektion programmet är komplett, vänta 15-20 s före långsamt tillbakadragande den mikropipett för att minimera lösning som läcker ut från injektionsstället.
- Om utför bilaterala injektioner, åter noll mikropipett ovan lambda och flyttar till rätt koordinater på andra halvklotet. Alternativt kan man göra två injektioner i cortex av samma halvklotet genom att flytta mikropipett 1 mm främre av den första injektionen.
- När transplantation är klar, ta bort tejpen och överföra pup på en värmedyna. Om nödvändigt, tagga pup av svans eller tå klippning. När pup har återfått en röd färg och är rörliga, placera det tillbaka i buren med mamman.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta protokoll visar hur att skörda delar av hjärnan från tidig postnatal hjärnor (figur 1-2), samla in enstaka cell dissociations interneuron prekursorer och transplantera dessa celler till olika regioner i hjärnan i naiva WT postnatal valpar (figur 3). För posthoc analyser skördades hjärnor som fått interneuron föregångare ympkvistar mellan P30-35 att karakterisera cellmorfologi, neurokemiska markörer och elektrofysiologiska egenskaper. Dessa typer av analyser utförs ofta mellan P21-P30 i normala möss, men eftersom mognaden av transplanterade celler kan fördröjas något på grund av förfarandet dissektion/dissociation, väntar på ytterligare 5-10 dagar rekommenderas att kompensera för detta fördröjd mognad. Typ av analys som skall utföras kommer att diktera den rätt strategin för att skörda hjärnan. Särskilt, iakttog vi inte förmånliga celldöd av specifika interneuron undergrupper som kunde bias för eller emot vissa subtyper20.
För immunhistokemisk analys, möss var perfusion med 4% PARAFORMALDEHYD och hjärnor togs bort. 50 μm vibratome skivor var förberedda genom riktade hjärnregionen och lagras i frostskyddsvätska lösning eller bearbetas för immunfärgning som tidigare beskrivits20. Vissa hjärnor innehöll inte någon tomat + celler, som kan bero på felaktig inriktning (t.ex. injektion alltför djupt in i ventrikeln), celler förlorat eller som genomgår apoptos under ympning förfarande, eller avvisande av transplanterade celler av värden. Baserat på sista blodkroppar, det uppskattas att endast 2-5% av ympade celler överleva20, vilket är i linje med andra transplantation förfaranden22,23.
Inte överraskande, fanns det betydande variationer i det totala antalet tomat + celler i framgångsrika transplantationer, alltifrån dussintals till flera tusen tomat + celler (figur 4A). Ympade celler var lokaliserade i Regionkommittén rätt, med många visar interneuron morfologier och välkarakteriserad interneuron neurokemiska markörer (figur 4B). Liknande cell överlevnad nummer och mognad profiler observerades även när celler var ympade in i nya miljöer i heterotopisk transplantationer (figur 4 c).
Utöver immunhistokemisk analys utfördes elektrofysiologiska analys på ympade celler för att bekräfta att de har integrerat i hjärnan kretsar och Visa förväntade inneboende och bränning egenskaper. Hjärnor skördades från P30-35 möss och skivor förberedda för fysiologiska inspelningar som tidigare beskrivits20. De ympade interneuroner presenteras vuxen-liknande fysiologiska egenskaper och distinkta bränning mönster kan vara kännetecknas som var representativ av välkarakteriserad interneuron subtyper (figur 5A), tyder på att ympade interneuroner kunde ordentligt mogna i värdmiljön. Kontrollera att transplanterade celler integrerades i neuronala nätverk genom var sEPSCs också inspelade (figur 5B). Dessutom utfördes en delmängd av transplantationer med interneuroner uttrycker ChR2 följt av inspelning från pyramidala celler lokaliserade nära transplanterade interneuroner. Dessa data visade att postsynaptiska GABAergic strömmar är framkallat av blått ljus (figur 5 c-D).
Figur 4 : Ympade interneuron prekursorer fylla värd hjärnan representativa sektioner från P30 WT möss som transplanterades med interneuron prekursorer tomat + P1. (A) i homotopic cortex-till-cortex transplantationer, ympade cellerna fylla alla kortikala skikt och Visa morfologier som efterliknar endogena interneuroner. Valda bilder belysa variabiliteten i cell nummer från olika transplantationer, med den vänstra bilden att ha ett mycket större antal tomat + celler per sektion jämfört med transplantationen på höger sida. (B) låg förstoring (vänster) och hög förstoring (höger) representativa sektioner från homotopic hippocampus-till-hippocampus ympkvistar. Notera att majoriteten av tomat + celler i de stratum oriens (så) uttrycka SST (sannolikt O-LM celler) medan många tomat + celler i stratum pyramidale (SP) express PV (sannolikt korg celler), liknande endogena Hippocampus interneuroner. (C) exempel på en heterotopisk transplantation (Cortex-till-Striatum) med tomat + närvarande i striatum. Skala barer = 200 μm i A i låg mag panel i B, 50 μm i C och hög effekt mag i B. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 5 : Ympade interneuroner är elektrofysiologiskt mogna och integrera i mottagande neuronala nätverk
(A) representativa exempel på de högsta frekvenserna för bränning inspelade från ympade interneuroner. Vänster, snabbt tillsatta interneuron från ett HipHop-till-Ctx transplantat, injiceras aktuella stegen:-100 pA och 520 pA; rätt, icke-Fast tillsatta interneuron från en Ctx-till-Ctx transplantat, injiceras aktuella stegen: -100 pA och 360 pA. (B) exempel på sEPSCs registreras i en sent tillsatta interneuron från Hip-till-Hip transplantation. (C) representativ bild visar Nkx2.1-Cre; Ai32 celler (YFP) från en Ctx-till-Ctx transplantation med biocytin-fyllda (röd) pyramidala celler. Skalstapeln = 50 μm. (D) exempel på en GABAergic postsynaptiska strömmar frammanade av blå ljuspulser registreras i pyramidala celler, inspelad med en [145 mM] Cl-. I svart, genomsnittliga spår; i rött, genomsnittliga svar registreras i närvaro av Gabazine. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En kritisk aspekt av detta protokoll maximera överlevnadsförmågan för cellerna. Att garantera att vävnader och celler är alltid i iskall carboxygenated sACSF är nödvändigt att främja cellöverlevnad. Detta kräver en effektiv dissektion och dissociation strategi för att minimera tiden som cellerna spenderar i olika lösning och utanför hjärnan miljön. Beroende på antalet regioner i hjärnan som dissekeras och transplanteras, kan det vara fördelaktigt att ha en partner som stöd i dissektion eller transplantation stegen för att minska längden på experimentet. För att säkerställa hälsa och överlevnad av pup, är det också viktigt att minimera is anestesi (< 4 min) och hålla den pup som värms med ljus under förfarandet för transplantation.
Det kan finnas betydande variabilitet i transplanterade hjärnor, vissa kan inte innehålla några ympade celler medan andra hjärnor innehåller tusentals. Kombinera flera P0-P2 kullar för dissektion kan öka antalet celler skördas för ympning, som gör att man kan antingen öka transplantation cell densiteten och/eller öka antalet ympade PUP, som båda kommer att förbättra sannolikheten för framgångsrika transplantationer. För att rikta rätt hjärnregionen, är det viktigt att pup's huvud stabiliseras och rör sig inte när du sänker mikropipett in i hjärnan. Någon förskjutning av huvudet eller böjning av mikropipett axeln kan resultera i målinriktning och Felaktiga injektioner (såsom förlust av celler i den laterala ventrikeln). Dessutom kan utför flera injektionsställen per valp (ensidigt eller bilateralt) förbättra framgång priser ifall ett injektionsställe är mistargeted. I framtiden vore det optimala att utveckla en effektivare stereotaxic strategi för att stabilisera pup och ge mer exakt och konsekvent injektioner.
Th P0-P2 tidsram valdes för både vetenskapliga och tekniska skäl. Vid denna ålder, de flesta interneuron prekursorer har migrerat till deras terminal webbplatser men har minimal miljösamspel. Denna tidsram kan inte hålla sant för andra typer av neuronala celler och områden i hjärnan, så man kanske vill justera dessa tidpunkter för deras specifika ändamål. Till exempel, det skulle vara intressant att jämföra den terapeutiska potentialen hos dessa P0-P2 skördas interneuron prekursorer med MGE-skördade celler: en ålder kan ha fler fördelar och/eller mindre oönskade biverkningar än den andra. Dessutom kan det vara intressant att utföra heterochronic transplantationer (t.ex. att samla celler på P0-P2 och omplantering i P7-10 hjärnor, eller vice versa) att identifiera hur tidsmässiga förändringar i miljön kan påverka cell öde och mognad. Fördelen med utför injektioner på P0-2 är att skallen är relativt tunn och kan brytas lätt med en skarp mikropipett. Alla injektioner över P5 kommer att kräva att ta bort eller gallring skallen.
Den analys som beskrivs i detta protokoll är begränsad till specifika kännetecken för interneuron undertyper som uttrycks differentially mellan regioner i hjärnan. En i framtiden kunde utnyttja kraften i enskild cell sekvensering för att karakterisera den fullständiga transkriptom ympade celler. Denna förutsättningslös strategi kan identifiera specifika gener (eller större signalering kaskader) som är starkt berikad eller utarmat på transplanterade celler jämfört med kontroller, vilket skulle ge inblick i kandidat miljömässiga ledtrådar som skulle påverka ödet bestämning eller mognad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av National Institutes of Health (K99MH104595) och NICHD intramurala research program till T.J.P. Vi tackar Gord Fishell, i vars lab upprättades ursprungligen detta tillvägagångssätt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6297 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S0751 | |
| Calcium chloride | Sigma | C5080 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M2670 | |
| Glucose | Sigma | G7528 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Brain Matrices | Roboz | SA-2165 | Only needed if harvesting striatum |
| Fine point Dumont Forceps | Roboz | RS-4978 | |
| Microdissecting scissors | Roboz | RS-5940 | |
| Razor blades | ThermoFisher | 12-640 | |
| Pasteur pipettes | ThermoFisher | 1367820C | |
| Nanoject III | Drummond | 3-000-207 | |
| Manual Manipulator w/ stand | World Precision Instruments | M3301R/M10 | |
| 5 ml round bottom plastic tubes | ThermoFisher | 149591A | |
| 60 mm Petri dishes | ThermoFisher | 12556001 | |
| 100 mm Petri dishes | ThermoFisher | 12565100 | |
| Pronase | Sigma | 10165921001 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher | 16140063 | |
| DNase I | Sigma | 4716728001 | |
| Celltrics 50um filters | Sysmex | 04-0042327 | |
| Trypan blue | ThermoFisher | 15-250-061 | |
| Hemocytometer | ThermoFisher | 02-671-6 |
References
- Bozzi, Y., Casarosa, S., Caleo, M. Epilepsy as a neurodevelopmental disorder. Front Psychiatry. 3 (19), (2012).
- Takano, T. Interneuron Dysfunction in Syndromic Autism: Recent Advances. Dev Neurosci. , (2015).
- Inan, M., Petros, T. J., Anderson, S. A. Losing your inhibition: linking cortical GABAergic interneurons to schizophrenia. Neurobiol Dis. 53, 36-48 (2013).
- Batista-Brito, R., Machold, R., Klein, C., Fishell, G. Gene expression in cortical interneuron precursors is prescient of their mature function. Cereb Cortex. 18 (10), 2306-2317 (2008).
- Flames, N., et al. Delineation of multiple subpallial progenitor domains by the combinatorial expression of transcriptional codes. J Neurosci. 27 (36), 9682-9695 (2007).
- Wonders, C. P., et al. A spatial bias for the origins of interneuron subgroups within the medial ganglionic eminence. Dev Biol. 314 (1), 127-136 (2008).
- Inan, M., Welagen, J., Anderson, S. A. Spatial and temporal bias in the mitotic origins of somatostatin- and parvalbumin-expressing interneuron subgroups and the chandelier subtype in the medial ganglionic eminence. Cereb Cortex. 22 (4), 820-827 (2012).
- Petros, T. J., Bultje, R. S., Ross, M. E., Fishell, G., Anderson, S. A. Apical versus Basal Neurogenesis Directs Cortical Interneuron Subclass Fate. Cell Rep. 13 (6), 1090-1095 (2015).
- Taniguchi, H., Lu, J., Huang, Z. J. The spatial and temporal origin of chandelier cells in mouse neocortex. Science. 339 (6115), 70-74 (2013).
- Bandler, R. C., Mayer, C., Fishell, G. Cortical interneuron specification: the juncture of genes, time and geometry. Curr Opin Neurobiol. 42, 17-24 (2017).
- Kepecs, A., Fishell, G. Interneuron cell types are fit to function. Nature. 505 (7483), 318-326 (2014).
- Mayer, C., et al. Developmental diversification of cortical inhibitory interneurons. Nature. 555 (7697), 457-462 (2018).
- Mi, D., et al. Early emergence of cortical interneuron diversity in the mouse embryo. Science. 360 (6384), 81-85 (2018).
- Alvarez-Dolado, M., et al. Cortical inhibition modified by embryonic neural precursors grafted into the postnatal brain. J Neurosci. 26 (28), 7380-7389 (2006).
- Baraban, S. C., et al. Reduction of seizures by transplantation of cortical GABAergic interneuron precursors into Kv1.1 mutant mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (36), 15472-15477 (2009).
- De la Cruz, E., et al. Interneuron progenitors attenuate the power of acute focal ictal discharges. Neurotherapeutics. 8 (4), 763-773 (2011).
- Gilani, A. I., et al. Interneuron precursor transplants in adult hippocampus reverse psychosis-relevant features in a mouse model of hippocampal disinhibition. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (20), 7450-7455 (2014).
- Larimer, P., et al. Caudal Ganglionic Eminence Precursor Transplants Disperse and Integrate as Lineage-Specific Interneurons but Do Not Induce Cortical Plasticity. Cell Rep. 16 (5), 1391-1404 (2016).
- Martinez-Cerdeno, V., et al. Embryonic MGE precursor cells grafted into adult rat striatum integrate and ameliorate motor symptoms in 6-OHDA-lesioned rats. Cell Stem Cell. 6 (3), 238-250 (2010).
- Quattrocolo, G., Fishell, G., Petros, T. J. Heterotopic Transplantations Reveal Environmental Influences on Interneuron Diversity and Maturation. Cell Rep. 21 (3), 721-731 (2017).
- Xu, Q., Tam, M., Anderson, S. A. Fate mapping Nkx2.1-lineage cells in the mouse telencephalon. J Comp Neurol. 506 (1), 16-29 (2008).
- Thompson, L., Bjorklund, A. Survival, differentiation, and connectivity of ventral mesencephalic dopamine neurons following transplantation. Prog Brain Res. 200, 61-95 (2012).
- Liang, Y., Agren, L., Lyczek, A., Walczak, P., Bulte, J. W. Neural progenitor cell survival in mouse brain can be improved by co-transplantation of helper cells expressing bFGF under doxycycline control. Exp Neurol. 247, 73-79 (2013).
